N- glukanlardir Raphanus sativus çeşitlerin kullanarak PNGase h+ Analizi
Summary
Biz hazırlık ve N– glukanlardir turp (Raphanus sativus) farklı çeşitlerin üzerinden analizi için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Onlar cross-reactive, Anti kışkırtan bağışıklık yanıtı potansiyel bir kaynak olarak son yıllarda büyük ilgi, bitkilerin karbonhidrat moieties aldık. Buna ek olarak, karbonhidrat yapıları da bitki metabolizmasında kritik bir rol oynamaktadır. Burada, hazırlama ve N– glukanlardir turp (Raphanus sativus) farklı çeşitlerin üzerinden bir N– glycanase özel bitki kaynaklı karbonhidrat yapılarının sürülmesi kullanarak analiz için basit ve hızlı bir yöntem mevcut. Bunu başarmak için ham trichloroacetic asit precipitates turp homogenates, PNGase H+ile tedavi ve 2-aminobenzamide floresan etiket olarak kullanarak etiketli. Etiketli N– glycan örnekleri daha sonra ultra performans sıvı kromatografi (UPLC) ayırma ve matris yardımlı Lazer Desorpsiyon iyonlaşma-uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi detaylı yapısal için süreyi tarafından analiz edildi değerlendirme ve N– glycan turp elde edilen yapıların göreli abundancies ölçmek için. Bu protokolü de N– glukanlardir diğer çeşitli bitki tür analizi için kullanılabilir ve daha fazla araştırma yapılması işlev ve N– glukanlardir insan sağlığı üzerindeki etkileri için yararlı olabilir.
Introduction
Önceki araştırma N– glukanlardir Alerjik yanıt-e doğru1,2 kışkırtmak immünolojik cross-reactions potansiyel bir kaynak vurgulanmış bulunmaktadır olarak N– glukanlardir tesislerinde son yıllarda artış dikkat çekiyor . N– glukanlardir bitki glikoproteinlerin üzerinde katalitik aktivitesi3,4, thermostability ve katlama5,6 veya hücre altı yerelleştirme etkileyebilir daha önce kanıtlanmıştır ve salgı7. Glycan yapıları ile ilgili işlevleri ilişkilendirmek için N– glukanlardir ilk glikoproteinlerin kimyasal veya enzimatik yayımlanması gerekir. N– ve O– glukanlardir serbest bırakmak için klasik kimyasal yöntem β-hangi azaltma borhidrür alditol8verim ile alkali örnek tedavi eşlik eder, ortadan kaldırılmasıdır. Ancak, bu yordamı bir fluorophore ile etiketleme önler ve yaşam üniteleri önemli çürüme azaltmak glycan yapısı sonundan itibaren neden olur. Kimyasal deglycosylation amonyum hidroksit/karbonat tedavisine göre de yaygın olarak kullanılan alternatif yöntem9‘ dur. Bu kimyasal ürün yöntemlerin hiçbiri sağlam proteinler, aynı kitle aralıkta etiketlenmemiş glycan havuzları peptid parçaları müdahale olmadan kitle spektrometrik analizi sağlayan alçaltır. Ancak, bu yöntemlerin bir dezavantajı artan bozulma α1, 3-fucosylated N– glukanlardir, ortak bir karbonhidrat yapısı bitkiler10içinde bulunan oranıdır. Alternatif olarak, peptid kullanarak tekrar tekrar enzimatik yayın yöntemleri:N– glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) de yaygın olarak uygulanan. Rekombinant PNGase F (dan Flavobacterium meningosepticum) en yaygın seçim ve N– glukanlardir, taşıyan bir çekirdek α1, 3 fucose11,12yapıları dışında her türlü yayın izin verir. Bu nedenle, PNGase A (badem tohumları izole) genellikle bitki N– glukanlardir13analizi için kullanılır. Ancak, bu enzim deglycosylates sadece proteolytically elde edilen glycopeptides ve deglycosylate yerel glikoproteinlerin14‘ e değiştiremiyor. Bu nedenle, bir çok adımlı örnek testleri daha geniş glukanlardir, özellikle de düşük bereket15kaybolmasına neden analiz daha önce gereklidir. Yöntem genel amacı basit ve sağlam bir şekilde etiketleme floresans ve N– glycan sürümü için en iyi duruma getirilmiş bir iş akışı sunmaktır. PNGase H+, geçtiğimiz günlerde Terriglobus çevresi keşfedilmiştir ve recombinantly E. coliifade edilebilir, N– glukanlardir doğrudan doğruya–dan içinde asidik protein iskele hidrolize temel mantığı olduğunu koşullar16. PNGase H+ üzerinde alternatif yöntemler kullanarak bir anahtar tepki arabellekleri17,18değiştirmeden floresan etiketleme tepkiler aynı tepki tüp içinde gerçekleştirilebilir bir avantajdır. Bu yöntem basit hazırlık koşulları ve yüksek düşük-bereket oligosakkaritler kurtarılması N– glukanlardir analizinde değerli bir araç olun. Bu iletişim kuralı, N– glukanlardir çeşitli bitki türleri üzerinden analizi için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz burada sundu iletişim kuralı turp çeşitli çeşitlerin N– glycan profilleri karşılaştırmasını sağlar. Varolan iletişim kurallarına göre bu yöntemin önemli bir avantaj enzimatik serbest bırakmak-in N– glukanlardir ve derivatization reaksiyon 2-AB ile arasında hiçbir arabellek değişiklikleri gerekli olmasıdır. N– glukanlardir tuzları kaldırmak için başarısızlık olarak SPE sütun kullanarak arıtma, bu yordamın en önemli adımdır veya diğer kirleri tepki karı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen Çin doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (sayı 31471703, A0201300537 ve 31671854 J.V. ve ll, G.Y. için sayı 31470435 izni grant) ve 100 yabancı yeteneklerini planı (grant sayıya JSB2014012 J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
References
- Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
- Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
- Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
- Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
- Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
- Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
- Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
- Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
- Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
- Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
- Fan, J. -. Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
- Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
- Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
- Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
- Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).
- Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
- Wang, T., Hu, X. -. C., Cai, Z. -. P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
- Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).
