Summary
Мы опишем простой и быстрый метод для подготовки и анализа N- гликанов из различных сортов редиса (редька sativus).
Abstract
В последние годы постановление углевод растений получили значительное внимание, поскольку они являются потенциальным источником cross-reactive, провоцируя специальные иммунных реакций. Кроме того структуры углеводов также играют критически важную роль в метаболизме растений. Здесь мы представляем простой и быстрый метод для подготовки и анализа N- гликанов из различных сортов редиса (редька sativus) с использованием N- glycanase, специфичных для выпуска растительного углеводов структур. Для достижения этой цели, сырой трихлоруксусной кислоты преципитаты редька гомогенатах были относиться с PNGase H+и помечены с помощью 2-aminobenzamide как флуоресцентные метки. Приклеенные этикетку N- glycan образцы впоследствии были проанализированы ультра производительность разделения жидкостной хроматографии (UPLC) и при содействии матрицы лазерной десорбции ионизации время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии для подробного структурных оценки и количественного анализа относительной abundancies редиска производные N- glycan структур. Этот протокол может также использоваться для анализа N- гликанов из различных других видов растений и может быть полезной для дальнейшего расследования функции и N- гликанов воздействия на здоровье человека.
Introduction
N- гликанов в растениях привлекли повышенное внимание в последние годы, как предыдущие исследования высветил N- гликанов как потенциальный источник иммунологические перекрестные, которые могут вызвать аллергические реакции1,2 . Ранее было продемонстрировано, что N- гликанов на завод гликопротеинов может повлиять на каталитическую активность3,4, термостойкость и складной5,6 или субцеллюлярные локализации и секреция7. Для того, чтобы соотнести glycan структур с их соответствующих функций, N- гликанов сначала должен быть освобожден из гликопротеинов, химически или ферментативно. Классический химический метод для освобождения как N- и O- гликанов — β-ликвидация, в котором щелочной образца лечение сопровождается снижением с боргидрид приносить alditol8. Однако эта процедура не исключает маркировки с Флюорофор и вызывает значительный упадок моносахаридов единиц от снижения конца glycan структуры. Химических deglycosylation, основанный на Гидроксид аммония/карбонат лечения является также широко используется альтернативный метод9. Ни один из этих методов химического релиз деградирует интакт белками, который позволяет масс-спектрометрических анализ немеченого glycan бассейнов без вмешательства терпеноидные фрагменты из того же диапазона массы. Однако один недостаток этих методов встречается увеличение скорости разложения α1, N3-fucosylated - гликанов, общую структуру углеводов в растениях10. Кроме того, ферментативные релиз методы, используя пептиды:N- glycanases (PNGases, ЕС 3.5.1.52) также широко применяются. Рекомбинантных PNGase F (от флавобактерии meningosepticum) является наиболее распространенным вариантом и разрешает освобождение всех типов N- гликанов, за исключением структуры с учетом основных α1, 3 Фукоза11,12. Таким образом PNGase A (изолированные от миндаля семена) обычно используется для анализа растений N- гликанов13. Однако, этот фермент deglycosylates только proteolytically производные гликопептиды и не может deglycosylate родной гликопротеинов14. Следовательно перед дальнейшего анализа, который приводит к гибели гликаны, особенно низкой изобилие15требуется проработка многоступенчатой выборки. Общая цель метода – представить Оптимизированный рабочий процесс для N- glycan выпуска и флуоресценции маркировки на основе простой и надежный. Обоснование этого заключается PNGase H+, который был недавно обнаружен в Terriglobus roseus и recombinantly может быть выражен в E. coli, можно гидролизуют N- гликанов непосредственно из белка лески в кислой условия16. Ключевым преимуществом использования PNGase H+ над альтернативными методами является, что люминесцентные маркировки реакции может быть выполнена в том же реакция трубе без изменения реакции буферов17,18. Простая подготовка условий и высокое извлечение низкой изобилие олигосахариды делают этот метод является ценным инструментом в анализе N- гликанов. Этот протокол предназначен для анализа N- гликанов из различных видов растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. образец коллекции
- Приобрести различные сорта свежего хрена (редька sativus L.).
2. изоляция белка из редиса
- Однородный примерно 100 г свежего хрена с кухня блендер для 10 мин.
- Передача навозной жижи на тюбик 50 мл центрифуги и центрифуги на 14 000 × g при 4 ° C в течение 20 мин для удаления нерастворимых материалов.
- Передача супернатант тщательно в новой 50 мл пластиковых пробирок и добавить равное количество 2 М раствора трихлоруксусной кислоты (ТСА).
Примечание: Добавление ГТС будет выпадать в осадок белков растворимые (glyco). - Центрифуга на 14 000 × g при 4 ° C на 30 мин и удалить супернатант из гранулированного (glyco) белки.
- Помойте лепешка с 20 мл деионизированной воды и центрифуги на 14 000 × g при 4 ° C за 5 мин для удаления растворимых олигосахаридов и полисахариды.
- Повторите шаг 2,5. четыре раза.
- Вновь приостановите гранулы в 1 мл деионизированной воды и передачи свежие 1,5 мл пластиковых пробирок.
3. Подготовка N- гликанов
- Mix 50 мкл раствора белка из шага 2.7. (равный 5 г свежего хрена) с 0,2 му рекомбинантных ч PNGase+ в 10 мм уксусной кислоты.
- Инкубируйте реакционной смеси при 37 ° C в течение 12 ч. После инкубации центрифуги на 14 000 × g 5 мин для удаления дополнительных белков и ферментов.
- Супернатант передать свежие 1,5 мл пластиковых пробирок.
4. Очистка N- гликанов
- Подготовить столбце твердофазный извлечения (SPE), чтобы обогатить N- гликанов и удаления солей и других примесей из реакционной смеси, увеличения избирательности fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) маркировки агент для N- glycan деривации.
- Добавьте 3 мл деионизованной воды промойте колонку.
- Добавьте 3 мл 80% Ацетонитрил раствора, содержащего trifluoroacetic кислоту (TFA, 0.1% v/v) для активного столбце SPE.
- Добавьте 3 мл деионизированной воды, чтобы сбалансировать столбце SPE.
- Передать образец из шага 3.3 на столбец и отбросить потока через.
- Добавьте 1,5 мл деионизованной воды промойте колонку и отбросить потока через.
- Элюировать выпущенный N- гликанов из столбца с помощью 1,5 мл водного раствора 20% ацетонитриле, содержащие 0,1% TFA (v/v) в 2-мл пробирку центрифуги.
- Удаление растворителя центробежные испарения при комнатной температуре. Испарится до тех пор, пока образец должна быть абсолютно сухой.
5. флуоресценции деривации N- гликанов
- Готовим 1 мл раствора 2-AB, состоящий из 35 мм 2-AB и 0,1 М натрия цианоборогидрида в этанного сульфоксида/уксусной кислоты раствор (7:3 v/v).
- Добавьте 5 мкл раствора 2-AB в высушенных образцов (шаг 4.5.), полученных от шести различных редис. Вихревой каждый образец до тех пор, пока полностью распущены.
- Инкубировать смесь для 2 h на 65 ° C.
- Остудите до комнатной температуры образца за 5 мин и добавить 5 мкл деионизированной воды и 40 мкл ацетонитриле. Центрифуга трубы в 14.000 x g на 3 мин.
- Передача 48 мкл от супернатант в 300 мкл высокого подъема ВЭЖХ флакон. Храните derivatized N- glycan образцов при-20 ° C до одного месяца.
6. HILIC-UPLC профилирование N- гликанов
- Анализ образцов, с использованием стандартной системы UPLC, подключенных к Интернет флуоресценции detectorset на длинах волн возбуждения/выбросов, 330 Нм/420 Нм соответственно.
- Используйте гидрофобные взаимодействия жидкостной хроматографии (HILIC)-UPLC glycan столбец столбец при температуре 60 ° C для анализа.
- Подготовить растворителей A путем разбавления 50 мл Стоковый раствор (1 M аммония Формиат раствор, рН 4,5) с 950 мл жидкого хроматография масс-спектрометрия (LCMS)-класс воды. Стоковый раствор приготовляют следующим образом:
- Добавление 43 мл муравьиной кислоты до 700 мл LCMS-класса H2O.
- Отрегулируйте pH 4.5 прикапывают добавлением раствора (25% w/w) водного раствора аммиака.
- Передать Измерительный цилиндр растворителя и заполнить до 1000 мл с LCMS-класса H2O. магазин на 4-6 ° C на срок до 3 месяцев.
- Использовать LCMS-класс Ацетонитрил в качестве растворителя б.
- Отделяйте N- гликанов элюции следующих градиента:
- Начните с добавления 95% растворителей B в жидкостной A. набор скорость потока в 0,5 мл/мин от 0 до 44,5 мин.
- 0 мин 6 мин постепенно уменьшаться доля растворителя B с линейного градиента to78%.
- От 6 мин до 44,5 мин постепенно уменьшаться доля растворителя B с линейным градиентом до 55,9%.
- 44.5 мин 46.5 мин быстро уменьшить количество растворителя B с линейным градиентом от 55,9% до 0% 0% на 2 мин и удерживайте инициировать Стиральная столбца. Уменьшите скорость потока до 0,25 мл/мин от 44,5-55 мин.
- Промойте колонку далее, увеличивая растворителей B до 95% от 48,5 мин до 50,5 мин и удерживайте на 95% для 4,5 мин.
- Заново сбалансировать столбец для стартовых условий 95% растворителя B в 0,5 мл/мин от 50,5 до 57 мин.
- Inject 45 мкл пример в системе UPLC.
- Элюировать N- гликанов, UPLC с временем удержания между 15 и 40 мин.
- Собирать каждый наблюдаемых фракция пик UPLC, используя 2 мл пробирок и сухой образцы центробежные испарением.
- Придать примерно 1 пмоль 2-AB помечены декстрана стандарт (2−20 глюкозы единиц) для калибровки завод -N- glycan профилирования и назначить их элюции раз в стандартизированных Глюкоза единицы.
7. MALDI-TOF масс-Спектральный анализ
- Распустить образцы из шага 6,8 в 5 мкл LCMS-класс воды. Смешайте 1 мкл пример решения и 1 мкл 6-аза-2-thiothymine (ATT) раствора (0,3% w/v в водный ацетонитриле 70% v/v), и дозатор смеси на прободержатели MALDI-TOF.
- Анализ образцов, с помощью инструмента MALDI-TOF масс-спектрометр в положительный ион режим, нажав кнопку Пуск .
- Анализ массового спектры с помощью сопутствующего программного обеспечения анализа MALDI-TOF-MS.
- Интерпретируйте спектры с использованием программного обеспечения интерпретации glycan открытым исходным кодом19. Установите параметры поиска для маркировки, 2-AB [M + Na]+и установите для параметра точности 2,0 ПДР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 показывает Схематический обзор описанных протокола, в том числе изоляции (glyco-) белков из редиса, подготовка N- гликанов, UPLC анализ и MALDI-TOF-MS анализ этих компонентов. Рисунок 2 показывает представитель UPLC хроматограммы дериватные N- гликанов сортов анализируемого редиса. Рисунок 3 показывает полученные результаты дериватные 2AB N- glycan структур с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии. На рисунке 4 показана количественный состав N- гликанов от каждого сорта редиса.
Рисунок 1 : Схематичный обзор метода анализа описанных для N- гликанов освобожден из редиса гликопротеинов. Этот метод включает в себя подготовку (glyco-) белков и N- гликанов, UPLC профилирования и анализа MALDI-TOF-MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : N Профили - glycan 2-AB помечены N - гликанов. N- гликанов изолированы от Красного редиса, зеленая редька, редиска gegeol, дайкон, вишневый редиса и арбузы редис. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Массовые спектрометрический анализ N - glycan образцы, изолированные, HILIC-UPLC. N- гликанов в каждом спектрограммы, собираемые же пик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Количественный состав N - гликанов от каждого сорта редиса. Размеров кругов и полумесяцев представляют собой относительное обилие 2AB-меченых N- гликанов из редиса гликопротеинов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, который мы представили здесь позволяет Сравнение профилей - glycan Nразличных сортов редиса. Значительное преимущество этого метода по сравнению с существующими протоколами является, что изменения буфера между ферментативные выпуск N- гликанов и деривации реакции с 2-AB не требуются. Наиболее важным этапом этой процедуры является очистка N- гликанов с помощью столбца SPE, как отказ удалить соли или других примесей в реакционной смеси может негативно сказаться на эффективности деривации флуоресценции. Метод, как здесь представлены только позволяет оценки относительного обилия различных N -гликанов; Абсолютная количественной оценки потребует Добавление внутреннего стандарта (например, maltopentose) в шаге 2.1.
Кроме того агент деривации используются здесь (2-AB) могут быть легко изменены с помощью 2-aminopyridine (2-AP) или других агентов деривации. Полученные производные N- glycan из шага 5.3 также могут разделяться размер гель-проникающей хроматографии (SEC), сильные или слабые анион обмена хроматографии (SAX или воск), или методами ВЭЖХ реверс фаза (хотя скорее всего с нижней резолюции). Для дальнейшей проверки структур N- гликанов, последовательный exoglycosidase лечения может использоваться после шага 5.3 охарактеризовать структуру N- гликанов с более подробной информацией. Наконец, могут быть проанализированы образцы из шага 6.8 дальнейшее с помощью MALDI-TOF-MSn-на основе методов фрагментации. Возможные будущие применения нашего протокола включают изучение функции и здоровья последствий N- гликанов из редьки или других видов растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа частично поддержали фонд естественных наук Китая (Грант номера 31471703, A0201300537 и 31671854 СП и л.л., предоставить г.я. номер 31470435) и 100 зарубежных талантов план (Грант номер JSB2014012 СП).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
References
- Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
- Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
- Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
- Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
- Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
- Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
- Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
- Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
- Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
- Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
- Fan, J. -Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
- Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
- Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
- Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
- Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).
- Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
- Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
- Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).
