Summary
Vi beskriver en enkel och snabb metod för förberedelserna och analysen av N- glycans från olika sorter av rädisa (Raphanus sativus).
Abstract
Under de senaste åren, har de kolhydrat beståndsdelarna av växter fått stor uppmärksamhet, eftersom de är en potentiell källa till korsa-reactive, allergi, provocerande immunsvar. I tillägg, spelar kolhydrat strukturer också en avgörande roll i växten metabolism. Här presenterar vi en enkel och snabb metod för att förbereda och analysera N- glycans från olika sorter av rädisa (Raphanus sativus) använder en N- glycanase specifika för frisläppandet av vegetabiliska kolhydrater strukturer. För att uppnå detta, rå triklorättiksyra fällningar av rättika homogenates behandlades med PNGase H+, och märkt med 2-aminobenzamide som en fluorescerande tagg. De märkta N- glycan proverna analyserades därefter av ultra-prestanda vätskekromatografi (UPLC) separation och matrix-assisted laser desorption jonisering-tid för flygning (MALDI-TOF) masspektrometri för en detaljerad struktur utvärdering och kvantifiera relativa abundancies Rädisa-derived N- glycan strukturer. Detta protokoll kan också användas för analys av N- glycans från olika andra växtarter, och kan vara användbart för fortsatta undersökningar av funktionen och N- glycans effekter på människors hälsa.
Introduction
N- glycans i växter har uppmärksammat ökat under de senaste åren som tidigare forskning har visat N- glycans som en potentiell källa till immunologiska korsreaktioner som kan framkalla allergiska reaktioner1,2 . Det har tidigare visats att N- glycans på anläggningen glykoproteiner kan påverka katalytisk aktivitet3,4, termostabiliteten och fällbara5,6 eller subcellulär lokalisering och sekretion7. För att korrelera de glycan strukturerna med deras respektive funktioner, måste N- glycans först släppas från glykoproteiner antingen kemiskt eller enzymatiskt. Den klassiska kemiska metoden för att frigöra både N- och O- glycans är β-elimination, där alkaliska prov behandling åtföljs av med natriumborhydrid ge en alditol8. Dock detta förfarande utgör hinder för märkning med en fluorophore och orsakar betydande förfalla av monosackarid enheter från reducerande slutet av glycan struktur. Kemiska deglycosylation baserat på ammoniumhydroxid/karbonat behandling är också en vanligt förekommande alternativ metod9. Ingen av dessa kemiska release metoder försämrar intakta proteiner, vilket gör massa spektrometriska analys av omärkta glycan pooler utan inblandning av peptidfragment i samma massa. En nackdel med dessa metoder är dock den ökade nedbrytningshastigheten av α1, 3-fucosylated N- glycans, en gemensam kolhydrat struktur finns i växter10. Alternativt, enzymatisk release metoder med peptid:N- glycanases (PNGases, EG 3.5.1.52) är också i stor utsträckning. Rekombinant PNGase F (från Flavobacterium meningosepticum) är det vanligaste valet och tillåter utsläpp av alla typer av N- glycans, utom de strukturer som bär en core α1, 3 fukos11,12. Därför används vanligtvis PNGase A (isolerad från mandel frön) för analys av växten N- glycans13. Dock detta enzym deglycosylates endast proteolytically-derived glykopeptider, och förmår deglycosylate infödda glykoproteiner14. Därför krävs en flerstegs prov workup innan ytterligare analys, som orsakar omfattande förlust av glycans, särskilt de låga överflöd15. Det övergripande målet med metoden är att presentera ett optimerat arbetsflöde för N- glycan release och fluorescens märkning på en enkel och robust sätt. Den underliggande tanken är att PNGase H+, som nyligen upptäcktes i Terriglobus roseus och recombinantly kan uttryckas i E. coli, kan hydrolysera N- glycans direkt från protein ställningen i sura villkorar16. En viktig fördel med att använda PNGase H+ över alternativa metoder är att fluorescerande märkning reaktioner kan utföras i samma reaktionsröret utan att ändra den reaktion buffertar17,18. Enkel bearbetning villkor och hög återvinning av låg-överflöd oligosackarider gör denna metod ett värdefullt verktyg i analysen av N- glycans. Detta protokoll är lämplig för analys av N- glycans från olika växtarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. provtagning
- Köpa olika sorter av färsk rättika (Raphanus sativus L.).
2. isolering av Protein från rädisa
- Homogenisera ca 100 g färska rädisor med ett kök mixer i 10 min.
- Överföring slammet till en 50 mL centrifugrör och centrifugera vid 14.000 × g vid 4 ° C i 20 min att ta bort olösligt material.
- Överför supernatanten försiktigt i en ny 50 mL centrifugrör och tillsätt en motsvarande volym av 2 M triklorättiksyra (TCA) lösning.
Obs: Lägga till TCA kommer fällningen lösliga (glyco) proteiner. - Centrifugera 14.000 × g vid 4 ° C i 30 min och ta bort supernatanten från pelleterat (glyco) proteinerna.
- Tvätta pelleten med 20 mL avjoniserat vatten och centrifugera vid 14.000 × g vid 4 ° C för 5 min att ta bort lösliga oligosackarider och polysackarider.
- Upprepa steg 2.5. fyra gånger.
- Återsuspendering pellets i 1 mL avjoniserat vatten och överföring till en fräsch 1,5 mL centrifugrör.
3. beredning av N- Glycans
- Blanda 50 µL protein lösning från steg 2,7. (motsvarar 5 g färsk rättika) med 0,2 ME rekombinant PNGase H+ i 10 mM ättiksyra.
- Inkubera vid 37 ° C i 12 h reaktionsblandningen. Efter inkubering, Centrifugera 14.000 × g för 5 min att ta bort extra protein och enzym.
- Överför supernatanten till ett färskt 1,5 mL centrifugrör.
4. rening av N- Glycans
- Förbereda den fasta fas extraktion (SPE) kolumnen att berika den N- glycans och ta bort salter och andra orenheter från reaktionsblandningen, öka selektivitet fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) märkning agenten för N- glycan derivatisering.
- Tillsätt 3 mL avjoniserat vatten för att tvätta kolonnen.
- Tillsätt 3 mL 80 procent acetonitril lösning innehållande trifluorättiksyra (TFA, 0,1% v/v) till aktiv SPE-kolonnen.
- Tillsätt 3 mL avjoniserat vatten temperera SPE-kolonnen.
- Överför provet från steg 3.3 på kolumnen och kassera genomflöde.
- Tillsätt 1,5 mL avjoniserat vatten för att tvätta kolonnen och kassera genomströmmande.
- Eluera de utgivna N- glycans från kolumnen med 1,5 mL 20% acetonitril vattenlösning, innehållande 0,1% TFA (v/v) i en 2 mL centrifugrör.
- Ta bort lösningsmedlet genom centrifugal avdunstning vid rumstemperatur. Indunsta tills provet är helt torr.
5. fluorescens derivatisering av N- Glycans
- Laga 1 mL 2-AB lösning, bestående av 35 mM 2-AB och 0,1 M natrium cyanoborohydride i dimetyl sulfoxid/ättiksyra syralösning (7:3, v/v).
- Tillsätt 5 µL 2-AB lösning på de torkade proverna (steg 4.5.) härrör från sex olika rädisor. Vortex varje prov tills helt upplöst.
- Inkubera blandningen för 2 h vid 65 ° C.
- Låt provet svalna ner till rumstemperatur under 5 minuter, och tillsätt 5 µL avjoniserat vatten och 40 µL av acetonitril. Centrifugera rören vid 14 000 x g i 3 min.
- Överföra 48 µL från supernatanten i en 300 µL hög-recovery HPLC injektionsflaska. Lagra derivatized N- glycan proverna vid-20 ° C i upp till en månad.
6. HILIC-UPLC profilering av N- glycans
- Analysera proverna med ett standardsystem för UPLC, ansluten till en online fluorescens detectorset på excitation/utsläpp våglängder av 330 nm/420 nm, respektive.
- Använda en hydrofob interaktion vätskekromatografi (HILIC)-UPLC glycan kolumn en kolumn temperatur på 60 ° C för analys.
- Förbereda lösningsmedel A genom att späda ut 50 mL av stamlösningen (1 M ammonium formate lösning, pH 4,5) med 950 mL liquid chromatography-masspektrometri (LCMS)-grade vatten. Förbereda stamlösning enligt följande:
- Tillsätt 43 mL myrsyra till 700 mL LCMS-grade H2O.
- Justera pH till 4,5 genom droppvis tillsätta aqueous ammoniaklösning (25% w/w).
- Överför vätskan till en mätcylinder och fyll till 1000 mL med LCMS-grade H2O.-butiken vid 4-6 ° C i upp till 3 månader.
- Använda LCMS-grade acetonitril som lösningsmedel B.
- Separat N- glycans med den följande gradient elueringen:
- Börja med att lägga till 95% lösningsmedel b in lösningsmedel A. flödet på 0,5 mL/min från 0 till 44,5 min.
- Från 0 min-6 min, gradvis minska andelen lösningsmedel B med en linjär gradient to78%.
- Från 6 min till 44,5 min, gradvis minska andelen lösningsmedel B med en linjär övertoning till 55,9%.
- Från 44,5 min till 46,5 min, snabbt minska andelen lösningsmedel B med en linjär övertoning från 55,9% till 0% och hålla på 0% i 2 min, och initiera tvättning av kolumnen. Minska flödet till 0,25 mL/min från 44,5 till 55 min.
- Tvätta kolonnen ytterligare genom att öka lösningsmedel B till 95% från 48,5 min till 50,5 min och hålla på 95% för 4,5 min.
- Åter jämvikta kolonnen start villkor 95% lösningsmedel B på 0,5 mL/min från 50,5 till 57 min.
- Injicera 45 µL av provet i det UPLC systemet.
- Eluera de N- glycans av UPLC med retentionstiderna mellan 15 och 40 min.
- Samla varje observerad UPLC peak bråk med 2 mL centrifugrör och torka provexemplaren av centrifugal avdunstning.
- Injicera cirka 1 pmol 2-AB märkt dextran standard (2−20 glukos enheter) Kalibrera växt -N- glycan profilering och tilldela sin eluering gånger i standardiserade glukos enheter.
7. MALDI-TOF MS analys
- Lös upp proverna från steg 6,8 i 5 µL av LCMS-grade vatten. Blanda 1 µL av provlösningen och 1 µL 6-aza-2-thiothymine (ATT) lösning (0.3% w/v i 70% v/v vattenlösning acetonitril) och pipett blandningen på MALDI-TOF prov transportören.
- Analysera proverna med ett MALDI-TOF masspektrometer instrument i positiv Jon läge genom att trycka på knappen Start .
- Analysera masspektra med hjälp av den medföljande MALDI-TOF-MS analys programvaran.
- Tolka spektra med en öppen källkod glycan tolkning programvara19. Ange sökparametrar för 2-AB märkning, [M + Na]+, och ange parametern noggrannhet 2.0 da.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en schematisk översikt av den beskrivna protokoll, inklusive isolering av (glyco-) proteiner från rädisa, beredning av N- glycans, den UPLC analysen och MALDI-TOF-MS analys av dessa komponenter. Figur 2 visar representativa UPLC kromatogram av derivatized N- glycans av de analyserade Rädisa sorterna. Figur 3 visar de erhållna resultaten 2AB-derivatized N- glycan strukturer använda MALDI-TOF-masspektometri. Figur 4 visar kvantitativa sammansättningen av N- glycans från varje Rädisa sorten.
Figur 1 : Schematisk översikt över analysmetoden som beskrivs för N- glycans frigörs från Rädisa glykoproteiner. Metoden omfattar utarbetande av (glyco-) proteiner och N- glycans, UPLC profilering och MALDI-TOF-MS analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : N -glycan profiler av 2-AB märkt N - glycans. N- glycans är isolerade från röda rädisor, gröna rättika, gegeol rädisa, rättika, cherry Rädisa och vattenmelon Rädisa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Massa spektrometriska analys av N - glycan prov isolerat av HILIC-UPLC. N- glycans i varje spektrogram samlas in av samma topp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Kvantitativ sammansättning av N - glycans från varje Rädisa cultivar. Storleken på cirklar och halvmånar representerar det relativa överflödet av den 2AB-märkta N- glycans från Rädisa glykoproteiner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet har vi presenterat här tillåter jämförelse av N- glycan profiler för olika sorter av Rädisa. En betydande fördel med denna metod jämfört med befintliga protokoll är att ingen buffert förändringar mellan enzymatisk frisläppandet av N- glycans och derivatisering reaktionen med 2-AB krävs. Det mest kritiska steget i proceduren är rening av N- glycans hjälp av kolumnen SPE, som oförmåga att ta bort salter eller andra föroreningar i reaktionsblandningen kan negativt påverka fluorescensen derivatisering effektivitet. Metoden medger som presenteras här endast bedömning av de relativa förekomsten av olika N -glycans; absolut kvantifiering skulle kräva tillägg av intern standard (t.ex. maltopentose) i steg 2.1.
Alternativt, derivatisering agenten används här (2-AB) kan enkelt ändras med hjälp av 2-aminopyridin (2-AP) eller andra derivatisering agenter. De erhållna N- glycan derivat från steg 5.3 kan separeras också genom storlek utslagning kromatografi (SEC), stark eller svag anjon utbyta kromatografi (SAX eller vax) eller omvänd-phase HPLC metoder (även om det sannolikt med sämre upplösning). För att ytterligare kontrollera strukturerar av N- glycans, kan sekventiell exoglycosidase behandlingar användas efter steg 5.3 för att karakterisera strukturen för den N- glycans med mer detaljer. Slutligen, proverna från steg 6,8 kunde analyseras ytterligare med hjälp av MALDI-TOF-MSn-fragmentering metoder. Möjliga framtida tillämpningar av våra protokoll inkluderar undersöka funktion och hälsa effekterna av N- glycans från rädisor eller andra växtarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av den naturliga vetenskapen Foundation i Kina (bevilja nummer 31471703, A0201300537 och 31671854 till J.V. och L.L., bevilja nummer 31470435 G.Y.), och 100 utländska talanger Plan (licensnummer JSB2014012 till J.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
References
- Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
- Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
- Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
- Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
- Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
- Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
- Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
- Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
- Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
- Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
- Fan, J. -Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
- Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
- Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
- Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
- Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).
- Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
- Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
- Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).
