Imagem de tomografia computadorizada multimodal bioluminescentes e emissão positrônica Tomography/computacional de mieloma múltiplo Xenografts de medula óssea em camundongos NOG
Summary
Aqui usamos bioluminescentes, raio-x e positron-emissão calculado a tomografia computadorizada/tomografia computadorizada de imagem para estudar a atividade como a inibição de mTOR impactos tumores de medula óssea-incorporada do mieloma múltiplo em um modelo de transplante. Isto permite análises fisiologicamente relevantes, não-invasivo e multimodais do efeito antimieloma de terapias direcionamento incorporada a medula óssea mieloma tumores na vivo.
Abstract
Mieloma múltiplo (MM) tumores engraft na medula óssea (BM) e sua sobrevivência e progressão dependem de complexas interações moleculares e celulares que existem dentro este microambiente. Ainda o microambiente BM não pode ser facilmente replicado em vitro, que potencialmente limita a relevância fisiológica de muitos modelos experimentais in vitro e ex vivo . Esses problemas podem ser superados utilizando um modelo de enxerto heterólogo em qual luciferase (LUC)-células transfectadas de 8226 MM serão especificamente engraft do esqueleto de rato. Quando esses ratos são dadas o substrato apropriado, D-luciferina, os efeitos da terapia no crescimento do tumor e sobrevivência podem ser analisados medindo as alterações nas imagens bioluminescentes (BLI) produzido pela tumores em vivo. Este dados BLI combinado com análise de tomografia computadorizada (PET/CT) tomografia de emissão positrônica/computacional usando o marcador metabólico 2-deoxy – 2-(18F) fluoro-D-glicose (18F-FDG) é usado para monitorar as alterações no metabolismo do tumor ao longo do tempo. Essas plataformas de imagem permitem várias medições não-invasivas dentro o microambiente do tumor/BM.
Introduction
MM é uma doença incurável, composta de plasma maligno B-células que se infiltrar o BM e causar a destruição óssea, anemia, disfunção renal e infecção. MM faz acima de 10% – 15% de todas as malignidades hematológicas1 e é o câncer mais frequente que envolvem o esqueleto2. O desenvolvimento de MM decorre a transformação oncogênica de plasmócitos long-lived estabelecidas nos centros germinativos dos tecidos linfoides antes eventualmente de orientação para o BM3. O BM é caracterizado por nichos altamente heterogêneos; incluindo diversos e críticos componentes celulares, regiões de baixa pO2 (hipóxia), extensa vascularização, matrizes extracelulares complexas e redes de citocinas e fator de crescimento, os quais contribuem para MM tumorgenesis4. Assim, o desenvolvimento de um modelo de enxerto heterólogo MM disseminado caracterizado por tumores que são estritamente incorporados no BM seria uma ferramenta muito poderosa e clinicamente relevante para estudar MM patologia na vivo5,6. No entanto, numerosos obstáculos técnicos podem limitar a eficácia da maioria dos modelos de enxerto heterólogo, tornando-os caros e difíceis de aplicar. Isso inclui problemas associados com a enxertia de tumor consistentes e reprodutíveis dentro do nicho de BM, um tempo prolongado para o desenvolvimento do tumor e limitações na capacidade diretamente observar e medir as alterações de crescimento/sobrevivência de tumor sem a necessidade de sacrifica os ratos durante o curso do experimento7,8.
Este protocolo usa um modelo de xenoenxertos modificado que foi inicialmente desenvolvido por Miyakawa et al 9, em que um desafio (IV) por via venosa com pilhas do myeloma resulta em “disseminada” tumores que consistentemente e reproducibly engraft no BM de NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) ratos10. A visualização em situ destes tumores é conseguida pelo transfection estável de 8226 humana MM linhagem celular com um alelo LUC e serialmente, medir as mudanças no BLI produzido por estas células de tumor engrafted6. Importante, este modelo pode ser expandido para utilizar vários outras LUC-expressando humano MM linhas celulares (por exemplo, U266 e OPM2) com uma propensão similar ao engraft especificamente no esqueleto de ratos NOG. A identificação dos tumores por bioluminescente imagem dos ratos é seguida por medir a absorção de sondas radiofarmacêuticos (como 18F-FDG) por PET/CT. juntos, isto permite a caracterização adicional de crítica bioquímico vias (ou seja, alterações no metabolismo, alterações em hipóxia e a indução de apoptose) dentro o microambiente do tumor/BM. Principais pontos positivos deste modelo podem ser realçados pela disponibilidade de uma vasta gama de sondas radiolabeled, bioluminescentes e fluorescentes e marcadores que podem ser usados para estudar a progressão de MM e patologia em vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar de uma variedade de modelos pré-clínicos xenoenxertos de MM6,9,11,12,13, a capacidade de estudar as interações de tumor/BM dentro do microambiente BM continua a ser difícil 14. as técnicas descritas aqui permitem a rápida e reprodutível enxertia das células de tumores 8226-LUC no esqueleto de ratos NOG.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um mérito VA grant1I01BX001532 dos Estados Unidos Departamento de veteranos dos assuntos laboratório pesquisa biomédica e serviço de desenvolvimento (aves) de P.F. e E.C. reconhece apoio do (VA clínica ciência R & D serviço I01CX001388 prêmio de mérito) e reabilitação VA R & D serviço (Merit Award I01RX002604). Maior apoio veio de um subsídio de sementes da faculdade UCLA para J.K. Estes conteúdos não representam necessariamente as opiniões nos departamento de assuntos de veteranos ou o governo dos EUA.
Materials
| 8226 human myeloma cell line | ATCC | CCL-155 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG) | Jackson Labs | 5557 | |
| VivoGlo Luciferin substrate | Promega | P1041 | |
| Hypoxyprobe-1Kit | HPL | HP1-100 | |
| PE-CD45 (clone H130) | BD Biosciences | 555483 | Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate |
| rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q) | Cell Signaling Technology | 70527 | Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated) | ABCAM | ab205718 | Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| pGL4.5 Luciferase Reporter Vector | Promega | E1310 | |
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Sofie G8 PET/CT Imaging System | Perkin Elmer |
References
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