Summary
Hier gebruiken we bioluminescente, X-ray, en het positron-emissie tomografie/berekend tomography imaging te bestuderen hoe remmende mTOR activiteit beïnvloedt het beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in een xenograft model. Dit zorgt voor fysiologisch relevante, niet-invasieve en multimodale analyses van het effect van de anti-myeloma van therapieën gericht op beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in vivo.
Abstract
Multipel myeloom (MM) tumoren in het beenmerg (BM) engraft en hun overleving en progressie zijn afhankelijk van complexe moleculaire en cellulaire interacties die bestaan binnen deze communicatie. Nog kan de BM-communicatie niet gemakkelijk gerepliceerde in vitro, die potentieel de fysiologische relevantie van vele experimentele modellen die in vitro en ex vivo beperkt . Deze problemen kunnen worden opgelost door gebruik te maken van een xenograft model in welke luciferase (LUC)-transfected 8226 MM cellen zal specifiek engraft in het skelet van de muis. Als deze muizen worden gegeven de geschikt substraat, kan D-luciferine, de effecten van therapie op de tumorgroei en overleving worden geanalyseerd door het meten van veranderingen in de bioluminescente beelden (BLI) geproduceerd door de tumoren in vivo. Deze BLI-gegevens gecombineerd met positronisch-emissie tomografie/computationele tomografie (PET/CT) analyse met behulp van de metabole marker 2-deoxy - 2-(18F) fluoro-D-glucose (18F-FDG) wordt gebruikt voor het controleren van wijzigingen in de tumor metabolisme na verloop van tijd. Deze beeldvormende platforms kunnen voor meerdere noninvasive metingen binnen de tumor/BM-communicatie.
Introduction
MM is een ongeneeslijke ziekte opgebouwd uit kwaadaardige plasma B-cellen die infiltreren in de BM en bot vernietiging, bloedarmoede, nierfunctie en infectie veroorzaken. MM van 10% - 15% van alle hematologische maligniteiten1 maakt en is de meest voorkomende kanker te betrekken de skeleton2. De ontwikkeling van MM vloeit voort uit de oncogene transformatie van langlevende plasmacellen die gevestigd zijn in de germinal centra van lymfoïde weefsels voordat uiteindelijk homing naar de BM3. De BM wordt gekenmerkt door zeer heterogene nissen; met inbegrip van divers en kritische cellulaire componenten, regio's van lage pO2 (hypoxie), uitgebreide vascularisatie, complexe extracellulaire matrices en cytokine en groeifactor netwerken, die allemaal aan MM tumorgenesis4 bijdragen. Dus, zou de ontwikkeling van een gedissemineerde MM xenograft model gekenmerkt door tumoren die strikt worden geaccepteerd in de BM, een zeer krachtig en klinisch relevante hulpprogramma voor studie van MM pathologie in vivo5,6. Echter kunnen talrijke technische hindernissen beperken de doeltreffendheid van de meeste modellen van de xenograft, waardoor ze kostbaar en moeilijk toe te passen. Dit omvat problemen in verband met consistente en reproduceerbare tumor engraftment binnen de niche van de BM, een verlengde tijd aan de ontwikkeling van de tumor, en beperkingen in de mogelijkheid om rechtstreeks observeren en veranderingen van tumor groei/survival zonder te hoeven meten offeren muizen in de loop van het experiment7,8.
Dit protocol maakt gebruik van een gemodificeerd xenograft-model dat aanvankelijk werd ontwikkeld door Miyakawa et al. 9, waarin een intraveneuze (IV) uitdaging met myeloma cellen resulteert in "gedissemineerde" tumoren die consequent en reproducibly in de BM van NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) muizen10 engraft. De visualisatie in situ van deze tumoren wordt bereikt door de stabiele transfectie van de 8226 menselijke MM cellijn met een allel LUC en serieel het meten van de veranderingen in de BLI geproduceerd door deze werk tumor cellen6. Nog belangrijker is, kan dit model te gebruiken diverse andere LUC-uiten menselijke MM cellijnen (bijvoorbeeld, U266 en OPM2) met een gelijkaardige neiging naar specifiek engraft in het skelet van de muizen NOG worden uitgebreid. De identificatie van de tumoren door bioluminescente beeldvorming van de muizen wordt gevolgd door het meten van de opname van radiofarmaceutische sondes (zoals 18F-FDG) door PET/CT. samen, zorgt dit voor extra karakterisering van kritische biochemische trajecten (d.w.z., veranderingen in het metabolisme, veranderingen in hypoxie en de inductie van apoptosis) binnen de tumor/BM-communicatie. De belangrijkste troeven van dit model kunnen worden benadrukt door de beschikbaarheid van een breed scala van radiolabeled, bioluminescente en fluorescerende sondes en markeringen die kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van MM progressie en pathologie in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke hieronder beschreven procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van het grotere Los Angeles VA gezondheidszorg systeem en werden uitgevoerd onder steriele en pathogenen vrije voorwaarden.
1. bereiding van Luciferase-uiten 8226 cellen (8226-LUC)
- Het handhaven van de menselijke MM cellijn, 8226, in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 95% lucht en 5% kooldioxide (CO2).
- Genereren van stabiele LUC-uiten verslaggever 8226 cellen door transfecting 1 x 106 8226 cellen met een luciferase verslaggever vector gevolgd door een selectie met hygromycin (100-350 mg/mL) zoals eerder beschreven6.
- Het handhaven van de cellen onder steriele kweken standaardvoorwaarden voor 2-3 weken, wijzigen van het medium om de andere dag, totdat de totstandbrenging van een stabiel transfected 8226 cellijn is gegenereerd.
- Bevestigen van de in vitro luciferase activiteit in 1 x 106 transfected cellen/100 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door toevoeging van het luciferase substraat, D-luciferine (150 µg/mL werkoplossing in een kweekvloeistof voorverwarmde), en het meten van de Bioluminescentie van de cellen in een reageerbuis of 96-wells-plaat met behulp van een luminometer6.
2. Orthotopic Xenograft Model
- Handhaven NOG muizen (4-6 weken oud, man of vrouw) onder steriele/pathogenen vrije voorwaarden in een passende verzorging van de dieren-faciliteit.
- De 8226 LUC-transfected cellen voorbereiden IV injectie in de muizen NOG (~ 5 x 106 cellen/muis) op de dag van het experiment. Wassen van de cellen 3 x in ijskoude PBS, ze tellen en resuspendeer hen in ijskoude PBS (minus antibiotica en FBS) op een eindconcentratie van 5 x 106 cellen/200 µL van PBS) in een steriele reageerbuis. Houden van de cellen op ijs en daag de muizen zo snel mogelijk (binnen 30-120 min).
- Anesthetize van de muis (met Isofluraan, 1% - 3% in lucht bij 0,5 - 1 L/min) en plaats het dier in een liggende positie op een verwarming pad met het hoofd tegenover weg. Controleer het niveau van afstomping door het knijpen van de teen. Ophthalmic zalf toepassen op de ogen.
- De cellen van de 8226-LUC in de muizen door middel van de staart ader (200 µL/injectie) met behulp van een spuit van 1 mL insuline en een 26-G naald te injecteren.
Opmerking: Een warmte lamp kan worden gebruikt om te warmen de staart, waardoor de ader leerstoornissen en verhoging van de doeltreffendheid van injecties. - Het dier terug naar hun kooi en volgen van de dieren totdat zij volledig zijn hersteld.
- Bevestig de engraftment van 8226-LUC cellen in het skelet van de muis door het meten van de BLI in narcose muizen (hieronder beschreven en wordt weergegeven in figuur 1A).
Opmerking: BM exsudaat kunnen ook worden gekleurd voor menselijke CD45 expressie met behulp van stroom cytometry (figuur 1B) of door de immunohistochemistry van geoogste bot (Figuur 1 c).
3. meting van de BLI In Vivo
Opmerking: Doorgaans, meetbare BLI uit werk tumoren in muizen eerste tussen 10-20 dagen postchallenge kan worden waargenomen, maar dit mogelijk moet experimenteel worden bepaald.
- Anesthetize van de muis (met Isofluraan, 1% - 3% in lucht bij 0,5 - 1 L/min) en controleer het niveau van afstomping door het knijpen van de teen. Ophthalmic zalf toepassen in haar ogen.
- Geef het dier een IP-injectie (200 µL /) voor "in-vivo-grade" D-luciferine substraat (30 mg/mL verdund in een steriele zoutoplossing).
- Meten van de BLI binnen 5-10 min, na de injectie van het substraat luciferine (hoewel de BLI activiteit waarneembaar in de muizen gedurende maximaal 45-60 minuten zijn kan), door het plaatsen van de narcose dier in een liggende positie in een kleine dieren imaging systeem (Figuur 2 ). Selecteer verlichte en x-stralen analyse en verwerven van beelden (Figuur 3).
- Het meten van de gemiddelde straling (fotonen/s/cm2/steradian) in geselecteerde gebieden van belang (ROIs) met behulp van beeldbewerkingssoftware (Figuur 4).
- Het dier terug naar haar kooi en volgen het totdat het volledig is hersteld (ongeveer 15-20 min).
4. behandeling van de muizen met gerichte therapie
- Meten van de basislijn BLI en randomize van de dieren in de behandelgroepen (muizen/groep 4-8).
- Behandelen van de muizen met een IP-injectie (200 µL /) van temsirolimus (0.2 - 40 mg/kg muis) met behulp van een regime van vijf dagelijkse IP-injecties gevolgd door 2 dagen van rust en een extra vijf dagelijkse injecties11.
- Meten van de luciferase activiteit (fotonen/s/cm2/steradian) 2 x per week zoals beschreven in punt 3 en plot de verandering van de BLI na verloop van tijd. Veranderingen in de tumor BLI kan worden gepresenteerd als seriële beelden van de muizen (figuur 5B).
Opmerking: Het wordt aanbevolen dat dagelijkse monitoring van de dieren worden uitgevoerd totdat zij de volgende symptomen aanwezig (gewoonlijk binnen een 45-60 dagen van de eerste uitdaging): gewicht verlies (het verlies van meer dan 10% ten opzichte van het gewicht vóór) en/of hind de verlamming van de ledematen, waarna zij moeten worden euthanized met behulp van een CO2 kamer gevolgd door cervicale dislocatie.
5. PET/CT-analyse met behulp van 18F-FDG maatregel verandert in Tumor metabolisme
- De dieren in hun kooi snel doordat hun voedsel gedurende 24 uur voorafgaand aan het experiment om te voorkomen dat overtollige aspecifieke opname van 18F-FDG.
- Bereiden 18FDG-PET F-radiolabeled sondes (50-100 µCi/injectie in een steriele zoutoplossing) op de dag van het experiment. De tijd en de activiteit van de 18F-FDG-sonde met een dosis kalibrator registreren.
Opmerking: Omdat 18F heeft een relatief korte halfwaardetijd (~ 2 h), een zorgvuldige voorbereiding en planning voor het gebruik van deze sondes moeten komen. - Anesthetize van het dier (met Isofluraan, 1% - 3% in lucht bij 0,5 - 1 L/min) en plaats deze in een liggende positie op een verwarming pad met het hoofd tegenover weg. Controleer het niveau van afstomping door het knijpen van de teen. Ophthalmic zalf toepassen in haar ogen.
- Spuit de sonde via de staart ader (100 µL/injectie) met behulp van een afgeschermde 1 mL insuline spuit en een 26-G naald.
Opmerking: Een warmte lamp kan worden gebruikt om te warmen de staart, waardoor de ader leerstoornissen en verhoging van de doeltreffendheid van injecties. - Meten van de resterende radioactiviteit in de naald/spuit in een dosis kalibrator en noteer de activiteit en de tijd.
Opmerking: De standaardisatie van muis incubatie, dosering en timing is essentieel om de reproduceerbaarheid van de gegevens en vergelijkbaarheid. - Het handhaven van de muizen onder verdoving en bij 37 ° C met behulp van een verwarming pad gedurende de gehele looptijd van de sonde opname (~ 45-90 min).
Opmerking: Het is belangrijk dat de muizen blijven geven en bij 37 ° C te vermijden van aspecifieke opname van de sonde. - Spreiden de injecties van de sonde 18F-FDG optreden tussenpozen van ongeveer 20 - tot 30-min om soortgelijke labeling keren in de muizen.
Opmerking: Juiste workflow en timing van de sonde injecties zal leiden tot optimale en reproduceerbare imaging voorwaarden. - Meet de 18F-FDG-activiteit in een PET/CT kleine dieren imaging systeem in geselecteerde gebieden van belang die overeenkomen met het werk tumoren (Figuur 6).
Opmerking: In eerste instantie, een 10-min statische PET belichting en een 2-min CT blootstelling worden aanbevolen, maar de exacte belichtingstijden mogelijk moet experimenteel worden bepaald. - De dieren terugkeren naar hun huis kooien en controleren ze totdat volledig hersteld. Het huis van de muizen in een speciale retour kamer voor 24 h terwijl de sonde vervalt aan de achtergrondniveaus.
Opmerking: Vanwege de korte halfwaardetijd van 18F, meerdere metingen met behulp van een nieuwe sonde kunnen worden gemaakt zo vaak als 2 x per week.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In eerste pilotstudies, IV injecties van 8226-LUC cellen in KNIPOOG/SCID muizen heb niet de ontwikkeling van BM-geaccepteerd MM tumoren, hoewel squamous MM tumoren waren gemakkelijk gevormd (slagingspercentage 100%). Daarentegen IV uitdagingen met 8226 cellen NOG muizen gegenereerd (binnen 15-25 dagen) tumoren in het skelet (en slechts zelden gevormde tumoren in niet-skeletale tissue, zoals de lever of milt). Aangezien tumoren in het skelet, kon niet visueel te worden bevestigd door het lichamelijk onderzoek van de dieren, moest andere methoden worden beschouwd om succesvolle tumor engraftment en de locatie van de tumoren binnen de BM (Figuur 1) te bevestigen. Vergelijkbaar met de verslagen van Miyakawa et al. 9, menselijke IgG, geproduceerd door 8226 cellen, kon worden opgespoord in het serum van uitgedaagd NOG muizen met behulp van ELISA (gegevens niet worden weergegeven), hoewel deze gegevens alleen zien bevestigd engraftment en niet de locatie of de omvang van de tumoren. Seriële beeldvorming van meerdere dieren toont de verdeling van de BM-geaccepteerd MM tumoren (Figuur 4). De BLI geproduceerd door deze geaccepteerd tumor cellen kunnen dan worden serieel en niet-gebeurt gemeten om te beoordelen van veranderingen in de tumorgroei en overleving in muizen behandeld met de mTOR-remmer temsirolimus (Figuur 5). Ten slotte, PET/CT analyse voor de opname van 18F-FDG in de tumoren werd gebruikt om aan te tonen van temsirolimus-gemedieerde veranderingen in het glucose metabolisme en dat dit gecorreleerd met veranderingen in de tumorgroei van de (Figuur 6). Echter door stabiel transfecting 8226 cellen met een luciferase allel, in combinatie met een optische beeldvorming/X-Vleug analyse, kon de exacte locatie en de distributie van MM tumoren in het skelet van de muis worden snel en niet-gebeurt vastgesteld.
Figuur 1: bevestiging van de engraftment van 8226-LUC cellen in het skelet van de muis. (A) NOG muizen werden uitgedaagd met 5 x 106 8226-LUC2 cellen IV (muis aan de linkerkant) of met zoutoplossing (muis aan de rechterkant). Na 15 dagen, de muizen kregen een IP-injectie van D-luciferine substraat en beeld met behulp van een kleine-dier imaging systeem. (B) de muizen werden geofferd, het dijbeen werden verzameld en de BM cellulaire afgescheiden werd geoogst. De expressie van menselijke CD45 werd bepaald door cytometry van de stroom met behulp van een PE-geconjugeerde anti-menselijke CD45 antilichaam. (C) dit paneel toont een immunohistochemistry van seriële secties van muis dijbeen gekleurd voor hypoxie met behulp van pimonidazole (bovenste panelen) of menselijke CD45 (onderste panelen) in muizen uitgedaagd met 8226 (juiste panelen) of zoutoplossing (controle; links panelen). Het sterretje geeft aan dat de locatie van een groot bloedvat in de seriële secties. De schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: narcose NOG muizen tonen positionering in het imaging systeem voorafgaand aan het meten van de BLI signaal uit het beenmerg-geaccepteerd MM tumoren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: opzet van de optische beeldvorming en x-stralen analyse van de bioluminescente signaal verkregen NOG muizen. Zodra de dieren met succes aangevochten zijn en de engraftment van tumoren in de BM is bevestigd, kunnen de muizen worden gerandomiseerde in behandelgroepen. Op verschillende tijdstippen in de loop van het experiment, kunnen de dieren worden gecontroleerd op wijzigingen in de BLI. Omdat de procedure noninvasive is, kan de frequentie van de controle worden gewijzigd om weer te geven van de verwachte groei van de tumoren, evenals hoe snel de kankercellen op therapie reageren zullen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: seriële beeldvorming van meerdere dieren waarin de verdeling van het beenmerg-geaccepteerd MM tumoren. De regio's van belang (ROI) voor elke muis worden geïdentificeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: veranderingen in de BLI van werk tumoren in NOG muizen tijdens een therapeutische regime van anti-MM. (A) dit paneel toont een verandering in de gemiddelde straling (p/s/cm2/ser) in temsirolimus (20 mg/kg muis)-behandelde NOG muizen uitgedaagd IV met 5 x 106 cellen. Zodra de muizen werden waargenomen als positief voor werk tumoren, werden ze gerandomiseerd in verschillende groepen van de behandeling. De muizen kregen vijf IP-injecties per dag, gevolgd door 2 dagen rust en dan een extra vijf IP-injecties temsirolimus (de staven op de x-as geven de dagen van behandeling) of voertuig besturingselement. Op verschillende dagen, kregen de muizen IP-injecties van "in vivo-grade" D-luciferine en de BLI werd gemeten met behulp van een optische beeldvorming platform. De waarden vertegenwoordigen de gemiddelde radiance (p/s/cm2/ser) ± een 95%-betrouwbaarheidsinterval. (B) deze Kaplan-Meier perceel toont de verandering in procenten van de overlevende muizen na verloop van tijd. Muizen die had bereikt de eindpunt-criteria (dat wil zeggen, een verlies van > 10% lichaamsgewicht of hind-limb verlamming) waren humaan euthanized. (C) dit paneel toont representatieve beelden van muizen genomen op de dagen 28, 35 en 40, wijzigingen in de activiteit van LUC tonen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Seriële beeldvorming en relatieve veranderingen in de opname van de 18F-FDG door PET/CT. (A) dit paneel toont seriële beeldvorming van de dezelfde muis voor bioluminescentie (optische beeldvorming/X-Vleug) beeldvorming en 18F-FDG ICT door PET/CT. BLI werd gemeten in narcose muizen en de PET/CT beeldvorming van de dezelfde muis werd uitgevoerd 24 h later. De muis 's nachts gevast en op de dag van de studie, kreeg een IV injectie van 50 µCi 18F-FDG. De muizen werden onderhouden onder verdoving tijdens de incubatie opname sonde (60 min) en vervolgens werden geanalyseerd voor 18F-FDG opname door PET/CT analyse. Tumoren (T1 en T2) zijn aangegeven. H = hart, K = nier, en B = blaas. (B) dit paneel toont relatieve veranderingen (in een percentage van onbehandeld controlegewas tumoren) bij de opname van de 18F-FDG in besturingselement muizen (geen behandeling) of temsirolimus (20 mg/kg muis)-muizen (gemeten in dagen 22, 35 en 40) behandeld. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde (n = 5 muizen) ± 1 S.D. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks een verscheidenheid van preklinische xenograft modellen van MM6,9,11,12,13blijft de mogelijkheid te bestuderen van de tumor/BM interacties communicatie in het BM moeilijk 14. de hier beschreven technieken zorgen voor de snelle en reproduceerbaar engraftment van 8226-LUC tumoren cellen in het skelet voor NOG muizen.
De kritische stappen in dit protocol betrokken deinvoeringvan MM cellijnen luciferase-uitdrukken en de verificatie van een stabiele uitdrukking van luciferase in vitro15. Zodra de cellijnen zijn vastgesteld, NOG muizen worden uitgedaagd door IV injectie en de engraftment van tumoren aan het skelet wordt bevestigd door het meten van de BLI activiteit in vivo (meestal binnen 10-20 dagen postchallenge) (figuur 1A). Het gebruik van NOG muizen is belangrijk omdat andere immunodeficiëntie stammen (zoals knik/SCID) meestal geen tumoren BM-geaccepteerd vormen. Het relatief hoge slagingspercentage van implantatie (> 90%) en het korte interval te observeren een positief signaal van de BLI maakt dit model ideaal voor een high-throughput en longitudinale analyse van anti-MM therapeutische modaliteiten (Figuur 4). Een ander zeer belangrijk aspect van dit model is dat de cellijnen van BM-geaccepteerd MM handhaven hun morfologische en immunologische kenmerken van het bovenliggende cellijnen (b.v., 8226, U266); ze hebben van consistente en reproduceerbare groeipatronen en vertonen kenmerken van patiënt ziekten, zoals de vergroting van de serum menselijke IgG paraprotein niveaus en de vorming van bot laesies.
Het voordeel van deze strategie is het gebruik van deze krachtige imaging technieken te bestuderen herhaaldelijk biochemische en moleculaire componenten van de tumor/BM-communicatie in de loop van de progressie van de ziekte en in reactie op anti-tumor therapieën. In dit experiment vonden we dat gericht op mTOR activiteit in muizen met BM-geaccepteerd myeloma tumoren resulteerden in een daling in bioluminescente metingen die na verloop van tijd kon worden waargenomen. Bovendien vonden we dat de veranderingen in de opname van de 18F-FDG-sonde (figuur 6B) in deze dezelfde tumoren werden gecorreleerd aan veranderingen in de bioluminescente signaal (figuur 5B). Een ander essentieel onderdeel van deze procedure is dat meerdere biochemische variabelen binnen de tumor kunnen worden gemeten na verloop van tijd. Dit is vooral belangrijk omdat de tumor progressie is een dynamisch proces gekenmerkt door veranderingen in fysiologie en communicatie kenmerken van de tumor. Dus, deze procedure, kunnen vanwege het niet-invasieve karakter en de relatief korte halfwaardetijd van de sondes, voor meerdere longitudinale analyses van veranderingen in de tumor respons op therapie.
Na het beheersen van de techniek, presenteren de toekomstige toepassingen van de techniek een grote mate van flexibiliteit. Bijvoorbeeld kan het gebruik van andere bioluminescente of TL tags (bv, fluorescently tagged antilichamen) ook worden gebruikt, als kon verschillende andere 18F-geëtiketteerden sondes en radiofarmaceutische verbindingen te bestuderen van specifieke biochemische trajecten of processen in de tumor/BM-communicatie. Vanwege de korte halfwaardetijd van veel van deze radionucleotides, kunnen meerdere seriële metingen worden verricht in de loop van een specifieke experiment om te studeren drug opname, distributie, kinetiek en verval. Gebruik dit xenograft model, het vermogen van MM gebruiken anaërobe glycolyse en andere stofwisselingsroutes (d.w.z., vetzuursynthese) met behulp van andere sondes (bijvoorbeeld,18F-fluoro-2deoxyglucose [18F-FDG] en 18 F-fluoro-4-Thia-Palmitate [FTP])16,17, alsmede de mogelijkheid voor het meten van de anti-proliferatieve effecten van behandeling met behulp van een andere grote schaal gebruikt sonde (dat wil zeggen, 3'-deoxy-3'-[18F] fluorothymidine [ 18F-FLT]) kunnen worden opgenomen in de experimentele designs. Bovendien kan het mogelijk zijn om te meten direct dood van de cel met behulp van 18F-Annexine B1 voor het meten van apoptosis in vivo18. Veel van deze verbindingen zijn commercieel verkrijgbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur Kevin Francis is een medewerker van de Perkin-Elmer.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een grant1I01BX001532 VA VERDIENSTE van het VS departement van veteranen zaken biomedische laboratoriumonderzoek en ontwikkeling Service (BLRDS) te P.F., E.C. erkent steun van de () VA Clinical Science R & D-Service Merit Award I01CX001388) en VA revalidatie R & D Service (Merit Award I01RX002604). Verdere steun kwam uit een UCLA faculteit zaad subsidie aan J.K. Deze inhoud noodzakelijkerwijs niet de visie van de ons Department of Veterans Affairs of de regering van de VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8226 human myeloma cell line | ATCC | CCL-155 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG) | Jackson Labs | 5557 | |
| VivoGlo Luciferin substrate | Promega | P1041 | |
| Hypoxyprobe-1Kit | HPL | HP1-100 | |
| PE-CD45 (clone H130) | BD Biosciences | 555483 | Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate |
| rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q) | Cell Signaling Technology | 70527 | Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated) | ABCAM | ab205718 | Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| pGL4.5 Luciferase Reporter Vector | Promega | E1310 | |
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Sofie G8 PET/CT Imaging System | Perkin Elmer |
References
- Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Multiple Myeloma. The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).
- Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease. BoneKEy Reports. 1, 135 (2012).
- Anderson, K. C., Carrasco, R. D.
- Reagan, M. R., Rosen, C. J. Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction. Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).
- Frost, P., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis. Journal of Oncology. 2013, 897025 (2013).
- Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity. Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).
- Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy. Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).
- Campbell, R. A., et al. Laglambda-1: A Clinically Relevant Drug Resistant Human Multiple Myeloma Tumor Murine Model That Enables Rapid Evaluation of Treatments for Multiple Myeloma. International Journal of Oncology. 28 (6), 1409-1417 (2006).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of a New Model of Human Multiple Myeloma Using Nod/Scid/Gammac(Null) (Nog) Mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (2), 258-262 (2004).
- Ito, M., et al. Nod/Scid/Gamma(C)(Null) Mouse: An Excellent Recipient Mouse Model for Engraftment of Human Cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Frost, P., et al. In Vivo Antitumor Effects of the Mtor Inhibitor Cci-779 against Human Multiple Myeloma Cells in a Xenograft Model. Blood. 104 (13), 4181-4187 (2004).
- Asosingh, K., et al. Role of the Hypoxic Bone Marrow Microenvironment in 5t2mm Murine Myeloma Tumor Progression. Haematologica. 90 (6), 810-817 (2005).
- Storti, P., et al. Hypoxia-Inducible Factor (Hif)-1alpha Suppression in Myeloma Cells Blocks Tumoral Growth in Vivo Inhibiting Angiogenesis and Bone Destruction. Leukemia. 27 (8), 1697-1706 (2013).
- Fryer, R. A., et al. Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment. PLoS One. 8 (2), e57641 (2013).
- Gould, S. J., Subramani, S. Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology. Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).
- Czernin, J., Phelps, M. E. Positron Emission Tomography Scanning: Current and Future Applications. Annual Review Medicine. 53, 89-112 (2002).
- Pandey, M. K., Bhattacharyya, F., Belanger, A. P., Wang, S. Y., DeGrado, T. R. Pet Imaging of Fatty Acid Oxidation and Glucose Uptake in Heart and Skeletal Muscle of Rats: Effects of Cpt-1 Inhibition. Circulation. 122 (21), (2010).
- Wang, M. W., et al. An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation. Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).
