Summary
هنا نستخدم طرحه، والأشعة السينية، وانبعاث بوزيترون التصوير المقطعي/حسبت التصوير التصوير المقطعي لدراسة كيفية المثبطة mTOR النشاط آثار أورام نخاع العظم انجرافتيد المايلوما في نموذج إكسينوجرافت. وهذا يسمح للتحليلات ذات الصلة فسيولوجيا وغير الغازية، والنقل المتعدد الوسائط من تأثير العلاجات استهداف الورم النخاعي انجرافتيد نخاع العظام الأورام في فيفوالمضادة الورم النخاعي.
Abstract
انجرافت الأورام الورم النخاعي المتعدد (مم) في نخاع العظم (بي أم) والبقاء والتقدم تعتمد على التفاعلات الجزيئية والخلوية المعقدة التي توجد داخل هذا المكروية. حتى الآن لا يمكن أن يكون المكروية BM منسوخة بسهولة في المختبر، الذي يحتمل أن يحد من أهمية العديد من النماذج التجريبية في المختبر و السابقين فيفو الفسيولوجية. ويمكن التغلب على هذه المشكلات باستخدام نموذج إكسينوجرافت الذي لوسيفراس (لوك)-على وجه التحديد سوف انجرافت ترانسفيكتيد مم 8226 الخلايا في هيكل عظمى الماوس. عندما يتم إعطاء هذه الفئران الركازة الملائمة، يمكن تحليل لوسيفرين د، وآثار العلاج في نمو الورم والبقاء على قيد الحياة بقياس التغيرات في الصور طرحه (BLI) التي تنتجها الأورام في الجسم الحي. هذه البيانات BLI جنبا إلى جنب مع تحليل التصوير المقطعي (PET/CT) التصوير المقطعي بانبعاث positronic الحسابية باستخدام علامة الأيض 2-ديوكسي-2-(18و) تستخدم مخفضات-د-الجلوكوز (18وفدج) لرصد التغيرات في التمثيل الغذائي الورم على مر الزمن. تسمح هذه المنصات التصوير متعددة القياسات موسع داخل المكروية الورم/بي أم.
Introduction
مم هو مرض عضال مكونة من البلازما الخبيثة الخلايا البائية التسلل BM وتتسبب في تدمير العظام وفقر الدم والكلوي والإصابة. يجعل حتى 10%-15% من جميع الأورام الخبيثة الدموية1 مم وهو السرطان الأكثر شيوعاً تشمل هيكل عظمى2. تطوير مم تنبع من تحول النمطان من خلايا البلازما المعمرة التي تقام في مراكز جيرمنال من الأنسجة اللمفاوية قبل صاروخ موجه في نهاية المطاف إلى بي أم3. BM يتسم بمنافذ غير متجانسة عالية؛ بما في ذلك المكونات الخلوية المتنوعة والهامة، مناطق بو منخفضة2 (نقص) والأوعية الدموية الواسعة، والمصفوفات المعقدة خارج الخلية، وشبكات سيتوكين وعامل النمو، كلها تسهم في مم تومورجينيسيس4. وهكذا، سيكون وضع نموذج xenograft مم نشر تتميز بالأورام التي يتم انجرافتيد تماما في بي أم أداة قوية جداً وذات الصلة سريرياً لدراسة مم علم الأمراض في فيفو5،6. ومع ذلك، العديد من العقبات التقنية يمكن أن تحد من فعالية معظم نماذج إكسينوجرافت، ويجعلها مكلفة وصعبة لتطبيق. وهذا يشمل المشاكل المرتبطة انجرافتمينت الورم متسقة واستنساخه في مكانة BM، فترة طويلة للتنمية الورم، والقيود في القدرة على مباشرة مراقبة وقياس التغيرات في نمو الورم/البقاء دون الحاجة إلى التضحية الفئران خلال7،التجربة8.
هذا البروتوكول يستخدم نموذج xenograft معدلة التي وضعت في البداية ميياكاوا et al. 9، الذي يشكل تحديا (رابعا) عن طريق الحقن الوريدي مع خلايا الورم النخاعي ينتج "نشر" الأورام التي انجرافت باستمرار وتكاثر في الفئران BM NOD/SCID/IL-2γ(null) (وتد)10. يتحقق التصور في عين المكان من هذه الأورام تعداء مستقرة من خط خلية مم 8226 البشرية مع اليل لوك ومتسلسل قياس التغيرات التي طرأت BLI التي تنتجها هذه الخلايا السرطانية انجرافتيد6. الأهم من ذلك، يمكن توسيع هذا النموذج استخدام مختلف معربا عن لوك البشرية مم خلية خطوط أخرى (مثلاً، U266 و OPM2) مع ميل مماثلة انجرافت على وجه التحديد في الهيكل العظمى للفئران وتد. تحديد الأورام بتصوير طرحه من الفئران تبعتها قياس امتصاص المسابير الصيدلانية (مثل 18وفدج) بالحيوانات الأليفة/قيراط "معا"، وهذا يسمح لتحديد خصائص إضافية حاسمة البيوكيميائية المسارات (أي، تعديلات في الأيض والتغييرات في نقص، وتنظيم دورات تعريفية للمبرمج) داخل المكروية الورم/بي أم. يمكن إبراز نقاط القوة الرئيسية في هذا النموذج بتوافر طائفة واسعة من المسابر راديولابيليد وطرحه والفلورسنت والعلامات التي يمكن استخدامها لدراسة تطور ملم وعلم الأمراض في فيفو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) للنظام "لوس أنجليس أكبر خامسا الرعاية الصحية" جميع الإجراءات الحيوانية المبينة أدناه وأجريت تحت ظروف معقمة وخالية من مسببات الأمراض.
1-إعداد الخلايا 8226 معربا عن لوسيفراس (8226-لوك)
- الحفاظ على خط الخلية مم البشرية، 8226، في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين-ستربتوميسين 1% في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% ثاني أكسيد الكربون (CO2).
- توليد خلايا مراسل 8226 مستقر معربا عن لوك ترانسفيكتينج 1 × 106 8226 الخلايا مع ناقل مراسل لوسيفراس متبوعاً تحديد مع هيجروميسين (100-350 ملغ/مل) كما سبق وصف6.
- الحفاظ على الخلايا تحت العقيمة تثقيف الشروط القياسية لمدة 2-3 أسابيع، تغيير في المتوسط كل يوم، حتى تم إنشاؤها بإنشاء خط الخلية 8226 transfected ثابت.
- تأكيد نشاط لوسيفراس في المختبر في 1 × 106 transfected الخلايا/100 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بإضافة الركازة لوسيفراس، د-لوسيفرين (ميكروغرام/مل 150 العامل الحل في بريوارميد الثقافة المتوسطة)، وقياس الإضاءة الحيوية الخلايا في أنابيب الاختبار أو لوحة 96-جيدا باستخدام لومينوميتير6.
2-نموذج أورثوتوبيك إكسينوجرافت
- الحفاظ على الفئران وتد (4-6 أسابيع القديمة، ذكرا كان أو أنثى) تحت ظروف معقمة/الممرض-الحرة في مرفق لرعاية حيوانية مناسبة.
- إعداد الخلايا transfected لوك 8226 لحقن الرابع في الفئران وتد (~ 5 × 106 خلايا/الماوس) في اليوم من هذه التجربة. تغسل الخلايا 3 x في برنامج تلفزيوني المثلج، يعول عليها، وريسوسبيند لهم في برنامج تلفزيوني المثلج (ناقص FBS والمضادات الحيوية) بتركيز نهائي من 5 × 106 خلايا/200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني) في أنبوب اختبار عقيمة. تبقى الخلايا على الجليد وتحدي الفئران في أقرب وقت ممكن (في غضون 30-120 دقيقة).
- تخدير الماوس (مع إيسوفلوراني، 1%-3% في الهواء في 0.5-1 لتر في الدقيقة) ووضع الحيوان في موقف ضعيف على وسادة تدفئة مع الرأس التي تواجه بعيداً. التحقق من مستوى أنيسثيتيزاتيون معسر إصبع القدم. تطبيق مرهم العيون إلى العيون.
- حقن الخلايا 8226-لوك في الفئران عن طريق الوريد الذيل (200 ميليلتر في حقن) باستخدام حقنه الأنسولين 1 مل وابرة 26-ز.
ملاحظة: يمكن استخدام مصباح حرارة الحارة الذيل، معلقاً على المنوال التالي وزيادة فعالية الحقن. - إرجاع الحيوان إلى القفص المنزل، ومراقبة الحيوانات حتى أنهم شفوا تماما.
- تأكيد engraftment الخلايا 8226-لوك في هيكل عظمى الماوس عن طريق قياس BLI في الفئران تخديره (المبينة أدناه وهو موضح في الشكل 1A).
ملاحظة: كما يمكن أن يكون الملون للبشرية CD45 التعبير باستخدام التدفق الخلوي (الشكل 1B) أو عن طريق إيمونوهيستوتشيميستري من العظم المقطوع (الشكل 1) نتحات بي أم.
3-قياس BLI في فيفو
ملاحظة: عادة، يمكن ملاحظة BLI قابلة للقياس من الأورام انجرافتيد في الفئران الأول بين 10-20 يوما بوستشالينجي، ولكن هذا قد تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا.
- تخدير الماوس (مع إيسوفلوراني، 1%-3% في الهواء في 0.5-1 لتر في الدقيقة) والتحقق من مستوى أنيسثيتيزيشن معسر إصبع القدم. تطبيق مرهم العيون العيون.
- إعطاء الحيوان حقنه IP (200 ميليلتر في حقن) من "في فيفو-الصف" الركيزة د-لوسيفرين (30 ملغ/مل مخففة في المحلول الملحي المعقم).
- قياس BLI ضمن 5-10 دقيقة، بعد حقن الركيزة لوسيفرين (على الرغم من أن هذا النشاط BLI يمكن ملاحظتها في الفئران ليصل إلى 45-60 دقيقة)، عن طريق وضع الحيوان أنيسثيتيزيد في موقف ضعيف في نظام تصوير الحيوانات الصغيرة (رقم 2 ). حدد الإنارة وتحليل الأشعة السينية، والحصول على الصور (الشكل 3).
- قياس متوسط التألق (الفوتونات/s/سم2/steradian) في مناطق مختارة من الفائدة (رويس) باستخدام برامج التصوير (الشكل 4).
- إرجاع الحيوان إلى قفصة المنزل ومراقبة ذلك حتى أنه قد تعافي تماما (حوالي 15-20 دقيقة).
4-معاملة الفئران مع العلاج المستهدفة
- قياس خط الأساس BLI والحيوانات بطريقة عشوائية إلى معاملة مجموعات (4-8 الفئران/المجموعة).
- علاج الفئران بحقن IP (200 ميليلتر في حقن) تيمسيروليموس (0.2-40 مغ/كغ الماوس) باستخدام نظام خمس حقن IP يوميا تليها 2 أيام من الراحة و حقن يومي إضافية خمس11.
- قياس النشاط لوسيفراس (/steradian الفوتونات/s/سم2) x 2 في الأسبوع كما هو موضح في القسم 3 ومؤامرة تغيير BLI مرور الوقت. التغييرات في الورم BLI يمكن عرضها كصور المسلسل من الفئران (الشكل 5B).
ملاحظة: من المستحسن إجراء الرصد اليومي للحيوانات حتى أنها تقدم الأعراض التالية (عادة في غضون 45-60 يوما التحدي الأولى): وزن خسارة (فقدان أكثر من 10% بالنسبة للوزن قبل غرس) و/أو هند أطرافهم بالشلل، في الوقت الذي كانوا ينبغي أن يكون euthanized استخدام دائرة2 CO متبوعاً بخلع عنق الرحم.
5-PET/CT التحليل باستخدام 18وفدج لقياس التغيرات في الأيض الورم
- سريع للحيوانات في قفص المنزل بهم عن طريق إزالة طعامهم ل 24 ساعة قبل التجربة لتجنب الزائد غير محددة الإقبال على 18وفدج.
- إعداد 18راديولابيليد و "الحيوانات الأليفة فدج" المسابر (50-100 µCi/حقن في المحلول الملحي المعقم) في اليوم من هذه التجربة. تسجيل الوقت ونشاط المسبار 18وفدج مع معايرة جرعات.
ملاحظة: بسبب 18و نصف عمر قصيرة نسبيا (~ 2 ح)، إعداد دقيق والتخطيط لاستخدام هذه المجسات يجب إنشاء. - تخدير الحيوان (مع إيسوفلوراني، 1%-3% في الهواء في 0.5-1 لتر في الدقيقة) ووضعه في موقف ضعيف على وسادة تدفئة مع الرأس التي تواجه بعيداً. التحقق من مستوى أنيسثيتيزاتيون معسر إصبع القدم. تطبيق مرهم العيون العيون.
- حقن التحقيق عن طريق الوريد الذيل (100 ميليلتر في حقن) باستخدام حقنه الأنسولين محمية 1 مل وابرة 26-ز.
ملاحظة: يمكن استخدام مصباح حرارة الحارة الذيل، معلقاً على المنوال التالي وزيادة فعالية الحقن. - قياس الإشعاع المتبقية في الإبرة/المحاقن في معايرة جرعة وملاحظة نشاط والوقت.
ملاحظة: توحيد الاحتضان الفأرة والجرعة والتوقيت ضروري لضمان إمكانية تكرار نتائج البيانات وقابليتها للمقارنة. - الحفاظ على الفئران تحت التخدير وعلى 37 درجة مئوية باستخدام وسادة تدفئة طوال فترة التحقيق امتصاص (~ 45-90 دقيقة).
ملاحظة: من المهم أن الفئران لا تزال هادئة وفي 37 درجة مئوية لتجنب امتصاص غير محددة للتحقيق. - إرباك الحقن المسبار 18وفدج تحدث في حوالي 20 إلى 30 دقيقة في فترات ضمان مماثلة مرات وضع العلامات في الفئران.
ملاحظة: سيؤدي سير العمل السليم وتوقيت الحقن التحقيق في الظروف المثلى واستنساخه بالتصوير. - قياس نشاط 18وفدج في PET/CT الحيوانات صغيرة نظام تصوير في مناطق مختارة من الفائدة التي تتوافق مع الأورام انجرافتيد (الشكل 6).
ملاحظة: في البداية، ينصح تعرض محبوبة ثابت 10-دقيقة وعلى تعرض CT 2-مين، لكن مرات التعرض الدقيقة قد تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا. - إرجاع الحيوانات إلى اقفاصها المنزل ورصد لهم حتى شُفي تماما. بيت الفئران في غرفة إرجاع مكرسة ل 24 ساعة بينما يضمحل المسبار إلى مستويات الخلفية.
ملاحظة: نظراً لأن نصف العمر القصير 18و، قياسات متعددة باستخدام مجس جديدة يمكن إجراء كما متكرر كما x 2 في الأسبوع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
رابعا حقن الخلايا 8226-لوك في الفئران إيماءة/مشمولان في الدراسات التجريبية الأولية، لم تتطور الأورام مم BM-انجرافتيد، على الرغم من أن تشكيل صدفية ملم كانت الأورام بسهولة (نسبة النجاح 100%). على النقيض من ذلك، ولدت تحديات الرابع مع 8226 الخلايا في الفئران وتد (15-25 يوما) الأورام في هيكل عظمى (والأورام نادراً ما المشكلة الوحيدة في الأنسجة غير الهيكلية، مثل الكبد أو الطحال). إذ لا يمكن تأكيد الأورام في هيكل عظمى بصريا عن طريق فحص الحيوانات جسديا، قد أساليب أخرى النظر إلى تأكيد engraftment ورم ناجحة وموقع الأورام داخل BM (الشكل 1). مماثلة للتقارير المقدمة من ميياكاوا et al. يمكن أن يتم الكشف عن 9، مفتش البشرية، التي تنتجها خلايا 8226، في المصل لتحدي وتد الفئران باستخدام ELISA (البيانات لا تظهر)، على الرغم من أن هذه البيانات فقط أكدت انجرافتمينت ولا مكان أو مدى من الأورام. تصوير المسلسل للحيوانات متعددة ويبين توزيع الأورام انجرافتيد BM مم (الشكل 4). انجرافتيد ورم الخلايا يمكن BLI تنتجها هذه ثم يقاس متسلسل وغير إينفاسيفيلي لتقييم التغيرات في نمو الورم والبقاء على قيد الحياة في الفئران تعامل مع تيمسيروليموس المانع mTOR (الشكل 5). وأخيراً، استخدمت تحليل PET/CT لاستيعاب 18وفدج في الأورام لإظهار التغييرات تيمسيروليموس بوساطة في استقلاب الغلوكوز وهذا يرتبط بالتغيرات في نمو الورم (الشكل 6). ومع ذلك، قبل ستابلي ترانسفيكتينج الخلايا 8226 مع اليل لوسيفراس، بالاقتران مع بصري تصوير-أشعة X تحليلاً، المكان المحدد وتوزيع الأورام ملم في هيكل عظمى الماوس يمكن بسرعة وغير إينفاسيفيلي تحديد.
رقم 1: تأكيد انجرافتمينت لوك 8226 الخلايا في هيكل عظمى الماوس. الفئران (A) وتد طعن 5 × 106 خلايا 8226-LUC2 الرابع (الماوس على اليسار) أو مع المحلول الملحي (الماوس على اليمين). بعد 15 يوما، وأعطيت حقنه IP من الركازة لوسيفرين د الفئران وتصويرها باستخدام نظام تصوير الحيوانات الصغيرة. (ب) كانت التضحية بالفئران، جمعت في قصبة، وكان حصاد الإفرازات الخلوية BM. التعبير عن CD45 البشرية تحددها التدفق الخلوي استخدام جسم CD45 مترافق PE المضادة الإنسان. (ج) هذا الفريق يظهر إيمونوهيستوتشيميستري مقاطع المسلسل لقصبة الماوس الملون لنقص استخدام بيمونيدازولي (لوحات العلوي) أو CD45 البشرية (أسفل لوحات) في الفئران تحدي مع 8226 (لوحات الحق) أو المحلول الملحي (التحكم؛ لوحات الأيسر). العلامة النجمية يشير إلى موقع الأوعية الدموية الكبيرة في مقاطع المسلسل. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الفئران وتد تخديره من عرض المواقع في نظام التصوير قبل قياس BLI إشارة من الأورام مم نخاع العظم انجرافتيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الإعداد للتصوير الضوئي وتحليل الأشعة السينية من إشارة طرحه جمعت من الفئران وتد. وبمجرد الحيوانات قد طعن فيها بنجاح وتم تأكيد engraftment الأورام في بي أم، يمكن معشاة الفئران إلى مجموعات العلاج. في أوقات مختلفة خلال فترة التجربة، يمكن رصد الحيوانات لإجراء تغييرات في BLI. لأن هذا الإجراء موسع، يمكن تغيير تواتر الرصد لتعكس النمو المتوقع للأورام، وكذلك الكيفية التي سترد بسرعة الخلايا السرطانية للعلاج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تصوير المسلسل للحيوانات متعددة تبين توزيع مم أورام نخاع العظم انجرافتيد. وتحدد مناطق الاهتمام (ROI) لكل الماوس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: التغييرات في BLI انجرافتيد الأورام في الفئران وتد خلال نظام علاجية المضادة ملم. (أ) هذا الفريق يظهر تغيير في التألق متوسط (p/s/سم2/ser) في تيمسيروليموس (الماوس 20 مغ/كغ)-المعالجة وتد الفئران الطعن الرابع مع 5 × 106 خلايا. مرة واحدة ولوحظت الفئران أن تكون إيجابية بالنسبة للأورام انجرافتيد، أنها كانت عشوائية إلى مجموعات مختلفة من العلاج. أعطيت الفئران خمس IP حقن يوميا، تليها 2 أيام الراحة، وبعد ذلك، حقن IP خمسة إضافية تيمسيروليموس (أشرطة على المحور السيني تشير إلى أيام العلاج) أو التحكم بالسيارة. في أيام مختلفة، وأعطيت الفئران حقن IP من "المجراة في-الصف" لوسيفرين د، و BLI كانت تقاس باستخدام منصة تصوير ضوئي. وتمثل القيم ± التألق متوسط (p/s/سم2/ser) فاصل ثقة 95%. (ب) ارسم هذا كابلان-ماير يظهر التغيير في النسبة المئوية للفئران الباقين على قيد الحياة على مر الزمن. معاملة إنسانية وقد euthanized الفئران التي وصلت إلى نقطة النهاية المعايير (أي، خسارة > 10% من وزن الجسم أو الشلل أطرافهم هند). (ج) هذا الفريق يظهر الصور التمثيلية للفئران التي اتخذت في الأيام 28 و 35 و 40، تظهر التغييرات في نشاط لوك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: تصوير المسلسل والتغيرات النسبية في استيعاب 18وفدج بالحيوانات الأليفة/قيراط (أ) هذا الفريق يظهر المسلسل تصوير الماوس نفسها للتصوير بالإضاءة الحيوية (بصري تصوير/X-أشعة) وامتصاص 18وفدج BLI الحيوانات الأليفة/قيراط وتم قياس في الفئران تخديره، والتصوير PET/CT الماوس نفسه أنجز 24 ساعة في وقت لاحق. الفأرة صاموا بين عشية وضحاها، واليوم من الدراسة، وتلقى حقنه الرابع 50 µCi 18وفدج. الفئران وأبقى تحت التخدير أثناء الاحتضان امتصاص مسبار (60 دقيقة)، وبعد ذلك، تم تحليل لاستيعاب 18وفدج بتحليل PET/CT. يتم الإشارة إلى الأورام (T1 و T2). ح = القلب، K = الكلي، و B = المثانة. (ب) هذا الفريق يوضح التغيرات النسبية (بنسبة مئوية من مراقبة علاج الأورام) في استيعاب 18وفدج في السيطرة على الفئران (أي علاج) أو تيمسيروليموس (الماوس 20 مغ/كغ)-معاملة الفئران (مقيسا بأيام 22 و 35 و 40). يتم تقديم البيانات كالمتوسط (n = 5 الفئران) ± 1 المرسوم العالي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وعلى الرغم من مجموعة متنوعة من نماذج إكسينوجرافت الإكلينيكية من ملم6،،من911،،من1213، لا تزال القدرة على دراسة التفاعلات الورم/بي أم داخل المكروية BM صعبة 14-الأساليب الموصوفة هنا تسمح ل engraftment السريع واستنساخه من خلايا الأورام 8226-لوك في الهيكل العظمى للفئران وتد.
وتشارك الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول إنشاء خطوط الخلايا مم الإعراب عن لوسيفراس والتحقق من التعبير عن لوسيفراس في المختبر15بشكل مستقر. متى أنشئت خطوط الخلية، وتحدي وتد الفئران بحقن الرابع، ويتأكد engraftment الأورام إلى هيكل عظمى بالقياس BLI النشاط في فيفو (عادة خلال 10-20 يوما بوستشالينجي) (الشكل 1A). استخدام الفئران وتد مهم لسلالات العوز الأخرى (مثل إيماءة/مشمولان) لا تشكل عادة الأورام انجرافتيد بي أم. معدل نجاح مرتفع نسبيا لغرس (> 90%) والفاصل الزمني القصير لمراقبة إشارة إيجابية BLI يجعل هذا النموذج المثالي لإجراء تحليل الفائق والطولية للطرائق العلاجية المضادة-مم (الشكل 4). جانب آخر هام جداً من هذا النموذج أن خطوط الخلية مم BM انجرافتيد تحافظ على خصائصها المورفولوجية والمناعية لخطوط الخلية الأصل (مثلاً، 8226، U266)؛ أنماط النمو المتسق واستنساخه ويحمل خصائص المريض من الأمراض، مثل زيادة بارابروتين مستويات المصل مفتش البشرية والتشكيل من الآفات العظام.
وميزة هذه الاستراتيجية هو الاستفادة من هذه التقنيات التصوير القوية لدراسة المكونات الكيميائية الحيوية والجزيئية المكروية الورم/BM مرارا وتكرارا على مدى تطور المرض واستجابة للعلاجات المضادة للورم. في هذه التجربة، وجدنا أن استهداف نشاط mTOR في الفئران بأورام انجرافتيد BM الورم النخاعي نتج عنه انخفاض في طرحه من القياسات التي يمكن ملاحظتها على مر الزمن. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن التغييرات في استيعاب للتحقيق 18وفدج (الشكل 6B) في هذه الأورام نفسها كانت ترتبط بالتغيرات في إشارة طرحه (الشكل 5 (ب)). عنصر حاسم آخر من هذا الإجراء أنه يمكن قياس المتغيرات البيوكيميائية متعددة داخل الورم على مر الزمن. وهذا أهمية خاصة نظراً لتطور الورم عملية دينامية تتسم بحدوث تغييرات في الخصائص الفيزيولوجيا والمكرويه الورم. وهكذا، يسمح هذا الإجراء، بسبب طبيعته غير الغازية ونصف عمر قصيرة نسبيا من التحقيقات، للتحليلات الطولية متعددة من التغييرات استجابة الورم للعلاج.
وبعد إتقان هذه التقنية، تقدم التطبيقات المستقبلية للتقنية قدرا كبيرا من المرونة. على سبيل المثال، استخدام العلامات الأخرى طرحه أو الفلورسنت (مثلاً، الأجسام المضادة الموسومة فلوريسسينتلي) يمكن أيضا أن تستخدم، كما يمكن مختلف المسابر المسمى و 18والمركبات الصيدلانية للدراسة الخاصة بالكيمياء الحيوية الأخرى العمليات في المكروية الورم/بي أم أو مسارات. بسبب أن نصف العمر القصير للعديد من هذه راديونوكليوتيديس، يمكن إجراء قياسات المسلسل متعددة أثناء تجربة محددة لدراسة الإقبال على المخدرات وتوزيعها، وحركية، وتسوس. استخدام هذا النموذج إكسينوجرافت، مم قادرة على الاستفادة من تحلل لا هوائية وغيرها الأيضية (أي، تركيب الأحماض الدهنية) باستخدام المجسات الأخرى (مثلاً،18ومخفضات-2deoxyglucose]18وفدج] و 18 F-fluoro-4-thia-palmitate [FTP])16،17، فضلا عن القدرة على قياس آثار مكافحة التكاثري للعلاج باستخدام آخر على نطاق واسع استخدام مسبار (أي3 '-ديوكسي-3'-[18و] فلوروثيميديني [ 18أنطوني و]) يمكن تضمينها في النماذج التجريبية. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون من الممكن قياس موت الخلية مباشرة باستخدام 18B1 و أنيكسين لقياس المبرمج في فيفو18. كثير من هذه المركبات المتاحة تجارياً.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكاتب فرانسيس كيفن موظف بيركن المر.
Acknowledgments
هذا العمل وأيده grant1I01BX001532 "الجدارة خامسا" من "الولايات المتحدة إدارة المحاربين القدماء الشؤون الطبية مختبر البحوث" وتطوير خدمة (بلردس) للجبهة الوطنية، والمفوضية الأوروبية تعترف بالدعم من (خامسا السريرية العلم والتطوير خدمة د تستحق جائزة I01CX001388)، وخامساً إعادة التأهيل R & د خدمة (I01RX002604 جائزة الجدارة). جاء المزيد من الدعم من "منحة البذور كلية جامعة كاليفورنيا" إلى جي هذه المحتويات لا تمثل بالضرورة آراء إدارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكي أو الحكومة الأمريكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8226 human myeloma cell line | ATCC | CCL-155 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG) | Jackson Labs | 5557 | |
| VivoGlo Luciferin substrate | Promega | P1041 | |
| Hypoxyprobe-1Kit | HPL | HP1-100 | |
| PE-CD45 (clone H130) | BD Biosciences | 555483 | Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate |
| rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q) | Cell Signaling Technology | 70527 | Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated) | ABCAM | ab205718 | Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| pGL4.5 Luciferase Reporter Vector | Promega | E1310 | |
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Sofie G8 PET/CT Imaging System | Perkin Elmer |
References
- Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Multiple Myeloma. The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).
- Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease. BoneKEy Reports. 1, 135 (2012).
- Anderson, K. C., Carrasco, R. D.
- Reagan, M. R., Rosen, C. J. Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction. Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).
- Frost, P., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis. Journal of Oncology. 2013, 897025 (2013).
- Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity. Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).
- Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy. Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).
- Campbell, R. A., et al. Laglambda-1: A Clinically Relevant Drug Resistant Human Multiple Myeloma Tumor Murine Model That Enables Rapid Evaluation of Treatments for Multiple Myeloma. International Journal of Oncology. 28 (6), 1409-1417 (2006).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of a New Model of Human Multiple Myeloma Using Nod/Scid/Gammac(Null) (Nog) Mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (2), 258-262 (2004).
- Ito, M., et al. Nod/Scid/Gamma(C)(Null) Mouse: An Excellent Recipient Mouse Model for Engraftment of Human Cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Frost, P., et al. In Vivo Antitumor Effects of the Mtor Inhibitor Cci-779 against Human Multiple Myeloma Cells in a Xenograft Model. Blood. 104 (13), 4181-4187 (2004).
- Asosingh, K., et al. Role of the Hypoxic Bone Marrow Microenvironment in 5t2mm Murine Myeloma Tumor Progression. Haematologica. 90 (6), 810-817 (2005).
- Storti, P., et al. Hypoxia-Inducible Factor (Hif)-1alpha Suppression in Myeloma Cells Blocks Tumoral Growth in Vivo Inhibiting Angiogenesis and Bone Destruction. Leukemia. 27 (8), 1697-1706 (2013).
- Fryer, R. A., et al. Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment. PLoS One. 8 (2), e57641 (2013).
- Gould, S. J., Subramani, S. Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology. Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).
- Czernin, J., Phelps, M. E. Positron Emission Tomography Scanning: Current and Future Applications. Annual Review Medicine. 53, 89-112 (2002).
- Pandey, M. K., Bhattacharyya, F., Belanger, A. P., Wang, S. Y., DeGrado, T. R. Pet Imaging of Fatty Acid Oxidation and Glucose Uptake in Heart and Skeletal Muscle of Rats: Effects of Cpt-1 Inhibition. Circulation. 122 (21), (2010).
- Wang, M. W., et al. An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation. Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).
