Multimodala självlysande och Positronic-emission Tomography/Computational tomografisk avbildning av multipelt myelom benmärgen xenograft i NOG möss
Summary
Här använder vi självlysande, röntgen, och positron-emission tomography/beräknade datortomografi imaging för att studera hur hämmande mTOR aktivitet påverkar benmärgen-rekonstituerades myelom tumörer i xenograft modell. Detta möjliggör fysiologiskt relevanta, icke-invasiv och multimodala analyser av anti myelom effekten av behandlingar riktar sig benmärgen-rekonstituerades myelom tumörer i vivo.
Abstract
Multipelt myelom (MM) tumörer engraft i benmärgen (BM) och deras överlevnad och progression är beroende av komplexa molekylära och cellulära interaktioner som finns inom denna mikromiljö. Ännu vara den BM närmiljön inte enkelt replikerade i vitro, vilket potentiellt begränsar den fysiologiska betydelsen av många i vitro och ex vivo experimentella modeller. Dessa problem kan övervinnas genom att utnyttja en xenograft modell i vilken luciferas (LUC)-transfekterade 8226 MM celler kommer specifikt engraft i mus skelettet. När dessa möss ges lämpliga substrat, kan D-luciferin, effekter av terapi på tumörtillväxt och överlevnad analyseras genom att mäta förändringar i självlysande bilder (BLI) producerad av tumörer i vivo. BLI data kombinerat med positronic-emission tomography/computational tomografi (PET/CT) analys metabola märkpenna 2-deoxy – 2-(18F) fluoro-D-glukos (18F-FDG) används för att övervaka förändringar i tumör metabolism över tid. Dessa imaging plattformar möjliggör flera noninvasiv mätningar inom den tumör/BM mikromiljö.
Introduction
MM är en obotlig sjukdom som består av maligna plasma B-celler som infiltrera BM och orsaka bendestruktion, blodbrist, nedsatt njurfunktion och infektion. MM gör upp 10-15% av alla hematologiska maligniteter1 och är den vanligaste cancerformen att involvera de skelett2. Utvecklingen av MM härstammar från de onkogena omvandlingen av långlivade plasmaceller som är etablerade i den stilbildande centrerat av lymfvävnad innan så småningom homing till BM3. BM kännetecknas av ytterst heterogen nischer; inklusive olika och viktiga cellulära komponenter, regioner låg pO2 (hypoxi), omfattande vaskularisering, komplexa extracellulära matriser och cytokin och tillväxtfaktor nätverk, alla bidrar till MM tumorgenesis4. Utvecklingen av en disseminerad MM xenograft-modellen som kännetecknas av tumörer som är strikt rekonstituerades i BM skulle således vara ett mycket kraftfullt och kliniskt relevanta verktyg att studera MM patologi i vivo5,6. Många tekniska hinder kan dock begränsa effektiviteten i de flesta xenograft-modeller, vilket gör dem dyra och svåra att tillämpa. Detta inkluderar problem med enhetliga och reproducerbara tumör engraftment inom den BM nischen, en förlängd tid till tumörutveckling och begränsningar i möjligheten att direkt observera och mäta förändringar av tumör tillväxt/överlevnad utan att behöva offra möss under loppet av de experiment7,8.
Detta protokoll används en modifierad xenograft-modell som utvecklades ursprungligen av Miyakawa o.a. 9, i som en intravenös (IV) utmaning med myelomceller resulterar i ”sprids” tumörer som konsekvent och reproducibly engraft i BM av NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) möss10. I situ visualisering av dessa tumörer sker genom den stabila transfection i det 8226 mänskliga MM cell med en LUC allel och seriellt mäta förändringar i BLI producerad av dessa rekonstituerades tumör celler6. Viktigast av allt, kan denna modell utökas för att utnyttja olika andra LUC-uttrycka mänskliga MM cellinjer (t.ex., U266 och OPM2) med en liknande benägenhet att specifikt engraft i skelettet av NOG möss. Identifiering av tumörer av självlysande avbildning av mössen följs genom att mäta upptaget av radioaktiva sonder (till exempel 18F-FDG) av PET/CT. tillsammans, möjliggör detta ytterligare karakterisering av kritiska biokemiska vägar (dvs, förändringar i ämnesomsättningen, förändringar i hypoxi och induktion av apoptos) inom den tumör/BM mikromiljö. De stora styrkan i denna modell kan belysas av tillgången till ett brett utbud av radiomärkt, självlysande och fluorescerande sonder och markörer som kan användas för att studera MM progression och patologi i vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trots en mängd prekliniska xenograft-modeller MM6,9,11,12,13fortfarande möjligheten att studera tumören/BM interaktioner inom den BM mikromiljö svårt 14. de metoder som beskrivs här tillåt för den snabba och reproducerbara engraftment av 8226-LUC tumörer celler i skelettet av NOG möss.
De kritiska s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av en VA MERIT grant1I01BX001532 från det USA Institutionen för veteraner frågor biomedicinsk laboratorieforskning och utveckling Service (BLRDS) att P.F. och E.C. erkänner stöd från den VA klinisk vetenskap R & D Service ( Merit Award I01CX001388) och VA rehabilitering R & D Service (Merit Award I01RX002604). Ytterligare stöd kom från UCLA fakulteten utsäde bidrag till J.K. Dessa innehållet representerar inte nödvändigtvis åsikter oss Department of Veterans Affairs eller den amerikanska regeringen.
Materials
| 8226 human myeloma cell line | ATCC | CCL-155 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG) | Jackson Labs | 5557 | |
| VivoGlo Luciferin substrate | Promega | P1041 | |
| Hypoxyprobe-1Kit | HPL | HP1-100 | |
| PE-CD45 (clone H130) | BD Biosciences | 555483 | Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate |
| rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q) | Cell Signaling Technology | 70527 | Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated) | ABCAM | ab205718 | Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| pGL4.5 Luciferase Reporter Vector | Promega | E1310 | |
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Sofie G8 PET/CT Imaging System | Perkin Elmer |
References
- Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Multiple Myeloma. The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).
- Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease. BoneKEy Reports. 1, 135 (2012).
- Anderson, K. C., Carrasco, R. D. Pathogenesis of Myeloma. Annual Review of Pathology. 6, 249-274 (2011).
- Reagan, M. R., Rosen, C. J. Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction. Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).
- Frost, P., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis. Journal of Oncology. 2013, 897025 (2013).
- Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity. Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).
- Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy. Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).
- Campbell, R. A., et al. Laglambda-1: A Clinically Relevant Drug Resistant Human Multiple Myeloma Tumor Murine Model That Enables Rapid Evaluation of Treatments for Multiple Myeloma. International Journal of Oncology. 28 (6), 1409-1417 (2006).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of a New Model of Human Multiple Myeloma Using Nod/Scid/Gammac(Null) (Nog) Mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (2), 258-262 (2004).
- Ito, M., et al. Nod/Scid/Gamma(C)(Null) Mouse: An Excellent Recipient Mouse Model for Engraftment of Human Cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Frost, P., et al. In Vivo Antitumor Effects of the Mtor Inhibitor Cci-779 against Human Multiple Myeloma Cells in a Xenograft Model. Blood. 104 (13), 4181-4187 (2004).
- Asosingh, K., et al. Role of the Hypoxic Bone Marrow Microenvironment in 5t2mm Murine Myeloma Tumor Progression. Haematologica. 90 (6), 810-817 (2005).
- Storti, P., et al. Hypoxia-Inducible Factor (Hif)-1alpha Suppression in Myeloma Cells Blocks Tumoral Growth in Vivo Inhibiting Angiogenesis and Bone Destruction. Leukemia. 27 (8), 1697-1706 (2013).
- Fryer, R. A., et al. Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment. PLoS One. 8 (2), e57641 (2013).
- Gould, S. J., Subramani, S. Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology. Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).
- Czernin, J., Phelps, M. E. Positron Emission Tomography Scanning: Current and Future Applications. Annual Review Medicine. 53, 89-112 (2002).
- Pandey, M. K., Bhattacharyya, F., Belanger, A. P., Wang, S. Y., DeGrado, T. R. Pet Imaging of Fatty Acid Oxidation and Glucose Uptake in Heart and Skeletal Muscle of Rats: Effects of Cpt-1 Inhibition. Circulation. 122 (21), (2010).
- Wang, M. W., et al. An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation. Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).
