Summary
Hier verwenden wir Biolumineszenz, Röntgen und Positronen-Emissions-Tomographie/berechnet Tomographie Bildgebung wie hemmende mTOR-Aktivität zu studieren Auswirkungen des Knochenmarks pfropfte Myelom Tumoren in einem Xenograft-Modell. Dies ermöglicht eine physiologisch relevante, nicht-invasive und multimodalen Analysen der Anti-Myelom-Wirkung von Therapien gezielt Knochenmark pfropfte Myelom Tumoren in Vivo.
Abstract
Multiples Myelom (MM) Tumoren Einheilungschancen im Knochenmark (BM) und ihr Überleben und ihren Verlauf sind abhängig von komplexen molekularen und zellulären Interaktionen, die innerhalb dieser Mikroumgebung vorhanden sind. Noch dürfen nicht der BM Mikroumgebung leicht replizierten in Vitro, die potenziell die physiologische Relevanz viele in-vitro- und ex-Vivo experimentelle Modelle beschränkt. Diese Probleme können überwunden werden, durch die Verwendung eines Xenograft-Modells in die Luciferase (LUC)-transfizierten Zellen 8226 MM werden speziell in der Maus Skelett Einheilungschancen. Wenn diese Mäuse das entsprechende Substrat gegeben sind, kann durch Messung der Biolumineszenz Bilder (BLI) produziert von den Tumoren in VivoD-Luciferin, die Auswirkungen der Therapie auf Tumorwachstum und überleben analysiert werden. Eine Zusammenführung dieser Daten BLI mit positronic-Emissions-Tomographie/computergestützte Tomographie (PET/CT) Analyse mit dem metabolischen Marker 2-Deoxy - 2-(18F) Fluoro-D-Glucose (18F-FDG) wird verwendet, um Veränderungen im Stoffwechsel Tumor im Laufe der Zeit zu überwachen. Diese bildgebenden Plattformen ermöglichen mehrere nichtinvasive Messungen innerhalb der Tumor/BM Mikroumgebung.
Introduction
MM ist eine unheilbare Krankheit, bestehend aus bösartigen Plasma B-Zellen, die die BM zu infiltrieren und Knochenabbau, Anämie, Niereninsuffizienz und Infektion verursachen. MM macht sich 10-15 % aller malignen hämatologischen Erkrankungen1 und ist die häufigste Krebserkrankung, das Skelett2einzubeziehen. Die Entwicklung von MM ergibt sich aus der onkogenen Transformation der langlebigen Plasmazellen, die in den germinal Zentren der lymphatischen Geweben hergestellt werden, bevor Sie schließlich an die BM3homing. Die BM zeichnet sich durch sehr heterogen Nischen; wie vielfältige und kritischen zelluläre Komponenten, Regionen der niedrigen pO2 (Hypoxie), umfangreiche Vaskularisierung, komplexen extrazellulären Matrizen und Cytokine und Wachstumsfaktoren Netzwerke, die auf MM Tumorgenesis4beitragen. Somit wäre die Entwicklung eines disseminierten MM Xenograft-Modells zeichnet sich durch Tumoren, die streng in der BM aufgeprägt sind ein sehr mächtiges und klinisch relevante Werkzeug MM Pathologie in Vivo5,6zu studieren. Zahlreiche technische Hürden können jedoch die Wirksamkeit der meisten Xenograft-Modelle, so dass sie kostspielig und schwierig anzuwenden einschränken. Dazu gehören Probleme im Zusammenhang mit konsistent und reproduzierbare Tumor Engraftment innerhalb der BM-Nische, eine längere Zeit zur Entwicklung von Tumoren und Einschränkungen in der Fähigkeit, direkt beobachten und Messen von Veränderungen der Tumor Wachstum/überleben ohne Opfern Sie Mäuse im Verlauf des Experiments7,8.
Dieses Protokoll verwendet eine modifizierte Xenograft-Modell, das ursprünglich von Miyakawa Et Al. entwickelt wurde 9, in denen eine intravenöse (IV) Herausforderung mit Myelom-Zellen ergibt "verbreitet" Tumoren, die konsequent und reproduzierbar in BM NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) Mäuse10weiterhin. Die in Situ -Visualisierung dieser Tumoren wird erreicht, indem die beständigen Transfection 8226 menschlichen MM-Zell-Linie mit einem LUC Allel und seriell messen die Veränderungen in der BLI durch diese eingepflanzt Tumor Zellen6produziert. Wichtig ist, kann dieses Modell erweitert werden um verschiedene andere LUC exprimierenden menschlichen MM Zelllinien (z. B.U266 und OPM2) zu verwenden mit einer ähnlichen Neigung, speziell in das Skelett von NOG Mäusen Einheilungschancen. Die Identifizierung der Tumoren durch Biolumineszenz-Bildgebung der Mäuse gefolgt wird durch die Messung der Aufnahme von radiopharmazeutischen Sonden (z. B. 18F-FDG) von PET/CT zusammen, dadurch für zusätzliche Charakterisierung von kritischen biochemischen wegen (z.B. Veränderungen im Stoffwechsel, Änderungen in Hypoxie und die Induktion der Apoptose) innerhalb der Tumor/BM Mikroumgebung. Die großen Stärken dieses Modells können hervorgehoben werden, durch die Verfügbarkeit einer breiten Palette von radioaktiven, Biolumineszenz und fluoreszierende Sonden und Markierungen, die verwendet werden können, um MM Fortschreiten und Pathologie in Vivozu untersuchen.
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Protocol
Alle tierische nachstehend beschriebene Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Verwendung Committee (IACUC) von den größeren Los Angeles VA Healthcare System genehmigt und steril und Pathogen-freies Bedingungen durchgeführt wurden.
1. Vorbereitung der Luciferase exprimierenden 8226 Zellen (8226-LUC)
- Pflegen der menschlichen MM Zelllinie 8226 in RPMI-1640 Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid (CO2) ergänzt.
- Stabile LUC exprimierenden Reporter 8226 Zellen zu generieren von transfecting 1 x 106 8226 Zellen mit einem Luciferase Reporter Vektor, gefolgt von einer Auswahl mit Hygromycin (100-350 mg/mL) wie oben beschrieben6.
- Pflegen Sie die Zellen unter sterilen Kultivierung Standardbedingungen für 2-3 Wochen, ändern des Mediums täglich, bis die Einrichtung einer stabil transfizierten 8226 Zelllinie generiert wurde.
- Bestätigen Sie die in-vitro- Luciferase-Aktivität in 1 x 106 transfizierten Zellen/100 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch Zugabe des Substrates Luciferase, D-Luciferin (150 µg/mL Arbeitslösung in vorgewärmte Kulturmedium), und die Messung der Biolumineszenz der Zellen in einem Reagenzglas oder einer 96-Well-Platte mit einem Luminometer6.
(2) orthotopen Xenograft-Modell
- Pflegen Sie NOG Mäuse (4-6 Wochen alt, männlich oder weiblich) unter sterilen/Pathogen-freies Bedingungen in einer Einrichtung für entsprechende Pflege der Tiere.
- IV-Injektion in die NOG Mäuse (~ 5 x 106 Zellen/Maus) am Tag des Experiments 8226 LUC-transfizierten Zellen vorbereiten. Waschen Sie die Zellen 3 X in eiskaltem PBS, zählen sie, und sie in eiskaltem PBS (minus Antibiotika und FBS) auf eine Endkonzentration von 5 x 106 Zellen/200 µL PBS Aufschwemmen) in ein steriles Röhrchen. Halten Sie die Zellen auf dem Eis und fordern Sie die Mäuse so schnell wie möglich (innerhalb von 30-120 min).
- Betäuben Sie die Maus (mit Isofluran, 1 % - 3 % in der Luft bei 0,5 - 1 L/min) zu und legen Sie das Tier in Rückenlage auf ein Heizkissen mit dem Kopf nach entfernt. Überprüfen Sie die Höhe der Anesthetization durch Kneifen der Zehs. Ophthalmologische Salbe auf die Augen anwenden.
- Die 8226-LUC-Zellen in den Mäusen durch die Rute Vene (200 µL/Injektion) mit einer 1 mL Spritze mit Insulin und eine 26-G-Nadel zu injizieren.
Hinweis: Eine Wärmelampe kann verwendet werden, um Rute, damit die Vene Dilatation und Erhöhung der Wirksamkeit von Injektionen warm. - Zurückkehren Sie das Tier zu ihrem Hause Käfig und überwachen Sie die Tiere zu, bis sie sich vollständig erholt haben.
- Bestätigen Sie das Engraftment 8226-LUC Zellen in der Maus Skelett durch Messung der BLI bei narkotisierten Mäusen (unten beschrieben und dargestellt in Abbildung 1A).
Hinweis: BM Exsudate können auch für menschliche CD45 Ausdruck mit Durchflusszytometrie (Abbildung 1 b) oder durch die Immunohistochemistry geernteten Knochen (Abbildung 1) gebeizt werden.
3. Messung der BLI In Vivo
Hinweis: In der Regel messbar BLI aus eingepflanzt-Tumoren in Mäusen beobachtet werden erste zwischen 10-20 Tage Postchallenge, aber dies kann experimentell ermittelt werden müssen.
- Betäuben Sie die Maus (mit Isofluran, 1 % - 3 % in der Luft bei 0,5 - 1 L/min) zu und überprüfen Sie die Höhe der Anesthetization durch Kneifen der Zehs. Gelten Sie ophthalmologische Salbe für die Augen.
- Geben Sie dem Tier eine IP-Injektion (200 µL/Injektion) von "in-Vivo-Grade" D-Luciferin Substrat (30 mg/mL in sterilen Kochsalzlösung verdünnt).
- Die BLI innerhalb von 5-10 Minuten nach der Injektion von Luciferin Substrat (obwohl die BLI-Aktivität in den Mäusen für bis zu 45-60 min zu beobachten sein kann) zu messen, indem man das narkotisierten Tier in Rückenlage in einem kleinen Tier-imaging-System (Abbildung 2 ). Wählen Sie leuchtende und Röntgenstrahlanalyse und Abrufen von Bildern (Abbildung 3).
- Messen Sie die durchschnittliche Ausstrahlung (Photonen/s/cm2/steradian) in ausgewählten Regionen von Interesse (ROIs) über imaging-Software (Abbildung 4).
- Das Tier in seiner Heimat Käfig zurück und überwachen, bis es vollständig erholt hat (ca. 15-20 min).
4. Behandlung der Mäuse mit gezielten Therapie
- Messen der Grundlinie BLI und zufällig die Tiere in Behandlungsgruppen (4-8 Mäuse/Gruppe).
- Behandeln Sie die Mäuse mit einer IP-Injektion (200 µL/Injektion) Temsirolimus (0,2 - 40 mg/kg Maus) mit einer Therapie mit fünf täglichen Injektionen der IP gefolgt von 2 Tage der Ruhe und eine zusätzliche fünf täglichen Injektionen von11.
- Messen die Luciferase-Aktivität (Photonen/s/cm2/steradian) 2 X pro Woche wie in Abschnitt 3 und Grundstück von der BLI Umrüstzeit beschrieben. Änderungen im Tumor kann BLI als serielle Bilder von den Mäusen (Abb. 5 b) vorgestellt werden.
Hinweis: Es wird empfohlen, dass die tägliche Überwachung der Tiere durchgeführt werden, bis sie die folgenden Symptome (in der Regel innerhalb von 45-60 Tage der ersten Challenge) präsentieren: Gewicht Verlust (Verlust von mehr als 10 % bezogen auf das Gewicht vor der Implantation) und/oder Hind Extremität Lähmung, zu welchem Zeitpunkt sie mit einer CO2 Kammer gefolgt von zervikale Dislokation eingeschläfert werden sollte.
5. PET/CT-Analyse mit 18F-FDG nach Maß im Tumor Stoffwechsel ändert
- Schnell die Tiere in ihrer Heimat Käfig durch das Entfernen ihrer Nahrung für 24 h vor dem Experiment, überschüssige unspezifischen Aufnahme von 18F-FDG zu vermeiden.
- Bereiten Sie 18F-radioaktiv FDG-PET-Sonden (50-100 µCi/Injektion in steriler Kochsalzlösung) am Tag des Experiments. Nehmen Sie die Zeit und die Aktivität des Prüfpunkts 18F-FDG mit ein Dosis-Kalibrator.
Hinweis: Da das 18F hat eine relativ kurze Halbwertszeit (~ 2 h), müssen eine sorgfältige Vorbereitung und Planung für die Verwendung von diesen Proben hergestellt werden. - Betäuben Sie das Tier (mit Isofluran, 1 % - 3 % in der Luft bei 0,5 - 1 L/min) zu und legen Sie sie in Rückenlage auf ein Heizkissen mit dem Kopf nach entfernt. Überprüfen Sie die Höhe der Anesthetization durch Kneifen der Zehs. Gelten Sie ophthalmologische Salbe für die Augen.
- Injizieren der Sonde über die Rute Vene (100 µL/Injektion) mit eine abgeschirmte 1 mL Insulin Spritze und Nadel eine 26-G.
Hinweis: Eine Wärmelampe kann verwendet werden, um Rute, damit die Vene Dilatation und Erhöhung der Wirksamkeit von Injektionen warm. - Messen Sie die verbleibenden Radioaktivität in der Nadel/Spritze in eine Dosiseichgerät und beachten Sie die Aktivität und die Zeit.
Hinweis: Die Standardisierung der Maus Inkubation, Dosierung und Timing ist wichtig, Daten Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit zu gewährleisten. - Pflegen Sie die Mäuse unter Narkose und bei 37 ° C mit einem Heizkissen während des gesamten Zeitraums der Sonde Aufnahme (~ 45-90 min).
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Mäuse bleiben ruhenden und bei 37 ° C, unspezifische Aufnahme der Sonde zu vermeiden. - Staffeln Sie die Injektionen des Prüfpunkts 18F-FDG in ca. 20 - 30 min Intervallen um ähnliche Kennzeichnung Zeiten bei den Mäusen zu gewährleisten.
Hinweis: Richtige Workflow und Timing der Sonde Injektionen optimale und reproduzierbare imaging Bedingungen führen. - Messen Sie die 18F-FDG-Aktivität eines PET/CT Small Animal imaging Systems in ausgewählten Regionen von Interesse, die eingepflanzt Tumoren (Abbildung 6) entsprechen.
Hinweis: Zunächst ein 10-min statische PET Belichtung und eine 2-min CT Belichtung empfohlen, aber die genaue Belichtungszeiten müssen experimentell bestimmt werden. - Die Tiere in ihrer Heimat Käfige zurück und überwachen sie erst vollständig erholt. Haus der Mäuse in einem eigenen Rückkehr Saal für 24 h während der Sonde zerfällt, Hintergrund-Niveaus.
Hinweis: Wegen der kurzen Halbwertszeit von 18F, können mehrere Messungen mit einer frischen Sonde regelmäßig 2 X pro Woche erfolgen.
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Representative Results
In ersten Pilotstudien entwickeln IV Injektionen von 8226-LUC Zellen in NOD/SCID Mäuse nicht BM pfropfte MM Tumoren, obwohl plattenepithelialen Tumoren MM leicht waren (100 % Erfolgsquote) gebildet. Im Gegensatz dazu erzeugt IV Herausforderungen mit 8226 Zellen in NOG Mäuse (innerhalb von 15-25 Tage) Tumoren im Skelett (und nur selten geformte Tumoren im nicht-Skelett Gewebe, wie z.B. der Leber oder Milz). Da Tumoren des Skeletts nicht visuell bestätigt werden konnte durch die physisch Untersuchung der Tiere, musste andere Methoden berücksichtigt werden, um erfolgreiche Tumor Engraftment und die Lage der Tumoren innerhalb des BM (Abbildung 1) zu bestätigen. Ähnlich wie die Berichte von Miyakawa Et al. 9, menschliche IgG, produziert von 8226 Zellen konnte nachgewiesen werden, im Serum von herausgefordert NOG Mäuse mittels ELISA (Daten nicht gezeigt), obwohl diese Daten nur Engraftment und nicht die Position oder die Ausdehnung der Tumoren bestätigt. Serielle Bildgebung von mehreren Tieren zeigt die Verteilung der BM pfropfte MM Tumoren (Abbildung 4). Die BLI produziert durch diese pfropfte Tumor Zellen können dann werden seriell und nicht-invasiv gemessen, um Änderungen im Tumor-Wachstum und das Überleben in Mäuse behandelten mit dem mTOR-Inhibitor Temsirolimus (Abbildung 5) zu beurteilen. Schließlich diente PET/CT-Analyse für die Aufnahme von 18F-FDG in den Tumoren zeigen Temsirolimus-vermittelte Änderungen in Glukose-Stoffwechsel und dass dies mit Veränderungen im Wachstum des Tumors (Abbildung 6 korreliert). Allerdings konnte durch stabil transfecting 8226 Zellen mit einer Luciferase-Allel in Verbindung mit einer optischen Bildgebung/X-ray Analyse, die genaue Lage und Verteilung der MM-Tumoren in der Maus Skelett schnell und nicht-invasiv ermittelt werden.
Abbildung 1: Bestätigung der Engraftment 8226-LUC Zellen in der Maus Skelett. (A) NOG Mäuse wurden aufgefordert, mit 5 x 106 8226-LUC2 Zellen IV (Maus auf der linken Seite) oder mit Kochsalzlösung (Maus auf der rechten Seite). Nach 15 Tagen die Mäuse erhielten eine IP-Injektion von D-Luciferin Substrat und mit einem kleinen Tier-imaging-System abgebildet. (B) die Mäuse wurden geopfert, die Oberschenkelknochen wurden gesammelt und dem BM zellulären Exsudat geerntet wurde. Der Ausdruck der menschlichen CD45 wurde durch Durchflusszytometrie mit einem PE-konjugierten Anti-Human CD45 Antikörper bestimmt. (C) dieses Panel zeigt eine immunhistochemische Schnittserien der Maus Oberschenkelknochen gebeizt für Hypoxie mit Pimonidazole (Paneele) oder menschliche CD45 (untere Platten) bei Mäusen mit 8226 (richtigen Platten) in Frage gestellt oder Kochsalzlösung (Kontrolle, linken Platten). Das Sternchen gibt den Speicherort der ein großes Blutgefäß in den Schnittserien. Die Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: narkotisierten NOG Mäuse zeigen Positionierung in der imaging-System vor der Messung die BLI signal aus dem Knochenmark pfropfte MM Tumoren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Aufbau der optischen Abbildung und Röntgenstrahlanalyse des Biolumineszenz-Signals von NOG Mäuse gesammelt. Sobald die Tiere erfolgreich angefochten haben und das Engraftment von Tumoren in der BM bestätigt wurde, können die Mäuse in Behandlungsgruppen randomisiert werden. Die Tiere können zu verschiedenen Zeiten im Laufe des Experiments für Änderungen in der BLI überwacht werden. Da das Verfahren nicht-invasive ist, könnte die Häufigkeit der Überwachung geändert werden, um das erwartete Wachstum von Tumoren, sowie zu reflektieren, wie schnell die Krebszellen auf die Therapie reagieren werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: serielle Bildgebung von mehreren Tieren zeigt die Verteilung von Knochenmark pfropfte MM Tumoren. Die Regionen von Interesse (ROI) für jede Maus werden identifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Änderungen in der BLI eingepflanzt-Tumoren in Mäusen der NOG während einer Anti-MM therapeutische Therapie. (A) dieses Panel zeigt eine Veränderung in der durchschnittlichen Strahlen (p/s/cm2/ser) Temsirolimus (20 mg/kg Maus)-behandelten Mäusen NOG IV mit 5 x 106 Zellen gefordert. Sobald die Mäuse positiv für eingepflanzt Tumoren beobachtet wurden, wurden sie in verschiedenen Behandlungsgruppen randomisiert. Die Mäuse erhielten fünf IP-Injektionen täglich, gefolgt von 2 Tage Ruhe und dann eine weitere fünf IP-Injektionen von Temsirolimus (die Balken auf der X-Achse zeigen die Tage der Behandlung) oder Fahrzeugkontrolle. An verschiedenen Tagen erhielten die Mäuse IP-Injektionen von "in-vivo-Note" D-Luciferin und die BLI wurde mittels einer optischen Bildgebungsplattform gemessen. Die Werte entsprechen den durchschnittlichen Ausstrahlung (p/s/cm2/ser) ± ein 95 %-Konfidenzintervall. (B) das Kaplan-Meier-Plot zeigt die Veränderung in Prozent der Überlebenden Mäuse im Laufe der Zeit. Mäuse, die die Endpunkt-Kriterien (d.h. einen Verlust von > 10 % des Körpergewichts oder hinteren Extremität Lähmung) erreicht hatten wurden Human eingeschläfert. (C) dieses Panel zeigt repräsentative Bilder von Mäusen genommen an den Tagen 28, 35 und 40, Änderungen in der LUC-Aktivität. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Serielle Bildgebung und relative Änderungen in den 18F-FDG-Aufnahme durch PET/CT (A) dieses Panel zeigt serielle Bildgebung der gleichen Maus Biolumineszenz (optische Bildgebung/X-ray) Bildgebung und 18F-FDG-Aufnahme durch PET/CT BLI wurde bei narkotisierten Mäusen gemessen und die PET/CT-Bildgebung der gleichen Maus 24 h später durchgeführt wurde. Die Maus über Nacht gefastet und am Tag der Studie erhielt eine IV-Injektion von 50 µCi 18F-FDG. Die Mäuse wurden unter Narkose während der Sonde Aufnahme Inkubation (60 min) gepflegt und dann für 18F-FDG Aufnahme von PET/CT-Analyse analysiert wurden. Tumoren (T1 und T2) sind angegeben. H = Herz, K = Niere und B = Blase. (B) dieses Panel zeigt relative Änderungen (in Prozent der unbehandelten Kontrolle Tumoren) in die 18F-FDG-Aufnahme im Steuerelement Mäuse (keine Behandlung) oder Temsirolimus (20 mg/kg Maus)-behandelten Mäuse (gemessen am Tage 22, 35 und 40). Die Daten werden als Mittelwert dargestellt (n = 5 Mäusen) ± 1 S.D. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Trotz einer Vielzahl von präklinischen Xenograft Modelle MM6,9,11,12,13bleibt die Fähigkeit, die Tumor/BM-Interaktionen innerhalb der BM Mikroumgebung schwierig 14. die hier beschriebenen Techniken ermöglichen die schnelle und reproduzierbare Engraftment 8226-LUC Tumoren Zellen in das Skelett von NOG Mäusen.
Die entscheidenden Schritte in diesem Protokoll beteiligt die Einrichtung der Luciferase exprimierenden MM Zell-Linien und die Überprüfung der eine stabile Expression der Luciferase in-vitro-15. Sobald die Zelllinien etabliert, NOG Mäuse durch IV Injektion gefordert werden und das Engraftment von Tumoren an das Skelett wird durch Messung der BLI Aktivität in Vivo (in der Regel innerhalb von 10-20 Tage Postchallenge) bestätigt (Abbildung 1A). Die Verwendung von NOG Mäuse ist wichtig, weil andere immungeschwächte Stämme (z. B. NOD/SCID) nicht in der Regel BM pfropfte Tumoren bilden. Die relativ hohe Erfolgsquote bei der Implantation (> 90 %) und das kurze Intervall, ein positives Signal BLI zu beobachten macht dieses Modell ideal für eine Hochdurchsatz- und longitudinale Analyse der Anti-MM therapeutischen Modalitäten (Abbildung 4). Ein weiterer sehr wichtiger Aspekt dieses Modells ist, dass die BM pfropfte MM Zelllinien pflegen ihre morphologischen und immunologischen Eigenschaften der übergeordneten Zelllinien (z. B.8226, U266); Sie haben konsequent und reproduzierbare Wachstumsmuster und weisen Merkmale von Patienten Krankheiten, wie die zunehmende menschliche IgG Paraproteine Serumspiegel und die Bildung von Knochenläsionen.
Der Vorteil dieser Strategie ist die Nutzung dieser mächtigen bildgebender Verfahren, biochemische und molekulare Komponenten der Tumor/BM Mikroumgebung wiederholt im Laufe der Fortschreiten der Krankheit und als Reaktion auf Anti-Tumor-Therapien zu studieren. In diesem Experiment fanden wir, dass targeting mTOR Aktivität bei Mäusen mit BM pfropfte Myelom Tumoren eine Abnahme der Biolumineszenz Messungen ergeben, die im Laufe der Zeit beobachtet werden konnte. Darüber hinaus fanden wir, dass Veränderungen bei der Aufnahme des Prüfpunkts 18F-FDG (Abb. 6 b) in dieser gleichen Tumoren zu Veränderungen in der Biolumineszenz Signal (Abbildung 5 b) korreliert waren. Ein weiterer wesentlicher Bestandteil dieses Verfahrens ist, dass mehrere biochemische Variablen innerhalb der Tumor im Laufe der Zeit gemessen werden können. Dies ist besonders wichtig, weil Tumorprogression ein dynamischer Prozess durch Veränderungen im Tumor Physiologie und Mikroumgebung Merkmale gekennzeichnet ist. So erlaubt dieses Verfahren wegen seiner nicht-invasive Art und die relativ kurze Halbwertszeit der Sonden, für mehrere Längsschnittanalysen von Veränderungen in der Tumor-Ansprechens auf die Therapie.
Nach Beherrschung der Technik, präsentieren die zukünftigen Anwendungen der Technik ein hohes Maß an Flexibilität. Beispielsweise könnte die Verwendung von anderen Biolumineszenz oder fluoreszierende Tags (z.B. Eindringmittel tagged Antikörper) auch genutzt werden, wie verschiedene andere 18F-markierten Sonden und radiopharmazeutischen Verbindungen zu spezifischen biochemischen studieren konnte, Wege oder Prozesse in der Mikroumgebung Tumor/BM. Wegen der kurzen Halbwertszeit von vielen dieser Radionucleotides konnte mehrere serielle Messungen im Laufe eines bestimmten Experimentes erfolgen, Medikament Aufnahme, Verteilung, Kinetik und Verfall zu studieren. Mit Hilfe dieses Xenograft-Modells, die Fähigkeit von MM, anaerobe Glykolyse und andere Stoffwechselwege (d.h. Fettsäure-Synthese) nutzen mit anderen Sonden (z. B.,18F-Fluoro-2deoxyglucose [18F-FDG] und 18 F-Fluoro-4-Thia-palmitate [FTP])16,17, sowie die Fähigkeit zur Messung der Anti-proliferative Effekte der Behandlung mit einem anderen allgemein verwendeten Sonde (d.h., 3'-Deoxy-3'-[18F] Fluorothymidine [ 18F-FLT]) in den Versuchsanordnungen aufgenommen werden können. Darüber hinaus kann es direkt messen Zelltod durch Apoptose in Vivo18Messung mit 18F-Annexin B1 möglich. Viele dieser Verbindungen sind im Handel erhältlich.
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Disclosures
Der Autor Kevin Francis ist ein Mitarbeiter von Perkin-Elmer.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine VA-Verdienst-grant1I01BX001532 von der Vereinigte Staaten Abteilung der Veteranen Angelegenheiten biomedizinische Laborforschung und Entwicklung Service (BLRDS), P.F und E.C. erkennt an Unterstützung aus dem VA klinische Wissenschaft R & D Service ( Merit Award-I01CX001388) und VA Rehabilitation R & D Service (Merit Award I01RX002604). Weitere Unterstützung kam von einem UCLA Fakultät Seed Grant, j.k. Diese Inhalte repräsentieren nicht unbedingt die Meinung der uns Department of Veterans Affairs oder der US-Regierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8226 human myeloma cell line | ATCC | CCL-155 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG) | Jackson Labs | 5557 | |
| VivoGlo Luciferin substrate | Promega | P1041 | |
| Hypoxyprobe-1Kit | HPL | HP1-100 | |
| PE-CD45 (clone H130) | BD Biosciences | 555483 | Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate |
| rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q) | Cell Signaling Technology | 70527 | Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated) | ABCAM | ab205718 | Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| pGL4.5 Luciferase Reporter Vector | Promega | E1310 | |
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Sofie G8 PET/CT Imaging System | Perkin Elmer |
References
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