一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学
Summary
(EC) 腸クロム親和性細胞は、消化管上皮細胞の小さなサブセットを構成します。EC 細胞は電気的興奮性、まだ養殖と EC 細胞を識別する難しさは、生理学的研究を限られているセロトニンを解放します。ここで紹介した方法は、電気生理学によって初代培養モデル単一の EC 細胞の検査を受けやすいを確立します。
Abstract
腸クロム親和性 (EC) 胃腸の (GI) 粘膜上皮細胞 enteroendocrine 細胞の最も大きい subpopulation を構成します。専門にされた感覚的な細胞として EC 細胞内腔刺激を感知し、セロトニン (5-hyroxytryptamine、5 HT) リリース イベントに変換します。ただし、文化と特定することは困難であるために、これらの細胞の電気生理学はよくわかっていません。この論文概要主な EC 細胞培養の手法は、単一細胞の電気生理学の最適化されています。このプロトコルでは、電圧と電流クランプ モードでセル全体を電気生理学の高品質の録音を取得するアプローチを進める混合の初代培養マウス EC 細胞を識別するために遺伝子組換えシアン蛍光蛋白質 (CFP) 記者を利用しています。
Introduction
胃腸の (GI) 上皮は、いくつかの細胞の種類から成る多様なコミュニティです。Enteroendocrine 細胞を構成するほぼすべての上皮細胞の 1%、(EC) クロム親和細胞 enteroendocrine 細胞人口1の最大。最近の研究では、enteroendocrine2と EC3,4細胞が電気的興奮を示します。主な EC 細胞電気生理学を理解することに興味を持っております。したがって、本研究の目的は、全細胞の電気生理学のために最適化されたプライマリ EC 細胞培養を確立するだった。
生産 5-HT (例えばQGP 15BON6:KRJ 17) を分泌すると電気生理学5,8を調べるに使用されている行は、通常から生成されます既存の EC 細胞不死化腫瘍組織。これらの細胞から得られる情報は貴重な5,8一次電池電気生理学の研究が EC 細胞生理学を正しく理解する必要です。一次の EC 細胞の電気生理学には、分離と上皮文化の低い生存率によって制限されており、単一の上皮細胞の培養が必要です。
本論文で示した培養法は、Tph1 CFP9、この研究で使用されるのような蛍光に分類された EC 細胞を持つトランスジェニック マウスに依存します。メソッドの最適化混合プライマリ上皮文化を開発した単一細胞の電気生理学32,10 。以前の方法酵素消化のトリプシン EDTA/プラス コラゲナーゼ A または EDTA と DTT の組み合わせ、特に特定し文化11モルモットおよびラット EC 細胞12密度勾配を使用します。もっと最近、腸 organoids が生成され、機械的に電気生理学的記録4中断します。セロトニン Rt-qpcr 分析実験をリリースし、生理、使用できる時間がかかる organoid 世代、EC 細胞を識別するために密度勾配の成功に依存して、これらのメソッドを使用してカルチャが適していて、トリプシンと EDTA の細胞の破壊的な効果。対照的に、ここで説明されているプロトコルは、酵素、力学的処理を向上し、培養条件を最適化、シングルと健全な EC 細胞電気生理学に必要な高い携帯電話規格に適合を生成するための手順を合理化します。
このメソッドは、プライマリ EC 細胞不死化文化よりもむしろ混合文化の仕事をしたいし、単一細胞の電気生理学を調査する科学者の役に立つでしょう。ただし、並べ替えまたは長期的な文化サバイバル過去 72 時間を必要とする必要がありますセル人口の勉強はあまり適して証明するかもしれない。
Protocol
Representative Results
Discussion
完全に EC 細胞機能を理解すると、全細胞電気生理学のための細胞を生成する高品質培養法が必要です。消化管上皮初代培養は、低い生存のため従来難しかった。この交絡要因を緩和する、現在メソッドは、数日間存続が可能な小規模または大規模な腸から単数形の EC 細胞の培養を生成します。
次が電気生理学に合うように文化の質の向上にとって重要なことが分かった…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、行政支援のため夫人リンゼイ バズビーとメイヨー クリニック部門のエンジニア リング設計と文化料理挿入の 3 D プリントから氏ロバート感じてありがとうございます。この作品は、AB と NIH 消化器 (NIH P30DK084567) と 2015 アメリカ消化器病協会研究学者賞 (AGA RSA) における細胞シグナル伝達の NIH K08 AB (DK106456)、パイロット、メイヨー クリニックから AB に可能性の助成金によって支えられました。GF (DK52766) に R01。
Materials
| High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
| Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
| 100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
| MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
| Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
| Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
| Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| 3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| Electrophysiology Equipment | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
References
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