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Biology

Électrophysiologie germes entiers de cellules entérochromaffines murins cultivés primaires

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58112
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1, 1
1Enteric Neuroscience Program, Division of Gastroenterology & Hepatology,Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Cellules entérochromaffines (EC) composent un petit sous-ensemble de cellules épithéliales gastro-intestinale. Cellules EC sont électriquement excitables et libérer la sérotonine, mais des difficultés dans la mise en culture et en identifiant les cellules EC ont limité des études physiologiques. La méthode présentée ici établit un modèle de culture primaire se prêtent à l’examen des cellules individuelles de EC en électrophysiologie.

Abstract

Cellules entérochromaffines (EC) dans l’épithélium de la gastro-intestinal (GI) constituent la plus grande population de cellules entéroendocrines. Comme les cellules sensorielles spécialisées, cellules EC sentiment stimuli luminales et convertissent en événements de libération de la sérotonine (5-hyroxytryptamine, 5-HT). Toutefois, l’électrophysiologie de ces cellules est mal comprise parce qu’ils sont difficiles à culture et à identifier. La méthode présentée dans ce document contours primaire EC des cultures cellulaires optimisés pour l’électrophysiologie cellulaire unique. Ce protocole utilise un reporter de la protéine fluorescente cyan transgéniques (CFP) pour identifier les cellules EC souris dans des cultures primaires mixtes, faire progresser la démarche pour obtenir des enregistrements de haute qualité d’électrophysiologie de germes entiers dans les modes de bride de tension et de courant.

Introduction

L’épithélium gastro-intestinal de (GI) est une communauté diversifiée composée de plusieurs types de cellules. Cellules entéroendocrines représentent environ 1 % de toutes les cellules épithéliales et les cellules entérochromaffines (EC) sont la population des cellules entéroendocrines plus grand1. Des études récentes montrent qu’entéroendocrines2 et3,4 cellules EC sont électriquement excitables. Nous sommes intéressés par la compréhension primaire électrophysiologie cellulaire EC. Ainsi, le but de cette étude était d’établir les cultures primaires de cellules EC optimisés pour l’électrophysiologie de cellules entières.

Existant cellules EC lignes qui produisent et sécrètent la 5-HT (p. ex., QGP-15, BON6, KRJ-1,7) et ont été utilisés pour examiner l’électrophysiologie5,8 proviennent généralement des immortalisé néoplasiques tissus. Alors que l’information acquise de ces lignées cellulaires est précieux5,8, études d’électrophysiologie cellulaire primaire sont nécessaires pour bien comprendre la physiologie des cellules EC. L’électrophysiologie de cellules primaires de EC nécessite l’isolement et la culture de cellules épithéliales isolées, qui a été limitée par la faible viabilité des cultures épithéliales.

La méthode de culture présentée dans cette étude s’appuie sur des souris transgéniques avec des cellules EC fluorescent étiquetés, comme Tph1-CFP9, utilisée dans cette étude. La méthode optimise primaires mixtes épithéliales cultures développées antérieurement2,10 pour unicellulaire électrophysiologie3. Méthodes précédentes combinaisons de trypsine/EDTA plus de collagénase A ou de EDTA et de TNT servant de digestion enzymatique et des gradients de densité permettant d’isoler spécifiquement et culture cobaye11 et rat EC cellules12. Plus récemment, organoïdes intestinales ont été générés et mécaniquement perturbés pour les enregistrements électrophysiologiques4. Cultures à l’aide de ces méthodes sont bien adaptés pour libérer des expériences, analyse de la RT-qPCR sérotonine et, alors qu’ils pourraient être utilisés pour l’électrophysiologie, dépendent de la réussite de votre temps organoïde génération, gradients de densité pour identifier les cellules EC et la cellulaires effets perturbateurs de la trypsine et d’EDTA. En revanche, le protocole décrit ici améliore les traitements enzymatiques et mécaniques, optimise les conditions de culture et rationalise les procédures afin de produire des cellules EC simples et sains pour les hauts standards cellulaires nécessaires pour l’électrophysiologie.

Cette méthode sera utile pour les chercheurs qui veulent travailler sur des cellules primaires de EC dans des cultures mixtes au lieu des cultures immortalisées et souhaiter examiner l’électrophysiologie de cellules individuelles. Toutefois, il peut s’avérer moins approprié pour l’étude des populations de cellules qui ont besoin de tri ou à long terme des cultures nécessitant une survie dernière 72 h.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de la clinique Mayo. La partie de la culture de cellules primaires du présent protocole est basée sur des méthodes publiées antérieurement qui peuvent être référencés pour plus de détails10. Toutes les procédures expérimentales doivent être approuvés par le (IACUC), et toutes les expériences doivent être effectuées conformément aux règlements et aux lignes directrices pertinentes.

1. préparation de la culture

  1. Les médias.
    1. Préparation des milieux de culture complète ce cellulaire avec forte concentration de glucose moyen d’Eagle modifié [4500mg/L] Dulbecco (DMEM) additionné de 5 % de sérum bovin fœtal (SVF), 1 % L-Glutamine et 1 % la pénicilline-streptomycine (tableau 1).
      NOTE : Les médias peuvent être stockés à 4 ° C pour environ un mois.
    2. Filtrer les milieux de culture complète ce cellulaire et placer 25 mL de médias dans un tube de 50 mL à 37 ° C.
    3. Préparer les milieux de la digestion avec forte concentration de glucose [4 500 mg/L] DMEM supplémenté de 0,1 % Bovine Serum Albumin (BSA) (tableau 1).
    4. Filtrer les médias de la digestion et quatre 10 ml de médias dans des tubes distincts de 50 mL et incuber dans un bain-marie à 37 ° C.
      NOTE : Les médias peuvent être stockés à 4 ° C pour environ un mois.
  2. Enzyme.
    1. Peser à 4 mg (pour le jéjunum) ou 24 mg (pour deux points) de collagénase XI [≥800 unités/mg] dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
      NOTE : Collagénase est stable à-20 ° C jusqu'à un an.
    2. Resuspendre le collagénase aliquote dans 1 mL de PBS froid glace avec Ca2 + et Mg2 +. Vortex la solution pour bien combiner et placer sur la glace.
  3. Plaques de revêtement de Culture.
    1. Décongelez les 150 µL de matrice extracellulaire durant la nuit à 4 ° c sur la glace.
    2. Faire une solution de matrice extracellulaire 5 % p/v en mélangeant 100 µL de matrice extracellulaire dégelée avec 2 mL de glacee DMEM sans sérum haute-glucose.
      Remarque : La matrice extracellulaire se solidifie à température ambiante et doit être manipulée avec préalablement réfrigérées pipettes, tubes et supports jusqu'a son manteau plats.
    3. Immédiatement, enduire le cercle intérieur de verre de mets 35 mm fond en verre avec 250 µL de la solution de la matrice extracellulaire de 5 %. Cette recette couvrira jusqu'à 8 plats.
    4. Placez les plats de fond en verre dans un incubateur à 37 ° C durant les étapes d’isolement de culture cellulaire restantes. La matrice extracellulaire prend un minimum de 1 h à définir, mais peuvent être incubés jusqu'à 2,5 h tout en effectuant d’autres mesures d’isolement.
      NOTE : Incubations plus longtemps que 3 h peuvent créer une accumulation de matrice extracellulaire qui pourrait nuire à sceller de formation au cours de l’électrophysiologie de cellules entières.

2. tissu isolement

  1. Selon les lignes directrices éthiques, sacrifier un 3à 6 semaines mâle ou femelle Tph1-CFP souris transgénique (le Stock de laboratoire Jackson : 028366)9 ou une autre souche de journaliste.
    Remarque : Nous utilisons une dose fatale de l’élévation du niveau de dioxyde de carbone et une dislocation cervicale secondaire signifie pour s’assurer de la mort. La Commission AVAM euthanasie estime également dislocation cervicale une méthode d’euthanasie primaire permise par des individus formés à son utilisation, si les animaux sont tout d’abord sous sédation.
  2. Épinglez la souris euthanasiée dehors sur une scène de dissection mousse de polystyrène à l’aide d’aiguilles 21 G. Décontaminer l’abdomen de la souris avec l’éthanol à 70 %.
  3. Tendre la peau de souris à l’aide de micro-dissection forceps (#5) et ensuite utiliser des ciseaux chirurgicaux tranchants à pratiquer une incision transversale au bas de l’abdomen de la souris pour exposer la cavité intrapéritonéale. Faire une autre incision verticalement vers le haut de l’abdomen jusqu'à ce que la cage thoracique est exposée.
  4. Utilisez la pince micro-dissection pour déplacer le caecum à la gauche de la souris pour atteindre une vision claire du côlon.
  5. Les ciseaux micro-dissection permet de couper la partie la plus distale du côlon (mais toujours proximale du rectum) et faire une deuxième coupe distale de l’estomac. Place les intestins extraites dans un 100 x 15 mm2 Pétri remplis de 20 mL de phosphate glacee solution saline tamponnée (PBS).
  6. Utilisez une petite règle pour mesurer et découper 10 cm soit milieu du colon ou le jéjunum. Extrait du côlon en mesurant sur le segment de 10 cm d’intestin situé dans la partie proximale de la première coupe prise au-dessus du rectum. Identifier le jéjunum en pliant l’intestin entier en deux et faire une première incision à la mi-course et une seconde incision 10 cm proximaux à la première coupe.
    NOTE : Continuer d’effectuer toutes les étapes ultérieures d’isolation sur la glace.
  7. Remplir une seringue de 6 mL de PBS froid glace et placez l’aiguille de la seringue dans le lumen du segment intestinal extrait. Utilisez la pince micro-dissection pour fixer et sceller les intestins autour de l’aiguille de la seringue et rincer doucement 10 mL de PBS à travers la lumière pour rincer les matières fécales à l’extérieur.
  8. Inverser le tissu intestinal en tissant la pince micro-dissection à travers la lumière doucement, pincer une paroi intestinale et rétraction du tissu proximal à la pointe de la pince. Répétez ce processus jusqu'à ce que le segment est à l’envers avec la lumière vers l’extérieur.
  9. Ciseaux micro-dissection permet de couper le segment de tissu en morceaux de 1 cm.
  10. Micro-dissection forceps permet de transférer les segments de tissus dans un bécher de 50 mL rempli avec 5 mL de PBS stérile. Utilisez les ciseaux micro-dissection mâcher les morceaux de tissu à une consistance liquéfiée.
  11. Placez le tissu haché et 15 mL de PBS froid de glace dans un tube propre 50 mL par pipette de transfert. Broyer 2 fois avec la pipette de transfert, attendez que le tissu pour s’installer et remplacer par PBS frais prélever 15 mL du surnageant PBS. Répéter cette opération trois fois jusqu'à ce que le PBS est clair.
  12. Placer le tube de 50 mL avec des morceaux de tissus lavés sur la glace et mettre le bac à glaçons dans une hotte de culture de tissus.

3. enzymatique et mécanique de la Digestion

  1. Première digestion
    1. Du bain-marie, récupérer un des tubes de 50 mL contenant 10 mL de médias de digestion préchauffé. Le tube de 50 mL, ajouter 250 µL de solution de collagènase PBS et les morceaux de tissu intestinal hachées.
      Remarque : veiller à ne pas y compris les PBS des étapes précédentes de lavage.
    2. Placer le tube de 50 mL dans un bain d’eau pendant 5 minutes (côlon ou jéjunum) à 37 ° C. Agiter le tube 2 x / min.
      Remarque : Le moment optimal et l’intensité de la digestion mécanique peuvent varier et devront être déterminée par l’utilisateur. Pour déterminer les conditions d’une digestion optimale, une quantité de 10 µL de cellules peut être considérée après chaque digestion. Au cours de la Digestion 1, le liquide surnageant doit provenir des amas de cellules.
    3. Lentement, triturer le tissu une fois avec une pipette sérologique de 10 mL. Brièvement laisser le tissu régler les morceaux, puis utiliser une pipette de transfert pour enlever l’ensemble 10 mL du surnageant.
  2. Seconde digestion : Répétez les étapes 3.1.1 à 3.1.3. Augmenter le temps d’incubation de 10 min si digestion du côlon et garder le temps d’incubation à 5 min pour le jéjunum.
    NOTE : Sur observation, le surnageant devrait toujours être constituée de grands amas de cellules.
  3. Troisième digestion
    1. Répétez l’étape 3.1.1
    2. Placer le tube de 50 mL dans un bain d’eau de 37 ° c pendant 10 min (côlon ou petit jéjunum). Agiter le tube x 2-3 / min à une intensité plus élevée que les Digestions 1 et 2.
    3. Pipetter lentement le tissu avec une pipette sérologique de 10 mL, monter et descendre. Laisser les morceaux de tissu se contenter d’un peu de temps.
      Remarque : Le liquide surnageant doit se composer d’une combinaison de cellules individuelles et de petites touffes.
    4. Utiliser une pipette de transfert pour introduire 10 mL du surnageant dans un nouveau tube de 15 mL, ajouter 2 mL chauffé ce cellule complète de milieux de culture et inverser une fois pour bien mélanger.
    5. Faites tourner à 100 x g pendant 5 min à température ambiante, puis utiliser une pipette de transfert pour éliminer le surnageant. Utiliser une pipette de transfert pour Resuspendre le culot restant dans 2,5 mL chauffé ce cellule complète de milieux de culture.
  4. Quatrième digestion : Répétez les étapes 3.3.1 à 3.3.5. Augmenter le temps d’incubation de 15 min pour colon et rester à 10 min pour le jéjunum.
    Remarque : Le liquide surnageant doit se composer maintenant des cellules simples.

4. Culture cellulaire

  1. Utiliser une pipette de transfert pour combiner les suspensions de cellules prélevées dans les Digestions 3 et 4 dans un nouveau tube de 15 mL (volume total 5 mL).
  2. Enlever une quantité de 10 µL de cellules à compter avec un hémocytomètre et essorer la suspension cellulaire reste à 100 x g pendant 5 min à température ambiante.
    Remarque : La suspension cellulaire finale sera composé de petites touffes et cellules individuelles.
  3. Retirez le surnageant avec une pipette de transfert et Resuspendre le culot dans ce milieux de culture complet cellulaire à une densité de 1 000 000 cellules / mL.
    Remarque : Le dernier volume de suspension cellulaire dépendra du nombre d’éléments final. Les numérations typiques vont de 2 000 000 à 4 000 000.
  4. Sortir les récipients de culture de fond en verre revêtu de l’incubateur. Utiliser une pipette P1000 en remplacement de la matrice extracellulaire de chaque boîte de Pétri avec 250 µL de la suspension cellulaire finale.
    Remarque : Le revêtement de la matrice extracellulaire a tendance à coller sur les bords du plat fond en verre. Il faut en particulier afin d’éliminer la couche du long du bord pour éviter la formation de gel.
  5. Préparer une solution stock d’inhibiteur de ROCK Y-27632 à 1 mM. Ajouter 2,5 µL de solution mère à chaque plat de fond de verre pour réaliser une travail concentration d’inhibiteur de ROCK 10 µM dans chaque plat.
    Remarque : Cette étape est essentielle pour la survie des cultures de jéjunum mais est facultative pour le côlon.
  6. Placer chaque boîte de Pétri dans une étuve à2 CO 5 % et de 37 ° C pendant 24 à 72 h (Figure 1).

5. préparation des cellules EC pour l’électrophysiologie de cellules entières

  1. La ligne au diamètre intérieur de la platine du microscope avec deux bandes de 5 x 0,5 cm de film de cire pour créer un joint torique. Monter la boîte de Petri 35 mm cellule au sein de l’o-ring (Figure 2A-B).
  2. Rincer les deux débris flottants, tels que seules la matrice extracellulaire ou les cellules mortes et les milieux de culture sérum éloigner complètement des cellules EC afin d’empêcher ou d’entraver sceller la formation entre la cellule de l’EC et l’électrode. Utilisation des trois options suivantes pour atteindre la cellule complète de lavage suffisante pour l’électrophysiologie :
    1. Option 1 : Échange de Solution est plus efficace dans une enceinte longue de chambre plus ainsi qu’une circulaire. Puisque les cellules EC ont été cultivés dans des plats ronds de 35 mm, créer un insert en plastique elliptique pour le plat.
      1. Créer l’insert par impression 3D ou par des méthodes traditionnelles de fraisage. L’insert, nous avons utilisé a été blanchi de plastique acrylique avec les dimensions suivantes (en mm) : diamètre extérieur, 34,5 ; ellipse intérieure, 20 x 9 ; hauteur extérieure, 10 ; hauteur intérieure, 1,5 ; travée du pont, 3 x 3 ; garde au pont, 1,5 ; entrée et sortie, 4 x 4 de chaque.
      2. Abaissez l’encart dans la boîte de Petri (Figure 2A-B) et fixez-le en haut de la platine du microscope avec deux morceaux de 0,15 à 0,2 g de modeler pressé en 1,2 x 0,3 x 0,1 rectangles cm (Figure 2A-C).
      3. Avec une pipette en plastique, ajouter lentement solution extracellulaire d’un côté du plat (entrée) lors de l’aspiration de l’autre côté (sortie).
    2. Option 2 : Sans un insert en plastique machiné, ajouter extracellulaire solution en pipette de transfert d’un côté du plat (entrée) lors de l’aspiration du côté opposé (sortie). Tournez lentement l’emplacement de la pipette de transfert (par exemple, N e s) tout en reflétant le placement de l’aiguille d’aspiration sur le côté opposé (par exemple, S à W à N).
    3. L’option 3 : Matrice extracellulaire manteau sur lamelles rectangulaires à l’étape 1.3.3. et de la culture de la suspension cellulaire sur ces lamelles couvre-objet à l’étape 4.4. Transférer cette lamelle dans une chambre rectangulaire remplie de solution extracellulaire, omettant l’étape 5.1 et sauter l’étape 5.3. Rincer la chambre avec la solution extracellulaire d’une pipette en plastique, comme décrit dans l’Option 1 (5.2.1.3).
  3. Rattachez la scène avec la culture de cellules au-dessus du microscope inversé (Figure 2D). Incuber la culture de cellules EC dans une solution sans sérum extracellulaire à température ambiante.
  4. Après 4 heures, rincer la culture avec solution extracellulaire comme décrit ci-dessus. Procéder à l’électrophysiologie de cellules entières.

6. toute cellule électrophysiologie de cellules EC de Culture primaire

  1. Atteindre une cellule entière Giga-seal
    1. Tirez une douzaine électrodes pour une résistance de 1 à 5 MΩ.
      NOTES : Pipettes de 1 à 2 résistance de MΩ qui donnent 10 et 100 GΩ joints fonctionnent mieux. Les extrémités des électrodes de polissage au feu n’est pas nécessaire à la réalisation de joints GΩ.
    2. Enrober uniformément la coiffe de tous les pipettes avec polymère. Tenir la pipette à l’horizontale pour le sol et perpendiculairement à l’avant d’un pistolet à air chaud. Tournez lentement la pipette jusqu'à ce que le polymère se durcit.
    3. Versez une partie aliquote de la solution intracellulaire dans un tube conique de 15 mL. Transfert de 1,2 mL de cette solution dans un tube de microtubes de 1,5 mL par seringue de 1 mL. Retirer un autre 0,7 mL de solution intracellulaire dans la seringue. Dissiper l’air de l’extrémité de la seringue. Attacher un flexible 34 G, l’aiguille de la seringue, 67 mm et purgez l’air restant de cette aiguille.
    4. Identifier un Tph1-CFP + cellule qui n’est pas en contact avec une autre cellule ou débris.
    5. Remplissez la pointe de l’électrode avec solution intracellulaire. Remblayer la pipette par seringue. Soigneusement effleurer la pipette avec un ongle à dissiper l’interface de bulle d’air.
    6. Avec le piston élaboré avec 0,3 mL d’air, fixer une seringue 6 mL à la sortie du porte-tubes. Monter l’électrode dans le support.
      Remarque : Raccorder la seringue à la tubulure avant que l’électrode entre dans la solution du bain pour maintenir une pression neutre ou positive au sein de la solution intracellulaire avant le scellage.
    7. Charger un protocole de voltage clamp en deux étapes qui enregistre stationnaire activant courants au moyen d’une échelle de tension sur la première marche et enregistre les courants disponibles par une tension unique lors de la deuxième étape. Ouvrez le test d’étanchéité (5 mV à 50 kHz).
    8. Abaissez l’électrode dans la solution du bain. Avec les micromanipulateurs, manoeuvrer l’électrode pointe dans le plan avec et directement horizontale de la cellule. Expulser les 0,3 mL d’air de la seringue.
    9. Déplacer doucement l’électrode horizontalement le long de l’axe des abscisses au toucher de la cellule. Vous recherchez une fossette à apparaissent sur la cellule EC et/ou une augmentation de résistance de la membrane sur le test d’étanchéité. Si nécessaire, réajuster l’électrode vers le bas le long de l’axe z et/ou horizontalement le long de l’axe des abscisses, ne pas dépasser la ligne médiane de la cellule.
    10. Appliquer de 0,1 à 0,2 aspiration mL sur la seringue de 6 mL. Stabilisez le plongeur jusqu'à l’obtention de MΩ 100, puis relâchez la poignée de plongeur. Attendez que la cellule de giga-seal. Doucement, déconnecter la seringue avec un mouvement de dévissage.
      Remarque : Si une cellule EC ne pas sceller au départ, il peut être possible de re-sceller avec une tentative ultérieure. Pour ce faire, tirez doucement l’électrode loin une cellule EC avec < 20 résistance joint MΩ. Direction l’électrode usé avec les micromanipulateurs, naviguer autour de la cellule EC ciblée à matrice manuellement clear away ou débris. Ensuite, tenter de sceller la cellule EC avec une électrode de frais.
  2. Record à germes entiers voltage-dépendants Na+ actuel.
    1. Fixez une seringue de 3 mL avec 0,5 à 1,0 air mL. Appliquer un robinet rapide de succion (0,1 à 0,5 mL) sur une seringue de 3 mL. Répéter jusqu'à l’obtention d’un accès à germes entiers, puis détacher doucement la seringue.
      Remarque : comme la performance d’une seringue peut varier au départ et changer progressivement avec le temps et l’usage, pratique au préalable avec la seringue de 3 mL (la fin avec un index d’étanchéité) pour s’assurer que le piston sera recul au sein de 0,1 à 0,2 mL de son départ du poste. Si ce n’est pas le cas, puis échanger la seringue pour un nouveau.
    2. Allumez la compensation de capacité de cellules entières. Ajuster la série et la capacité de résistance. Tourner sur la compensation de la résistance série. Lag fixé à 60 ms, régler la compensation de résistance de série prévus puis corrigée. Fermer le test d’étanchéité.
    3. Enregistrer une moyenne de 5 passages du courant de Na+ cellule entière voltage-dépendants (Figure 3A).
    4. Rapidement prendre note des deux paramètres de voltage-dépendants de courant Na+ : la tension à la fenêtre actuelle (Figure 3B, symboles rouges, à l’intersection des courbes d’activation et l’inactivation d’équilibre) et le courant de crête Na+ densité.
      NOTE : EC cellules avec courants de Na+ de crête plus de pA-50 en mode pince tension couramment s’allume au feu potentiels ont incité au mode actuel de pince. En outre, courants supérieurs à pA-200 dans la bride de tension (Figure 3A), puis généralement feu potentiels d’action spontanément dans la pince de courant de potentiels de membrane (ligne rouge, Figure 3D) près de la tension de la fenêtre actuelle (symboles rouges, Figure 3B).
  3. Dossier a suscité des potentiels d’action.
    1. Désactiver la compensation de la résistance série. Désactiver la commande externe. Changez le mode de V-pince à je-pince. Ajuster le gain. Charger un protocole épisodique de pince actuel. Ajuster la quantité de courant à 0 PA. Allumez le système de commande externe.
      ATTENTION : N’allumez pas de V-pince à je-pince (ou inversement) sans d’abord mettre hors tension le système de commande externe.
    2. Notez le potentiel membranaire de repos. Ajuster la tenue actuelle d’entrée afin que le potentiel de membrane se lit sous la fenêtre actuelle (p. ex., -80 à -100 mV). Ajuster le protocole épisodique de la pince actuel afin que l’intervalle de l’étape d’entrée de courant est inférieure à la valeur de l’exploitation actuelle (Figure 3C médaillon, + 2 pA étapes pour pA-3 tenant actuel).
    3. Dossier a suscité des potentiels d’action. Noter la moindre quantité de courant injecté pour déclencher un potentiel d’action (Figure 3C, sweep 3 de 5, une étape + 4 pA de pA-3 holding = + 1 pA).
  4. Potentiels d’action spontanées Records.
    1. Désactiver la commande externe. Charger un protocole de pince actuel écart-libre (non-épisodique).
      Remarque : Ne tournez pas la commande externe sur jusqu'à ce que le montant de la tenue actuelle dans le protocole de pince exempte d’écart actuel a été vérifié pour convenir à la cellule.
    2. Changer la tenue actuelle à la quantité de courant injecté dans le dernier balayage dans le protocole ont incité qui a fait feu pas un potentiel d’action (Figure 3D, l’intensité absorbée au cours de la deuxième coupe-bise, une étape de pA + 2-3 PA holding = pA-1).
    3. Allumez le système de commande externe. Vérifiez bien que la tenue prévue courante apporte la membrane potentielle sous le seuil de tirer un potentiel d’action. Ajuster la tenue actuelle si nécessaire. Activité spontanée record.

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Representative Results

Cultures :
Des cellules épithéliales primaires murines fabriqués à partir d’un modèle transgénique de Tph1-CFP attachent à plats après 4 heures et sont prêts pour des expériences physiologiques entre 24 à 72 h. Lorsque les conditions de culture n’avaient pas été optimisées, la culture de cellules épithéliales se composait de grosses touffes, flottant des débris cellulaires et les membranes endommagées signal faible de PCP dans les cellules EC (Figure 1A). Les cultures qui ont été optimisés pour l’électrophysiologie se comprenaient de cellules individuelles et de petites touffes. Des cellules saines d’EC ont été facilement identifiés par fluorescence CFP vif et avaient toujours respecté le plat après le lavage vigoureux (Figure 1B).

Électrophysiologie :
Cellules entières d’EC ont été obtenues sur seulement 15 ±4 % des tentatives de cultures du côlon sans inhibiteur de la roche (29 cellules entières sur 182 tirs de 22 cultures) mais 30 ±7 % des tentatives de cultures du côlon avec inhibiteur de ROCK (27 cellules entières sur 102 tirs de 50 cultures) (< C1 > Figure 4A; p < 0,05 par bilatéral non paramétrique t-test, cultures du côlon sans vs avec inhibiteur de la roche). De même, jéjunum EC cellules sans inhibiteur de la roche n’a pas survécu assez longtemps pour l’électrophysiologie, tandis que EC cellules entières ont été obtenues sur 41 ±3 % des tentatives de culture de jéjunum avec inhibiteur (186 cellules entières sur 447 tentatives de 50 cultures) de la roche (Figure 4A; p > 0,05 par bilatéral non paramétrique t-test, jéjunum vs colon avec inhibiteur de la roche).

Par électrophysiologie de cellules entières, courants Na+ ont été enregistrés en mode voltage clamp et les potentiels d’action (AP) en mode courant-clamp. A enregistré les courants de Na+ de 81,3 % 4,0 TPH1-CFP + cellules de jéjunum ou 64,1 % de ±9.2 de deux points3. De 59 cellules EC de cultures de jéjunum confirmées par voltage clamp d’avoir des courants Na+ plus grands que pA-25, 19 cellules EC en mode courant-clamp ont tiré AP spontanée (« spontanée »), 29 cellules EC tiré AP uniquement lorsque stimulée par un protocole d’étape en courant-clamp mode (« obtenue uniquement ») et 11 cellules EC ne pas feu AP spontanément ou par étape protocole (« non-tir ») (Figure 4B). Les cellules spontanées ont une pointe moyenne Na+ densité de courant (PICi) de-108.0 ±19.3 pA/pF, cellules obtenue uniquement si un j’avaispointe de-60.2 ±9.2 pA/pF, tandis que les cellules non-TIR avait un jePIC de-43.3 ±14 pA/pF (Figure 4 B; p < 0,05, spontanée vs obtenue uniquement ou non tir groupes ; p > 0,05 obtenue uniquement le vs non-tir groupes). La différence dans les densités de courant n’était pas un reflet de la capacité de cellules entières, comme spontanée (3,3 ± 0,2 pF), a suscité uniquement (2,9 ± 0,2 pF) et non-TIR (3,1 ± 0,3 pF) cellules avaient ensemble similaire capacitances de cellules (P > 0,05). EC cellule Na+ courants et les AP ont incité sont sensibles à la concentrationo [Na+] et d’inhibition 1,3 NaV3.

Figure 1
Figure 1 : Un éventail représentatif des résultats des cultures. DIC avec des images d’une culture de jéjunum épithéliale primaire d’une souris Tph1-CFP épifluorescence plaqué sur un plat en verre bas et cultivé pendant 24 h. Ces deux images montrent issues de la culture de ce protocole. Cellules fluorescentes CFP (blancs) sont des cellules entérochromaffines (EC). (A) image représentative d’une culture qui est de mauvaise qualité pour l’électrophysiologie. La culture se compose de grosses touffes, endommagé des membranes cellulaires, le signal de fluorescence faible et flottant des groupes de cellules mortes. (B) image représentative d’une culture qui a été optimisée pour l’électrophysiologie. La culture se compose principalement de cellules simples, sains et de petites touffes qui ont adhéré à la plaque. Cellules EC dans cette culture maintiennent un signal de fluorescence forte. Echelle = 100 µm ; les panneaux sont mis à l’échelle 1:1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Préparation de cell cultures pour l’électrophysiologie. Une stratégie efficace et approfondie un rinçage de cultures de cellules EC avec une solution sans sérum extracellulaire est essentielle pour réduire la matrice extracellulaire et le sérum qui empêcherait la formation de joint. Matériaux (A). Vers la gauche, en haut à gauche : stade, deux bandes larges de 5 mm de film de cire, deux pièces de 200 mg de modeler l’argile, pipette en plastique, pinces #5, chambre d’enregistrement elliptique culture 35 mm plat à fond de verre. (B) respecter le film de cire pour le diamètre intérieur de la scène, abaissez la chambre elliptique dans la boîte de Petri et aplatir l’argile en bandes rectangulaires. (C) doucement enfoncez la boîte de Pétri dans la scène de film doublé de cire et immobiliser la chambre d’enregistrement par l’étirement de la glaise à modeler sur le bord du plat, de la chambre à l’étage. Rincer les cellules EC avec plusieurs volumes de solution extracellulaire. (D) retour au stade pour les supports de montage au-dessus du microscope inversé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résultats représentatifs électrophysiologie. (A) courants Na+ de cellules entières, enregistrés par un protocole de voltage clamp en deux étapes (en médaillon). 50 ms dépolarisations de -120 mV activer des canaux au cours de l' étape 1 (●), tout en une dépolarisation plue à 0 mV au cours de l' étape 2 (○) active les canaux qui n’avaient pas encore inactivé (c'est-à-dire, sont toujours disponibles pour ouvrir). Trace rouge, courant induite par la tension pas de -120 à -40 à 0 mV. Relation courant-tension (B) des courants de panneau A, Na+ l’étape 1 (●, activation de l’état d’équilibre) ou l’étape 2 (○, inactivation de l’état d’équilibre). L’intersection des courbes d’activation et l’inactivation stationnaire révèle une petite fenêtre actuelle à -40 mV (symboles rouges). Potentiels d’action (C) provoquées par des stimuli courants de dépolarisation. Un potentiel d’action peut se déclencher après 0 mV (ligne grise) lorsque le potentiel de membrane atteint la tension de fenêtre Na+ actuelle (ligne rouge, -40 mV). En médaillon, protocole courant-clamp, dans laquelle 0 à + 8 pA a été injecté pour dépolarisations 50-ms par rapport au niveau-3 PA. Un feu de potentiels d’action (D) au sommet des manifestations spontanées qui ont dépolarisé à -40 mV. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Débit d’électrophysiologie de cellules entières. (A) le pourcentage moyen des cellules entières par tentative de n jours de travail en absence (-) ou en présence (+) de l’inhibiteur de la roche (10 µM). Cellules EC jéjunum n’ont pas survécu 24h dans la culture sans inhibiteur de la roche. (B) Na+ des densités de courant mesurées en voltage clamp de n cellules EC, où les potentiels d’action a fait pas feu (Non-tir), déclenché uniquement lorsque les induites par un protocole courant-clamp épisodique (Elicited uniquement), ou tiré spontanément en mode gap-libre courant-clamp (spontanée) (barres d’erreur sont SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Bien comprendre la fonction des cellules EC requiert une méthode de culture primaire de haute qualité pour générer des cellules pour l’électrophysiologie de cellules entières. Les cultures primaires de l’épithélium de la GI ont toujours été difficiles en raison du faible taux de survie. Alléger ce facteur de confusion, la présente méthode rendements des cultures de cellules EC du singulier de l’intestin soit petite ou grande qui sont capables de survivre pendant plusieurs jours.

Nous avons trouvé que ce qui suit est critique pour l’amélioration de la qualité des cultures appropriées pour l’électrophysiologie : (1) inversion de la muqueuse plutôt que peeling il, (2) ajoutant une petite quantité de BSA pour les médias de la digestion et la FBS pour les milieux de culture, en diminuant les (3) la Concentration de collagénase XI, (4) réglage de la durée et l’intensité d’agitation mécanique pour augmenter le nombre et de la santé des cellules simples, (5) placage de la matrice extracellulaire à une concentration faible et (6), cultivant avec inhibiteur de la roche.

De même, les adaptations suivantes ont été essentielles pour l’obtention de cellules entières tout en patch de serrage : rincer (1) abondamment les cultures avec la solution sans sérum extracellulaire, (2) laisser le EC cellules debout dans la solution extracellulaire pendant au moins 4 h, (3). toute réorientation passé électrodes-comme celles du phoque échoué-pour dégager des débris en cours de route vers la cellule suivante des EC, (4) en ajoutant 10 µM Gd3 + à la solution extracellulaire pour bloquer les courants de fuite (le cas échéant) et pour faciliter l’adhérence des cellules de mammifères suspensions à verre. Nous mettons en garde, toutefois, que Gd3 + pourrait bloquer voltage-dépendants Ca2 + et/ou mécanosensibles chaînes exprimées dans les cellules EC.

Malgré avoir optimisé avec soin les conditions de culture, nous avons trouvé quelques limitations : cellules EC besoin 24h à entièrement attacher encore expirer après ~ 72 h en culture ; par conséquent, ils ont une fenêtre de 48 heures quand ils seraient aptes à des expériences électrophysiologiques. Car les cellules regroupées introduisent souvent transitoires de capacité qui ne peuvent être compensées à partir d’enregistrements, génération de simples cellules EC sont essentiels. Cependant, en séparant les cellules EC de l’épithélium, les cellules puis vivent dans un environnement non indigènes (c.-à-d.médias hyperglycémie avec sérum de veau fœtal et inhibiteur de la roche au sommet de la matrice extracellulaire comme une membrane de sous-sol artificielle) et pourraient répondre aux stimuli pas tout à fait représentatives de cellule EC function in vivo. Malgré ces limites, la mise en culture primaire de cellules EC encore donne un aperçu de leur physiologie.

Cellules EC jouent un rôle essentiel dans le maintien d’un bon fonctionnement digestif et le corps et à ce titre, il y a eu beaucoup de méthodes mises au point afin d’obtenir une compréhension de l’électrophysiologie cellulaire EC. Électrophysiologie cellules entéroendocrines et ce a été étudiée chez des cellules immortalisées modèles5,8,13, cultures de cellules primaires EC de cobaye11et souris3,4, notre méthode utilise les méthodes de maintien de la qualité de cellulaire pour créer une culture qui a été minimalement transformée et reflète les cellules EC natifs. Nous utilisons un modèle de souris transgénique, Tph1-CFP, qui montre une fluorescence cyan dans le cytoplasme quand Tph1 est présent9. Cette méthode peut aussi servir pour d’autres journaliste ou les types de cellules entéroendocrines tracée au lignage. Notre méthode réalise également l’isolement de cellules EC uniques dans un minimum de temps et le traitement enzymatique, comme les cellules ne sont exposés à une douce XI de collagénase à une concentration minimale mais efficace de 0,1 mg/mL (jéjunum) et 0,6 mg/mL (deux points) pour moins d’une heure. Le résultat de ces modifications est une culture qui a été optimisée pour des études électrophysiologiques des cellules EC.

Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour étudier la sortie électrophysiologie et de la sérotonine en murine EC cellules3. La capacité d’isoler avec succès, identifier et culture EC monocellules facilite importantes orientations futures études sur la physiologie des cellules EC. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer les chemins critiques et les voies impliquées dans l’exocytose de cellules EC de la sérotonine et autre ce émetteurs spécifiques des cellules. La méthode peut également être modifiée pour isoler et caractériser la physiologie de la cellule humaine d’EC ainsi que l’utilisation de l’acridine orange pour ce cellule identification13.

Comme pour l’élaboration de protocoles plus scientifique, communication et observations impartiales ont critiqué dans le dépannage du présent protocole. Lorsque nous avons testé les nouvelles méthodes de culture pour la survie de nos cultures, il a été utile pour compter le nombre de cellules fluorescentes en guise de viabilité, d’estimer la densité des cellules dans chaque plat et recueillir les images représentatives et vidéos des cultures au fil du temps beaucoup points. Après que les cellules ont pu survivre au-delà de 24 h en culture, nous avons travaillé sur la modification de nos cultures pour des expériences d’électrophysiologie. Ainsi que de recueillir des images et des observations détaillées, il est important de maintenir une communication claire entre le personnel de laboratoire concernant les ajustements à la digestion mécanique et supplément et les concentrations de substrat, afin que les cellules saines de EC étaient prêts pour la caractérisation électrophysiologique.

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Disclosures

Aucun

Acknowledgments

Les auteurs remercient Mme Lyndsay Busby pour l’assistance administrative et M. Robert Highet de Mayo Clinic Division d’ingénierie pour la conception et l’impression 3D de l’insert de plat de la culture. Ce travail a été soutenu par NIH K08 AB (DK106456), pilote et subvention de faisabilité à la DGA de Mayo Clinic Center pour la signalisation de cellules en gastroentérologie (NIH P30DK084567) et 2015 American Gastroenterological Association Research Scholar Award (AGA RSA) à AB et NIH R01 à GF (DK52766).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 15 mm culture dish Corning (Falcon) 351029
Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-7M
10 mL serological pipette Corning (Falcon)  357551
50 mL Conical Corning (Falcon)  352098
15 mL Conical Corning (Falcon)  352097
1,000 mL Barrier Pipet Tips Thermo Scientific (Art) 2079E Keep sterile
MatTek Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points Fine Science Tools SB12630M
Surgical Scissors-Sharp Nasco 14002-14
Micro-Dissection Scissors Nasco SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX Covidien 8881250172
 Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice Jackson Stock # 028366 Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) World Precision Instruments MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film Pechiney Plastic Packaging
R6101 Dow Corning
6 mL syringe with regular luer tip Monoject
3 mL syringe with regular luer tip Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200B
Data acquisition system (daq) Molecular Devices Digidata 1440A
Signal conditioner Molecular Devices CyberAmp 320
Software Molecular Devices pClamp 10.6

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References

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  2. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).
  3. Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
  4. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
  5. Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
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Biologie numéro 139 système digestif épithélium cellules entérochromaffines culture primaire électrophysiologie de cellules entières bride de tension pince ampèremétrique
Électrophysiologie germes entiers de cellules entérochromaffines murins cultivés primaires
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Knutson, K., Strege, P. R., Li, J., Leiter, A. B., Farrugia, G., Beyder, A. Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells. J. Vis. Exp. (139), e58112, doi:10.3791/58112 (2018).

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