प्राथमिक संस् Murine Enterochromaffin कक्षों की संपूर्ण कक्ष इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी
Summary
Enterochromaffin (ईसी) कोशिकाओं जठरांत्र उपकला कोशिकाओं का एक छोटा सा सबसेट शामिल हैं । चुनाव आयोग कोशिकाओं विद्युत उत्तेजित और जारी सेरोटोनिन, अभी तक संवर्धन में कठिनाइयों और ईसी सेल की पहचान है शारीरिक अध्ययन सीमित है । विधि यहां प्रस्तुत एक प्राथमिक संस्कृति इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वारा एकल ईसी सेल की परीक्षा के लिए उत्तरदाई मॉडल स्थापित करता है ।
Abstract
जठरांत्र (सैनिक) उपकला में Enterochromaffin (ईसी) कोशिकाओं enteroendocrine कोशिकाओं की सबसे बड़ी उपजनसंख्या का गठन. विशेष संवेदी कोशिकाओं के रूप में, चुनाव आयोग कोशिकाओं चमकदार उत्तेजनाओं भावना और उन्हें सेरोटोनिन में परिवर्तित (5-hyroxytryptamine, 5-एचटी) रिलीज की घटनाओं. हालांकि, इन कोशिकाओं की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी खराब समझी जाती है क्योंकि उन्हें कल्चर और पहचानने में मुश्किल होती है । इस पत्र में प्रस्तुत विधि प्राथमिक चुनाव आयोग सेल एकल सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए अनुकूलित संस्कृतियों की रूपरेखा । इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल एक ट्रांसजेनिक सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन () रिपोर्टर मिश्रित प्राथमिक संस्कृतियों में माउस चुनाव आयोग कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, वोल्टेज में पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के उच्च गुणवत्ता रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के दृष्टिकोण को आगे बढ़ाने-और वर्तमान क्लैंप मोड ।
Introduction
जठरांत्र (सैनिक) उपकला एक विविध कई प्रकार के सेल से मिलकर समुदाय है । Enteroendocrine कोशिकाओं के सभी उपकला कोशिकाओं के लगभग 1% शामिल है, और enterochromaffin (ईसी) कोशिकाओं सबसे बड़ा Enteroendocrine सेल जनसंख्या1हैं । हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि enteroendocrine2 और चुनाव आयोग3,4 कोशिकाओं को बिजली से उत्तेजित कर रहे हैं । हम प्राथमिक ईसी सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को समझने में रुचि रखते हैं । इस प्रकार, इस अध्ययन के प्रयोजन के लिए प्राथमिक चुनाव आयोग सेल पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए अनुकूलित संस्कृतियों की स्थापना थी ।
मौजूदा चुनाव आयोग सेल लाइनों का उत्पादन और 5-एचटी (जैसे, QGP-15, बोन6, KRJ-17) और5इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है,8 आम तौर पर अमर नवोत्पादित से उत्पंन कर रहे है ऊतकों. हालांकि इन सेल लाइनों से प्राप्त जानकारी मूल्यवान5,8है, प्राथमिक सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए ठीक से चुनाव आयोग सेल फिजियोलॉजी को समझने के लिए आवश्यक हैं । प्राथमिक ईसी सेल के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में एकल उपकला कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति की आवश्यकता होती है, जो उपकला संस्कृतियों की कम व्यवहार्यता द्वारा सीमित किया गया है ।
संस्कृति इस अध्ययन में प्रस्तुत विधि फ्लोरोसेंट लेबल ईसी सेल के साथ ट्रांसजेनिक चूहों पर निर्भर करता है, Tph1 की तरह-9-7, इस अध्ययन में इस्तेमाल किया । विधि मिश्रित प्राथमिक उपकला संस्कृतियों पहले विकसित2,10 एकल कोशिका इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी3के लिए ऑप्टिमाइज़ करता है । पिछले तरीकों Trypsin/EDTA प्लस Collagenase एक या EDTA और डीटीटी पाचन और प्रयुक्त घनत्व ढाल के लिए विशेष रूप से अलग और संस्कृति गिनी-सुअर11 और चूहा ईसी कोशिकाओं12के संयोजन का इस्तेमाल किया । हाल ही में, आंतों organoids उत्पन्न हुए थे और electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए यांत्रिक रूप से बाधित4. इन तरीकों का उपयोग संस्कृतियों अच्छी तरह से सेरोटोनिन रिलीज प्रयोगों के लिए अनुकूल हैं, आर टी-qPCR विश्लेषण और, जबकि वे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, समय लेने organoid पीढ़ी की सफलता पर निर्भर कर रहे हैं, घनत्व ढाल ईसी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, और Trypsin और EDTA के सेलुलर विघटनकारी प्रभाव । इसके विपरीत, प्रोटोकॉल यहां वर्णित एंजाइमी और यांत्रिक उपचार में सुधार, संवर्धन शर्तों का अनुकूलन, और प्रक्रियाओं को कारगर बनाने के लिए उच्च सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए आवश्यक मानकों के लिए उपयुक्त एकल और स्वस्थ चुनाव आयोग कोशिकाओं का उत्पादन ।
यह विधि उन वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी होगी, जो मिश्रित संस्कृतियों में प्राथमिक ईसी सेल पर काम करना चाहते हैं न कि नश्वर संस्कृतियों से और एकल कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की जांच करना चाहते हैं । हालांकि, यह सेल आबादी का अध्ययन है कि छंटाई या दीर्घकालिक संस्कृतियों कि अस्तित्व की आवश्यकता पिछले ७२ एच की जरूरत के लिए कम उपयुक्त साबित हो सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पूरी तरह से समझ ईसी सेल समारोह एक उच्च गुणवत्ता प्राथमिक संस्कृति के लिए पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए कोशिकाओं को उत्पंन विधि की आवश्यकता है । सैनिक उपकला की प्राथमिक संस्कृतियों परंपरागत रू?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने प्रशासनिक सहायता के लिए श्रीमती Lyndsay Busby का शुक्रिया अदा किया और श्री रॉबर्ट Highet को मेयो क्लिनिक डिविजन ऑफ इंजीनियरिंग से डिजाइन और कल्चरल डिश डालने के 3डी प्रिंटिंग के लिए धन्यवाद दिया । यह काम NIH K08 द्वारा अटल बिहारी (DK106456), पायलट और के लिए व्यवहार्यता अनुदान के लिए मेयो क्लिनिक सेंटर से गैस्ट्रोएंटरोलॉजी में संकेतन (NIH P30DK084567) और २०१५ अमेरिकन Gastroenterological एसोसिएशन अनुसंधान विद्वान पुरस्कार (आगा RSA) अटल बिहारी और NIH R01 GF (DK52766) ।
Materials
| High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
| Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
| 100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
| MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
| Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
| Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
| Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| 3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| Electrophysiology Equipment | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
References
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