אלקטרופיזיולוגיה התא כולו של ראשי Enterochromaffin מאתר בתרבית תאים
Summary
תאים Enterochromaffin (EC) מהווים תת קבוצה קטנה של מערכת העיכול תאים אפיתל. תאים EC חשמלית טמפרמנט, לשחרר סרוטונין, אך קשיים culturing זיהוי תאים EC מוגבלת מחקרים פיזיולוגיים. השיטה המוצגת כאן יוצר מודל תרבות ראשי לבצע בדיקה של תאים בודדים EC מאת אלקטרופיזיולוגיה.
Abstract
Enterochromaffin (EC) בתאי האפיתל במערכת העיכול (GI) מהווים את subpopulation הגדול של תאים enteroendocrine. כמו תאים חושית מיוחדים, EC התאים לחוש בגירויים luminal, להמיר אותם לתוך האירועים שחרור סרוטונין (5-hyroxytryptamine, 5-HT). עם זאת, אלקטרופיזיולוגיה של תאים אלה ממעטים להבין כי הם קשים לתרבות, וכן לזיהוי. השיטה המובאת הזה תרבויות של נייר מתאר תא EC העיקרי ממוטב אלקטרופיזיולוגיה תא בודד. פרוטוקול זה מנצל כתב מהונדס חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) כדי לזהות תאים EC עכבר בתרבויות העיקרי מעורבת, קידום הגישה להשגת הקלטות באיכות גבוהה של כל התא אלקטרופיזיולוגיה במצבי מתח, זרם-מלחציים צולבים.
Introduction
מערכת העיכול (GI) האפיתל היא קהילה מגוונת בהיקף של מספר סוגי תאים. תאים Enteroendocrine מהווים בערך 1% של כל תאי אפיתל, תאים enterochromaffin (EC) הגדול enteroendocrine תא האוכלוסייה1. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי enteroendocrine2 ו EC3,4 תאים חשמלית להתרגש. אנו מעוניינים בהבנת אלקטרופיזיולוגיה העיקרי של התא EC. לפיכך, מטרת מחקר זה היה להקים ראשי תרביות תאים של EC, אופטימיזציה עבור התא כולו אלקטרופיזיולוגיה.
תא EC קיימים קווים לייצר ו להפריש 5-HT (למשל, QGP-15, בון6, KRJ-1-7), השתמשו כדי לבחון אלקטרופיזיולוגיה5,8 נוצרות בדרך כלל מן מונצחים אמצעים רקמות. בעוד המידע שנרכש שורות תאים אלה הוא בעל ערך5,8, מחקרים של התא הראשי אלקטרופיזיולוגיה נחוצים להבין כראוי פיזיולוגיה של התא EC. אלקטרופיזיולוגיה התאים EC הראשי דורש את הבידוד והתרבות של תאי אפיתל יחיד, אשר היה מוגבל על ידי הכדאיות נמוכה של תרבויות אפיתל.
שיטת תרבות שהוצגו במחקר זה מסתמך על העכברים הטרנסגניים עם תאי EC fluorescently שכותרתו, כמו Tph1-CFP9, השתמשו במחקר זה. השיטה מייעל יסודי מעורב תרבויות אפיתל שפותחו בעבר2,10 עבור תא בודד אלקטרופיזיולוגיה3. שיטות קודמות שימשו שילובים של טריפסין/EDTA פלוס Collagenase A או EDTA ו- DTT עיכול אנזימטי, נהגה צפיפות מעברי צבע במיוחד לבודד, תרבות שפן11 ועכברוש EC תאים12. לאחרונה, organoids מעיים היו שהופקו, מכנית שיבשו עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות4. תרבויות בשיטות אלה מתאימים היטב עבור סרוטונין לשחרר ניסויים, ניתוח RT-qPCR, בעוד הם יכולים לשמש אלקטרופיזיולוגיה, הם מסתמך על ההצלחה של תא צורב זמן רב דור, צפיפות מעברי צבע כדי לזהות תאים EC, ו תאית ההשפעות משובש של טריפסין EDTA. לעומת זאת, פרוטוקול המתוארים כאן משפר אנזימטי וטיפולי מכני מייעל תנאים culturing, מייעל את ההליכים כדי לייצר יחיד ובריא EC תאים מתאים הסטנדרטים הגבוהים הסלולר לצורך אלקטרופיזיולוגיה.
שיטה זו יהיה שימושי עבור מדענים אשר רוצה לעבוד על ראשי תאים EC תרבויות מעורבים יותר מאשר תרבויות מונצחים ואני רוצה לחקור את אלקטרופיזיולוגיה של תאים בודדים. עם זאת, זה עשוי להתברר פחות מתאים ללמוד תא האוכלוסיות זקוקים תרבויות המיון או לטווח ארוך הדורשים הישרדות בעבר 72 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההבנה המלאה EC תפקוד התא מחייב שיטה תרבות ראשי באיכות גבוהה כדי ליצור תאים עבור כל התא אלקטרופיזיולוגיה. תרבויות העיקרי של האפיתל GI באופן מסורתי היתה קשה, בגלל הישרדות נמוך. להקלה גורם מבלבלים זה, השיטה הנוכחית מניבה תרביות של תאים EC יחיד מן המעי קטנה או גדולה, כי הם מסוגלים לשרוד במשך מספר י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה גברת באזבי Lyndsay לסיוע מינהלי מר רוברט Highet מ מאיו קליניק חטיבת להנדסה עיצוב והדפסה תלת-ממד של תרבות מאכל הקדמי. עבודה זו נתמך על ידי NIH K08 AB (DK106456), טייס, מענק היתכנות AB ממרכז מרפאת מאיו עבור איתות התא בגסטרואנטרולוגיה (NIH P30DK084567) ופרס 2015 אמריקאי Gastroenterological האגודה מחקר מלומד (AGA RSA) AB ו- NIH R01 ל GF (DK52766).
Materials
| High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
| Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
| 100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
| MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
| Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
| Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
| Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| 3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| Electrophysiology Equipment | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
References
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The “normal” endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, 1081-1093 (2011).
- Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
- Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
- Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
- Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
- Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
- Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
- Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
- Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, 5959-5975 (2013).
- Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
