Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji birincil kültürlü fare Enterochromaffin hücre

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58112
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1, 1
1Enteric Neuroscience Program, Division of Gastroenterology & Hepatology,Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Enterochromaffin (EC) hücreleri küçük bir alt gastrointestinal epitel hücrelerinin oluşturmaktadır. EC hücreleri elektriksel olarak heyecanlı ve kültür ve EC hücreleri tanımlayan zorlukları fizyolojik çalışmalar sınırlı henüz serotonin, bırakın. Burada sunulan yöntem bir birincil kültür model tek EC hücrelerin incelenmesi için mükellef tarafından Elektrofizyoloji kurar.

Abstract

Gastrointestinal (GI) epitel hücrelerinde Enterochromaffin (EC) en büyük subpopulation enteroendocrine hücre oluşturmaktadır. Özel duyu hücreleri olarak EC hücreleri luminal uyaranlara hissediyorum ve serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) yayın etkinliklerine dönüştürün. Ancak, onlar kültür ve tanımlamak için zor, çünkü bu hücreler Elektrofizyoloji kötü anlaşılmaktadır. Yöntemi bu kağıt özetliyor birincil EC hücre kültürleri içinde sunulan tek hücre Elektrofizyoloji için en iyi duruma getirilmiş. Bu iletişim kuralı transgenik Camgöbeği floresan protein (CFP) muhabir fare EC hücreleri tüm cep telefonu Elektrofizyoloji gerilim ve akım kelepçe modlarında yüksek kalite kayıtları elde etmek için yaklaşım ilerleyen karışık birincil kültürde tanımlamak için kullanır.

Introduction

Gastrointestinal (GI) epitel hücre çeşitli oluşan farklı bir topluluktur. Enteroendocrine hücreleri, kabaca %1 tüm epitel hücresi oluşturan ve en büyük enteroendocrine hücre nüfus1enterochromaffin (EC) hücrelerdir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda enteroendocrine2 ve EC3,4 hücreleri elektriksel olarak heyecanlı olduğunu göstermektedir. Biz birincil EC hücre Elektrofizyoloji anlamakta ilgilendi. Böylece, bu çalışmada tüm cep telefonu Elektrofizyoloji için en iyi duruma getirilmiş birincil EC hücre kültürleri kurmak oldu.

Varolan EC hücre üretmek ve 5-HT (Örneğin, QGP-15, BON6, KRJ-17) salgılar ve Elektrofizyoloji5,8 incelemek için kullanılan satır genellikle oluşturulur neoplastik ölümsüzleştirilmiş doku. Bu hücre satırlarından alınan bilgi değerli5,8olsa da, birincil hücre Elektrofizyoloji çalışmaların düzgün EC Hücre fizyolojisi anlamak gereklidir. Elektrofizyoloji birincil EC hücre izolasyon ve epitel kültürler düşük canlılık tarafından sınırlandırılan kültür tek epitel hücrelerinin gerektirir.

Bu çalışmada sunulan kültür yöntemi transgenik fareler gibi Tph1-CFP9Bu çalışmada kullanılan, fluorescently etiketli EC hücrelerle kullanır. Karışık birincil yöntem optimize epitel kültürler geliştirilen daha önce tek hücre Elektrofizyoloji3için2,10 . Önceki yöntemler tripsin/EDTA artı Collagenase A veya EDTA ve DTT kombinasyonları enzimatik sindirim için kullanılan ve özellikle yalıtmak ve kobay11 ve sıçan EC hücreler12kültür için yoğunluk gradyanlar kullanılır. Daha yakın zamanlarda, bağırsak organoids oluşturulan ve mekanik elektrofizyolojik kayıtlar4için bozdu. Bu yöntemleri kullanarak kültürler serotonin yayın deneyler, RT-qPCR analiz ve Elektrofizyoloji için kullanılabilir zaman alıcı organoid üretimi, EC hücreleri tanımlamak için yoğunluk gradyanlar başarısı üzerinde ne bağlı iken için uygundur ve Tripsin ve EDTA hücresel yıkıcı etkileri. Buna karşılık, burada açıklanan protokol enzimatik ve mekanik bakımları geliştirir, kodlamayla koşulları en iyi duruma getirir ve tek ve sağlıklı EC hücreleri Elektrofizyoloji için gerekli yüksek hücresel standartlara uygun üretmek için yordamlar verimlilik düzeyini artırmak.

Bu yöntem birincil EC hücrelerde ölümsüzleştirdi kültürler yerine karma kültürler üzerinde çalışmak istediğiniz ve Elektrofizyoloji tek hücre araştırmak isteyen bilim adamları için faydalı olacaktır. Ancak, hayatta kalma Son 72 h gerektiren sıralama veya uzun vadeli kültürler gerekir hücre popülasyonlarının çalışmak için daha az uygun kanıtlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Mayo Clinic tarafından onaylanmıştır. Bu protokolü birincil hücre kültür bölümüne başvurulabilir daha önce yayımlanmış yöntemleriyle ilgili daha fazla ayrıntı10temel alır. Tüm deneysel yordamlar (IACUC) tarafından onaylanmış olması gerekir ve tüm deneylerin ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.

1. kültür hazırlama

  1. Medya.
    1. EC hücre tam kültür ortamı hazırlamak ile yüksek glukoz [4500mg/L] Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) % 5 ile Fetal sığır Serum (FBS), %1 L-Glutamine ve % 1'i takıma penisilin-streptomisin (Tablo 1).
      Not: Medya 4 ° C'de en fazla bir ay için saklanır.
    2. EC hücre tam kültür medya filtre ve 50 mL tüp 37 ° C'de 25 mL medya yerleştirin
    3. Sindirim medya yüksek glikoz [4.500 mg/L] %0,1 ile desteklenmiş DMEM ile hazırlamak sığır Serum Albumin (BSA) (Tablo 1).
    4. Sindirim medya filtre ve medya dört 10 mL aliquots ayrı 50 mL tüpler içine yerleştirin ve bir 37 ° C su banyosunda kuluçkaya.
      Not: Medya 4 ° C'de en fazla bir ay için saklanır.
  2. Bir enzim.
    1. 4 mg (için değişir) dışarı yada 1.5 mL microcentrifuge tüp Collagenase XI [≥800 birimi/mg] (iki nokta için) 24 mg eder.
      Not: Collagenase-20 ° C'de en fazla bir yıl için stabil.
    2. Buz soğuk PBS ile Ca2 + ve Mg2 +1 ml aliquot collagenase resuspend. Girdap çözüm iyice birleştirmek ve buza koyun.
  3. Kaplama kültür tabaklar.
    1. Hücre dışı matriks buzda 4 ˚C adlı gecede 150 µL çözülme.
    2. % 5 w/v hücre dışı matriks çözüm çözdürülen hücre dışı matriks 100 µL buz gibi serum ücretsiz yüksek-glikoz DMEM 2 mL ile karıştırılarak olun.
      Not: Hücre dışı matriks oda sıcaklığında katılaşır ve önceden soğutulmuş Pipetler, tüpler ve medya ile hazır kat yemekleri kadar ele alınmalıdır.
    3. Hemen cam alt 35 mm yemeklerin cam iç Daire 250 µL % 5 hücre dışı matriks çözüm ile kat. Bu tarifi 8 yemekleri kapsar.
    4. Cam-alt yemekleri kalan hücre kültür yalıtım adımları sırasında 37 ° C kuluçka makinesine koyun. Hücre dışı matriks ayarlamak için 1 h en az alır ama en fazla 2.5 saat için diğer yalıtım adımları gerçekleştirirken inkübe.
      Not: Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji esnasında Incubations 3 h sekteye uğrayabilir hücre dışı matriks birikmesi oluşturabilirsiniz daha uzun kapatın.

2. doku yalıtım

  1. Etik kurallarına göre bir 3to kurban 6 haftalık erkek veya kadın Tph1-CFP transgenik fare (Jackson laboratuvar hisse senedi: 028366)9 veya başka bir muhabir soy.
    Not: ölüm emin olmak ikinci bir aracı olarak biz karbon dioksit ve servikal yerindençıkmasına seviyesinin ölümcül bir doz kullanın. Ötenazi Devletleri Komitesi Ayrıca servikal çıkık bir izin verilen birincil ötenazi yöntemi Eğer hayvanlar ilk sakinleştirici kullanımı ile eğitimli bireyler tarafından dikkate alınır.
  2. Euthanized fareyi dışarı 21 G iğneler kullanılarak bir polistren köpük diseksiyon sahnede pin. Fare karın % 70 etanol ile dezenfekte etmek.
  3. Fare cilt gergin mikro-diseksiyon forseps (#5) kullanarak çekin ve keskin cerrahi makas mayi boşluğu ortaya çıkarmak için fare karın altındaki enine bir kesi yapmak için kullanın. Göğüs kafesi maruz kadar dikey olarak karın kadar başka bir kesi yapmak.
  4. Mikro-diseksiyon forseps çekum iki nokta üstüste temiz bir görünümünü elde etmek için fareyi sola taşımak için kullanın.
  5. Mikro-diseksiyon makası (ama hala proksimal için rektum) iki nokta üstüste en distal kısmını kesip biraz mide için distal kesmek yapmak için kullanın. Ayıklanan bağırsak bir 100 x 15 mm2 Petri kabına içine buz gibi fosfat 20 mL ile dolu yer arabelleğe alınmış serum (PBS).
  6. Ölçmek ve ya orta iki nokta veya değişir 10 cm kesip küçük bir cetvel kullanın. Kolon rektum alınan ilk kesim için proksimale bulunan bağırsak 10 cm segment dışarı ölçerek ayıklayın. Değişir tüm ince bağırsak ikiye katlanır ve yarıya kadar noktada ilk bir kesi ve kesmek ikinci bir kesi 10 cm ilk proksimal belirleyebilir.
    Not: tüm sonraki yalıtım adımları izleyerek buza devam.
  7. 6 mL şırınga buz soğuk PBS ile doldurun ve şırınga iğne ayıklanan bağırsak kesimine lümen yerleştirin. Kelepçe ve şırınga iğne etrafında bağırsak mühür için mikro-diseksiyon forseps kullanın ve yavaşça PBS 10 mL ile dış görev dışkı durulama için lümen floş.
  8. Bağırsak dokusu yavaşça mikro-diseksiyon forseps Lümen ile dokuma, bir bağırsak duvarının pinching ve doku forseps ucuna kadar proksimal geri çeker tersine çevirin. Inside-out kesimdir kadar bu işlemi yineleyin dışa dönük Lümen ile.
  9. Mikro-diseksiyon makası doku segment 1 cm parçalar halinde kesmek için kullanın.
  10. Mikro-diseksiyon forseps 5 mL steril PBS ile dolu bir 50 mL ölçek doku parçalarını aktarmak için kullanın. Mikro-diseksiyon makası doku parçaları liquified bir tutarlılık için bin dereden su getirmek için kullanın.
  11. Kıyılmış doku ve buz soğuk PBS 15 mL bir temiz 50 mL tüp transferi pipet tarafından yerleştirin. 2 kez transfer pipet ile triturate, yerleşmek, PBS süpernatant 15 mL kaldırmak ve taze PBS ile değiştirmek doku için bekle. PBS temizlenene kadar üç kez bu adımları tekrarlayın.
  12. Yıkanmış doku parçaları ile 50 mL tüp buz üzerinde yerleştirin ve doku kültürü kukuIeta buz kovası getirmek.

3. enzimatik ve mekanik sindirim

  1. İlk sindirim
    1. Su banyosundan önceden ısıtılmış sindirim medya 10 mL içeren 50 mL tüpler birini almak. 50 mL Tüp, 250 µL PBS collagenase çözüm ve kıyılmış bağırsak doku parçaları ekleyin.
      Not: önceki çamaşır adımlardan herhangi bir PBS eklemeyi önlemek için dikkat ediniz.
    2. 50 mL tüp 37 ° C'de 5 dakika (iki nokta üst üste ya da değişir) bir su banyosunda yerleştirin 2 tüp sallamak her dk.
      Not: En iyi zamanlama ve mekanik sindirim yoğunluğu değişebilir ve Kullanıcı tarafından belirlenecektir gerekir. En iyi sindirim koşulları belirlemek için 10 µL aliquot hücre-ebilmek var olmak görüş her sindirim sonra. Sindirim 1 sırasında hücre kümeleri süpernatant oluşmalıdır.
    3. Yavaş yavaş doku 10 mL serolojik pipet ile bir kez triturate. Kısa bir süre sonra doku parçaları yerleşmek izin süpernatant tüm 10 mL kaldırmak için bir transfer pipet kullanın.
  2. İkinci sindirim: 3.1.1-3.1.3 adımları yineleyin. Eğer iki nokta üstüste sindirerek 10 dk kuluçka süresini artırmak ve kuluçka süresi değişir için 5 dk tutun.
    Not: gözlem süpernatant hala hücrelerinin büyük kümeleri oluşmalıdır.
  3. Üçüncü sindirim
    1. Adımı yineleyin 3.1.1
    2. 50 mL tüp 37 ˚C su banyosu için 10 dk (iki nokta üst üste ya da küçük değişir) yerleştirin. Tüp min başına 2-3 x sindirim 1 ve 2 daha yüksek bir yoğunluk, salla.
    3. Yavaş yavaş doku yukarı ve aşağı bir 10 mL serolojik pipet ile pipette. Doku parçaları kısa bir süre için yerleşmek izin verir.
      Not: Tek hücreleri ve küçük kümeleri bir arada süpernatant oluşmalıdır.
    4. 10 mL süpernatant yeni 15 mL tüp içine yerleştirin, 2 mL ılık EC hücre tam kültür medya ekleyin ve bir kez karıştırmak için ters çevir'i için bir transfer pipet kullanın.
    5. 100 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin sonra transfer pipet süpernatant kaldırmak için kullanın. Kalan Pelet 2.5 mL ılık EC hücre tam kültür ortamı resuspend için bir transfer pipet kullanın.
  4. Dördüncü hazım: 3.3.1 3.3.5 adımları yineleyin. Kolon için 15 dk kuluçka süresini artırmak ve 10 dk değişir için kalır.
    Not: Süpernatant şimdi tek hücreleri oluşmalıdır.

4. hücre kültürü

  1. Bir aktarım pipet kesimi 3 ve 4 yeni 15 mL tüp içine (5 mL toplam hacim) toplanan hücre süspansiyonlar birleştirmek için kullanın.
  2. 10 µL aliquot ile hemasitometre ve kalan hücre süspansiyon 100 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin için hücre kaldırın.
    Not: Son hücre süspansiyon küçük kümeleri ve tek hücreleri oluşur.
  3. Süpernatant transfer pipet ile kaldırın ve EC hücre tam kültür medya mL başına 1.000.000 hücre yoğunluğu, Pelet resuspend.
    Not: Hücre süspansiyon son hacmi son hücre sayısı üzerinde bağlıdır. Tipik hücre 4.000.000 2.000.000 arasında değişir sayar.
  4. Kaplamalı cam-alt kültür bulaşık kuluçka makinesi kaldırın. P1000 pipet her kültür yemeğin üzerinden hücre dışı matriks son hücre süspansiyon 250 µL ile değiştirmek için kullanın.
    Not: Hücre dışı matriks kaplama cam alt çanak kenarlarını sopa eğilimindedir. Üzerinden kaplama kenarı boyunca uzanan jel birikimini önlemek için kaldırmak için özel bakım alınması gerekir.
  5. ROCK inhibitörü Y-27632 1 mm hisse senedi bir çözüm olun. Hisse senedi çözüm 2.5 µL 10 µM ROCK inhibitörü her yemeğin içinde bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için her cam alt çanak ekleyin.
    Not: Bu adım değişir kültür yaşam için önemlidir ancak kolon için isteğe bağlıdır.
  6. 24-72 saat (Şekil 1) 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka her kültür çanak yerleştirin.

5. tüm cep telefonu Elektrofizyoloji için EC hücreleri hazırlanması

  1. Mikroskop sahne iç çapı iki 5 x 0.5 cm şeritler bir O-ring oluşturmak için balmumu filmi ile satır. 35-mm hücre kültür çanak içinde O-ring (Şekil 2A-B) bağlayın.
  2. Her iki yüzen enkaz durulayın, ekli olmayan hücre dışı matriks veya ölü hücreleri ve Kültür medya serum EC tamamen uzak gibi ya engelleyen gelen önlemek için hücre oluşumu EC hücre ve elektrot arasında mühür. Ayrıntılı hücre Elektrofizyoloji için yeterli yıkama elde etmek için üç aşağıdaki seçenekleri kullanımı:
    1. Seçenek 1: Çözüm Satım uzun bir odasında daha verimli daha çok bir daire daha odası. EC hücreleri yuvarlak 35 mm yemeklerin kültürlü beri yemek için plastik bir eliptik eklemek oluşturun.
      1. INSERT 3D baskı veya geleneksel freze yöntemleri oluşturmak. Biz kullanılan INSERT aşağıdaki ebatları (mm) ile akrilik plastikten öğütülmüş: dış çap, 34.5; iç Elips, 20 x 9; Dış Yükseklik, 10; İç yüksekliği 1,5; köprü aralığı, 3 x 3; köprü geçiş izni, 1.5; giriş ve çıkış, 4 x 4 her.
      2. INSERT kültür amacına (Şekil 2A-B) daha düşük ve 1.2 x 0,3 x 0.1 cm dikdörtgen (Şekil 2A-C) içine preslenmiş kil modelleme iki 0,15-0,2 g parça mikroskop Stage'le tepesine güvenli.
      3. Plastik transfer pipet ile yavaş yavaş hücre dışı çözüm çanak (giriş) bir yana diğer taraftan (çıkış) alıyorum süre ekleyin.
    2. Seçenek 2: mühendislik plastik INSERT, hücre dışı çözüm transfer pipet tarafından çanak (giriş) bir kenarından ters taraftan (çıkış) alıyorum süre ekleyin. Yavaş yavaş transfer pipet (Örneğin, N e s) konumunu (Örneğin, S w N için) karşı tarafta aspirasyon iğne yerleşimini yansıtma sırasında döndürün.
    3. Seçenek 3: Kat hücre dışı matriks üzerine adım 1.3.3 dikdörtgen coverslips. ve bu coverslips adım 4.4 hücre uzaklaştırılmış kültür. Bu coverslip adım 5.1 atlama ve adım 5.3 Kaptan ekstraselüler çözüm ile dolu bir dikdörtgen Oda aktarın. Odası ile hücre dışı eriyik--dan bir plastik transfer pipet, seçenek 1 (5.2.1.3) açıklandığı gibi yıkayın.
  3. Sahne alanı üzerinde ters mikroskop (Şekil 2D) hücre kültürü ile yeniden ekleyin. Oda sıcaklığında serum serbest hücre dışı çözüm EC hücre kültüründe kuluçkaya.
  4. 4 saat sonra yukarıda açıklandığı gibi kültür ekstraselüler çözüm ile tekrar durulayın. Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji ile devam edin.

6. tüm cep telefonu Elektrofizyoloji birincil kültür EC hücre

  1. Bir bütün hücre Giga-mühür sağlanması
    1. Bir düzine elektrotlar bir direnç 1 – 5 MΩ çek.
      Notlar: 10-100 GΩ mühürler verim pipetler 1-2 MΩ direnç iyi performans gösterdiğini. Elektrot ipuçları parlatma ateş GΩ mühürler elde etmek için gerekli değildir.
    2. Eşit olarak tüm pipetler polimer ile burun konisi kat. Yere pipet yatay ve dikey olarak Isı tabancası açık tutun. Polimer sertleşir kadar yavaş yavaş pipet döndürün.
    3. İntraselüler çözeltinin bir aliquot 15 mL konik tüp içine dökün. Bu çözümün 1.2 mL 1 mL şırınga ile 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Hücre içi çözüm başka bir 0.7 mL şırınga geri alıyorum. Soluduğumuz hava--dan belgili tanımlık tenkıye sonu gidermek. Esnek 34 G, şırınga, 67 mm iğneye takın ve bu iğneyi kalan herhangi bir hava dışarı floş.
    4. Bir Tph1 tanımlamak-diğer hücre veya enkaz ile temas değil CFP + hücre.
    5. Elektrot uç ile hücre içi çözüm doldurun. Pipet şırınga tarafından tamamlanmıyor. Dikkatle pipet hava kabarcık arabirimi ortadan kaldırmak için bir tırnak ile hafifçe vur.
    6. Hava 0.3 mL ile hazırlanan pistonu ile 6 mL şırınga boru tutucu prizine takın. Elektrot tutucu monte.
      Not: elektrot hücre içi çözüm sızdırmazlık önce içindeki nötr veya pozitif basınç korumak için banyo çözüm girmeden önce şırınga boru için bağlayın.
    7. İlk adım bir gerilim merdiven tarafından kararlı durum aktive akımları kaydeder ve ikinci adım üzerinde tek bir gerilim tarafından mevcut akımları kaydeden iki aşamalı gerilim tipi kelepçe iletişim kuralını yükleyin. Sızdırmazlık testi açın (5 mV 50 kHz).
    8. Elektrot banyo çözümde indirin. Micromanipulators ile elektrot uç içinde-uçaktan ile ve doğrudan yatay hücresi manevra. Soluduğumuz hava--dan belgili tanımlık tenkıye 0.3 mL sınırdışı.
    9. Yavaşça elektrot hücre dokunmak yatay x ekseni boyunca taşıyın. EC hücre ve/veya bir artış membran direnci mühür test üzerinde görünmesini bir çukur için dikkat et. Gerekirse, elektrot aşağı z ekseni boyunca ve/veya yatay hücre orta hat hareket etmiyor x ekseni boyunca yeniden ayarlayabilirsiniz.
    10. Geçerli 0,1-0,2 mL emme 6 mL şırınga üzerinde. 100 MΩ elde kadar pistonu sabit tutun, daha sonra pistonu gelen kavrama bırakın. Giga-mühür hücreye bekleyin. Yavaşça unscrewing bir hareket şırınga bağlantısını kesin.
      Not: Eğer bir EC hücre başlangıçta mühür değil, bir sonraki girişimi ile yeniden mühürlemek mümkün olabilir. Bunu yapmak için yavaşça elektrot bir EC hücresiyle uzak çekin < 20 MΩ mühür direnç. Micromanipulators ile harcanan elektrot direksiyon, el ile net dış saha matris veya enkaz hedeflenen EC hücreye etrafını. Ardından, EC hücre taze bir elektrot ile mühürlemek deneyin.
  2. Kayıt tüm cep telefonu gerilim-gated Na+ geçerli.
    1. 0.5-1.0 ile hazırlanan 3 mL şırınga eklemek mL hava. Emme hızlı bir musluk uygulamak (0.1 – 0.5 mL) 3 mL şırınga üzerinde. Bütün hücre erişim elde kadar yineleyin ve sonra şırıngayı yavaşça çıkarın.
      Not: bir şırınga performansını başlangıçta farklılık gösterir ve yavaş yavaş pistonu 0,1-0,2 içinde geri tepme emin olmak için zaman ve kullanım, uygulama önceden (son bir işaret parmağı ile sızdırmazlık) 3 mL şırınga ile ile değiştirmek gibi onun başlayan mL getirin. Eğer değilse, o zaman yeni bir şırınga değişimi.
    2. Tüm cep telefonu kapasitans tazminat açın. Kapasitans ve seri direnç ayarlayın. Üzerinde seri direnç değerini açın. Ayarla 60 ms gecikme ile öngörülen sonra düzeltilmiş seri direnç değerini ayarlayın. Mühür test kapatın.
    3. Ortalama 5 çalışan bütün hücre voltaj Na+ akım (Şekil 3A) kaydedin.
    4. Hızlı bir şekilde iki parametre Na+ akım voltaj dikkat: pencere geçerli (Şekil 3B, kırmızı simge, kavşak kararlı durum harekete geçirmek ve inactivation eğriler) ve en yüksek Na+ akım, gerilim yoğunluğu.
      Not: EC hücreleri ile en yüksek Na+ akımları daha sık voltaj kelepçe modunda-50 pA elde edildi potansiyelleri geçerli kelepçe modunda ateş etmeye devam edecek. Ayrıca, akımlar-200 pA gerilim kelepçe (Şekil 3A) sonra genellikle büyük aksiyon potansiyelleri membran potansiyeli (kırmızı çizgi, Şekil 3D) gerilim yakınındaki üzerinden geçerli kelepçe içinde kendiliğinden ateş pencere geçerli (kırmızı sembol, Şekil 3B).
  3. Kayıt Aksiyon potansiyelleri elde edildi.
    1. Seri direnç tazminat dön. Dış komutunu kapatın. Kelepçe V-kelepçe üzerinden moduna geçirin. Kazanç ayarlayın. Bir epizodik geçerli kelepçe iletişim kuralını yükleyin. Holding 0 olarak geçerli miktarını ayarlamak baba. Dış komutunu kapatın.
      Dikkat: V-kelepçe-kelepçe (veya tersi) dış komuta kapatmadan açmayın.
    2. İstirahat membran potansiyeli unutmayın. Holding geçerli pencerenin geçerli membran potansiyeli okur yoksayılmasını ayarlayın (Örneğin, -80 için -100 mV). Geçerli giriş adım aralığı (Şekil 3C iç metin, + 2 pA adımları için geçerli holding-3 pA) geçerli Holding değerden az epizodik geçerli kelepçe iletişim kuralı ayarlamak.
    3. Kayıt Aksiyon potansiyelleri elde edildi. Bir aksiyon potansiyeli ateşlenmesine enjekte geçerli en az miktarda Not (Şekil 3C, süpürme 3 / 5, 4 pA adım holding-3 PA + 1 pA =).
  4. Kayıt spontan Aksiyon potansiyelleri.
    1. Dış komutunu kapatın. Geçerli kelepçe boşluk içermeyen (epizodik olmayan) iletişim kuralı bir yük.
      Not: geçerli boşluk içermeyen geçerli kelepçe protokolünde tutan miktarını hücre için uygun olduğu doğrulandı kadar dış komut yeniden açın değil.
    2. Holding bir aksiyon potansiyeli ateş etmedim elicited protokolündeki son süpürme enjekte akım miktarını olmak geçerli değiştirmek (Şekil 3D, geçerli giriş ikinci tarama sırasında bir + 2 pA adım holding-3 PA-1 pA =).
    3. Dış komutunu kapatın. Geçerli tahmin edilen holding membran bir aksiyon potansiyeli ateşlenmesine eşiğin altına potansiyel getiriyor çift kontrol edin. Geçerli holding ayarlayın. Kayıt spontan aktivite.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kültürler:
Birincil fare epitelyal hücreler bir transgenik Tph1-CFP modelinden yapılan yemekleri 4 saat sonra takın ve 24-72 saat arasında fizyolojik deneyler için hazır. Ne zaman kültür koşulları optimize edilmemiş, epitel hücre kültürü büyük kümeleri, hücresel enkaz, hasarlı membranlar ve EC hücrelerdeki (Şekil 1A) CFP sinyali zayıf yüzen oluşuyordu. Elektrofizyoloji için optimize edilmiş kültürler tek hücreleri ve küçük kümeleri oluşuyordu. Sağlıklı EC hücreleri kolayca parlak CFP floresans tarafından tespit edilmiştir ve hala yemek için güçlü yıkandıktan sonra (Şekil 1B) yapıştırılır.

Elektrofizyoloji:
EC tüm hücreleri elde edilen girişimleri kolon kültürler ROCK inhibitörü (29 22 kültürlerden 182 girişimleri tüm hücreleri) olmadan sadece 15 ±4% 30 ±7% girişimleri ROCK inhibitörü (27 50 kültürlerden 102 girişimleri tüm hücreleri) ile iki nokta üst üste kültürlerden ama (< C1 > Şekil 4A; p < 0,05 bir parametrik olmayan iki kuyruklu t-testi, iki nokta üst üste kültürler vs ROCK inhibitörü ile olmadan). Benzer şekilde, değişir EC hücreleri ROCK inhibitörü Elektrofizyoloji için uzun hayatta değildi olmadan, EC 41 ±3% girişimleri değişir kültür ROCK inhibitörü (186 50 kültürlerden 447 girişimleri tüm hücreleri) ile tüm hücreleri elde edilmiştir (Şekil 4A; p > 0.05 bir parametrik olmayan iki kuyruklu t-testi, değişir vs. kolon ROCK inhibitörü ile).

Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji tarafından gerilim tipi kelepçe modu ve aksiyon potansiyelleri (AP) akım tipi kelepçe modunda Na+ akımları kaydedildi. Na+ akımlar TPH1 81.3 ±4.0% den kaydedildi-CFP + hücre değişir veya iki nokta üst üste364,1 ±9.2%. 59 EC hücre Na+ en yüksek akımlar-25 pA büyük olmasını gerilim-kelepçe tarafından onaylandıktan değişir kültürlerden 19 EC hücreleri geçerli-kelepçe modda spontan AP ("kendiliğinden") ateş, 29 EC hücreleri yalnızca geçerli-kelepçe adım protokolünde tarafından elde edildi zaman AP ateş modu ("elde edildi yalnızca") ve 11 ak hücreler değil AP kendiliğinden ateş veya Protokolü ("Sigara-ateş") (Şekil 4B) adım. Spontan hücreleri vardı bir ortalama pik Na+ akım yoğunluğu (ıtepe)-108.0 ±19.3 pA/pF, salt elde edildi hücreleri vardı bir benen yüksek -60.2 ±9.2 pA/pF ateş olmayan hücreler varken bir ben-43.3tepe , ±14 pA/pF (Şekil 4 B; p < 0,05, spontan vs salt elde edildi veya ateş olmayan gruplar; p > 0.05 salt elde edildi vs ateş olmayan gruplar). Geçerli yoğunlukları arasındaki fark değildi tüm cep telefonu kapasitans bir yansımasıdır, spontan (3,3 ±0.2 pF), salt elde edildi (2,9 ±0.2 pF) ve sigara-ateş (3.1 ±0.3 pF) hücreleri benzer bütün vardı hücre capacitances (P > 0.05). EC hücre Na+ akımları ve AP elde edildi [Na+]o konsantrasyonu ve NaV1.3 inhibisyon3duyarlı idi.

Figure 1
Resim 1 : Kültür sonuçlarının temsilcisi aralığı. DIC birincil epitel değişir kültür Tph1-CFP fareden epifluorescence görüntüleri ile bir cam alt çanak üzerinde kaplama ve 24 saat için kültürlü. Bu iki resim bu kuralından bir dizi kültür sonuçları göstermektedir. CFP floresan hücreleri (beyaz) enterochromaffin (EC) hücrelerdir. (A)Elektrofizyoloji için düşük kaliteli bir kültürün temsilcisi görüntüden. Büyük kümeleri, hasarlı hücre zarlarında, düşük floresans sinyal ve yüzen kültür oluşur ölü hücre grupları. (B) Elektrofizyoloji için optimize edilmiş bir kültürü temsil eden görüntü. Kültür ağırlıklı olarak tek, sağlıklı hücreler ve plaka şeklinde olması gereken küçük kümeleri oluşur. Bu kültür hücrelerde EC güçlü floresans sinyal korumak. Ölçek çubuğu 100 µm; = ölçekli 1:1 panelleridir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Hücre hazırlanması kültürler için Elektrofizyoloji. Verimli ve kapsamlı EC hücre kültürleri ile serum serbest hücre dışı çözüm, durulama için bir strateji hücre dışı matriks ve mühür oluşumuna engel olur serum azaltmak için önemlidir. (A)malzemeler. Üst soldan saat yönünde: sahne, balmumu film, iki 200 mg parça modelleme kil, plastik transfer pipet, #5 forseps, eliptik kayıt odası, 35 mm Kültür iki 5 mm geniş şeritler ile cam alt çanağı. (B) balmumu film sahne alanı'nın iç çap için uygun, eliptik odası kültür amacına daha düşük ve kil dikdörtgen şeritler halinde düzleştirin. (C) yavaşça kültür çanak balmumu film kaplı sahne tuşuna basın ve kayıt odası yemek odası sahneye gelen kenarı üzerinde modelleme kil yayarak hareketsiz. EC hücreleri ekstrasellüler çözüm çeşitli birimler ile yıkayın. (D) dönüş sahne montaj destekleri ters mikroskop yukarıda. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Temsilcisi Elektrofizyoloji sonuçları. (A)tüm cep telefonu Na+ akımları, iki aşamalı gerilim tipi kelepçe Protokolü (iç metin) tarafından kaydedildi. -120 üzerinden 50 ms depolarizations mV mV. Adım 2 (○) etkinleştirir değil henüz inaktive kanalları 0 başka bir depolarizasyon sırasında Adım 1 sırasında (●), kanalları etkinleştirin (Yani, açmak kullanılabilir). Kırmızı izleme, akım gerilim tarafından elde edildi üzere 0 -40 -120 adımları mV. (B) akım-gerilim ilişki panelinden A, tepe Na+ akıntılarının adım 1 (●, kararlı durum harekete geçirmek) veya adım 2 (○, kararlı durum inactivation). Küçük bir pencere -40 Şu anki kararlı durum harekete geçirmek ve inactivation eğrilerin kesişim ortaya mV (kırmızı semboller). (C) aksiyon potansiyelleri geçerli uyaranlara depolarize tarafından elde edildi. Bir aksiyon potansiyeli 0 ateş mV (potansiyel membran Na+ pencerenin geçerli gerilim ulaştığındagri çizgi) (kırmızı çizgi, -40 mV). İç metin, geçerli-kelepçe Protokolü içinde 0 + 8 PA -3 bir taban çizgisinden 50-ms depolarizations için enjekte, baba. (D) aksiyon potansiyelleri ateş üzerinden -40 için depolarized spontan olaylar üstüne mV. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji-den geçerek. (A)ortalama girişimi için devamsızlık (-) veya ROCK inhibitörü (10 µM) (+) varlığı n gün başına tüm hücre yüzdesi. EC hücrelerden değişir 24 h kültür ROCK engelleyici olmadan hayatta değildi. (B) Na+ akım voltaj-kelepçe içinde Aksiyon potansiyelleri patlamadı (Non-ateş), n EC hücrelerden ölçülen yoğunlukları ateş ne zaman sadece bir epizodik akım tipi kelepçe iletişim kuralı tarafından elde edildi (salt Elicited), veya spontan (kendiliğinden) boşluk içermeyen geçerli-kelepçe modunda ateş (hata çubukları olan SEM). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

EC hücre işlevi tam olarak anlamak için tüm cep telefonu Elektrofizyoloji hücreler üretmek için yüksek kaliteli birincil kültür yöntemi gerektirir. Birincil GI epitel kültürleri geleneksel nedeniyle düşük yaşam zor olmuştu. Bu karıştırıcı faktör hafifletilmesi, mevcut Yöntem üzerinden birkaç gün için kalan yeteneğine ya küçük ya da büyük bağırsak tekil EC hücre kültürleri verir.

Biz aşağıdaki Elektrofizyoloji için uygun olduğu kültürler kalitesini artırmak için kritik bulundu: (1) mukoza ters çevirme tercihan--dan o, (2) BSA az miktarda sindirim medya ve FBS kültür ortamına ekleme, (3) düşürücü peeling Collagenase XI konsantrasyon, (4) süresi ve yoğunluğu artırmak için mekanik ajitasyon ve ROCK inhibitörü ile kültür hücre dışı matriks bir düşük konsantrasyon ve (6) kaplama sağlık tek hücre, (5) ayarlama.

Benzer şekilde, aşağıdaki uyarlamalar yama sıkma sırasında tüm hücreleri almak için kritik: (1) iyice serum serbest hücre dışı çözüm, (2) izin EC kültürlerle durulama için en az 4 h, hücre dışı çözüm hücreleri stand (3). herhangi bir yeniden amaçlar elektrotlar benzeri harcanan bu başarısız mühürler-uzak enkaz yolda sonraki EC hücreye, (4) 10 µM Gd3 + hücre dışı çözüm kaçak akımlar (varsa) için ve bu memeli hücre yapışma kolaylaştırmak için eklemek temizlemek için süspansiyonlar cam için. Biz, ancak, Gd3 + EC hücrelerde ifade voltaj Ca2 + ve/veya mechanosensitive kanalları blok dikkatli olun.

Dikkatle kodlamayla koşulları en iyi duruma getirilmiş rağmen birkaç sınırlaması bulduk: EC hücreleri gerekir tam olarak eklemek henüz ~ 72 h kültür; sonra tarihi: 24 h Bu nedenle, ne zaman onlar elektrofizyolojik deneyleri için uygun olacağını onlar 48 saatlik bir pencere var. Hücreleri kez clumped çünkü kayıtları, tek EC hücre üretimi kritik telafi edemez kapasitans geçişler tanıtmak. Ancak, EC hücreleri epitel ayıran, hücreleri sonra yerel olmayan bir ortamda (Örneğin, yüksek glikoz medya ile fetal Sığır serum ve ROCK inhibitörü olarak yapay bir membran hücre dışı matriks üstüne) canlı ve yanıt verebilir uyaranlara karşı değil, tamamen temsilcisi EC hücrenin işlev vivo içinde. Bu sınırlamaları rağmen birincil EC hücre kültürü çalışmalarının hala onların Fizyoloji görmemizi sağlar.

EC hücreleri iyi işleyen GI yolu ve vücut bakımı kritik bir rol oynamaktadır ve bu nedenle, pek çok yöntem EC hücre Elektrofizyoloji hakkında anlamak için geliştirilen olmuştur. Enteroendocrine ve EC hücre Elektrofizyoloji ölümsüzleştirdi hücre modelleri5,8,13, birincil EC hücre kültürleri eskiden şiling şimdi domuz11ve fare3,4, soruşturma bizim yöntemi en az işlenmiştir ve yerel EC hücreleri yansıtan bir kültür oluşturmak için hücre kalite koruma yöntemleri kullanır. Tph1-CFP, Tph1 mevcut9olduğunda içinde sitoplazma Camgöbeği floresans gösteren bir transgenik fare modeli kullanın. Bu yöntem aynı zamanda diğer muhabir veya soy takip enteroendocrine hücre tipleri için kullanılabilir. Hücreleri sadece nazik bir Collagenase XI için bir saatten az bir en az ama etkili konsantrasyon-0.1 mg/mL (değişir) ve 0.6 mg/mL (iki nokta), açık olduğu gibi bizim yöntem tek EC hücre izolasyon çok az zaman ve enzimatik tedavi, aynı zamanda gerçekleştirir. Bu değişiklikler sonucu EC hücreleri elektrofizyolojik çalışmalar için optimize edilmiş bir kültürdür.

Başarılı bir şekilde fare EC hücreleri3Elektrofizyoloji ve serotonin sürümde çalışmak için bu yöntemi kullandık. Yeteneğini başarıyla izole etmek tanımlamak ve kültür tek EC hücreleri önemli gelecekteki yönde çalışmalar EC Hücre fizyolojisi üzerinde de kolaylaştırır. Bu yöntem daha da kritik yollar belirlemek için kullanılabilir ve kanalları serotonin ve diğer ak ak hücre ekzositozu hücre özel vericiler dahil. Yöntemi ayrıca yalıtmak ve EC hücre kimliği13akridin turuncu kullanımına birlikte insan EC Hücre fizyolojisi karakterize için değiştirilmiş olabilir.

En bilimsel iletişim kuralı geliştirme gibi iletişim ve tarafsız gözlem bu protokolü gidermede vahim olmasaydı. Biz bizim kültürlerin hayatta kalmak için yeni kültür yöntemleri test edildiğinde, canlılık bir ölçüsü olarak floresan hücreleri saymak, her hücre yoğunluğu çanağı ve temsili resim ve videoları kültürlerin birçok zamana toplamak tahmin yardımcı oldu puan. Hücre kültüründe 24 h geçmiş hayatta kalmak başardık sonra kültürlerimiz Elektrofizyoloji deneyler için değiştirmeye çalıştı. Böylece sağlıklı EC hücreleri hazır görüntüler ve detaylı gözlemler toplama ile birlikte, mekanik sindirim ve ek ve/veya substrat konsantrasyonu, ayarlamalarla ilgili laboratuvar personeli arasındaki açık iletişimi korumak önemli olduğunu elektrofizyolojik karakterizasyonu için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbiri

Acknowledgments

Yazarlar Bayan Lyndsay Busby yönetim yardım için ve Bay Robert Highet gelen Mayo Kliniği bölümü mühendislik tasarım ve 3D baskı kültür çanak ekleme için teşekkür ederiz. Bu eser NIH K08 AB (DK106456), Pilot ve Mayo Kliniği merkezi AB için fizibilite hibe hücre sinyallemesi Gastroenteroloji (NIH P30DK084567) ve 2015 Amerikan Gastroenterological Derneği araştırma bilim adamı Ödülü (AGA RSA) için AB ve NIH için desteklenen bir durumdu R01 GF (DK52766) için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 15 mm culture dish Corning (Falcon) 351029
Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-7M
10 mL serological pipette Corning (Falcon)  357551
50 mL Conical Corning (Falcon)  352098
15 mL Conical Corning (Falcon)  352097
1,000 mL Barrier Pipet Tips Thermo Scientific (Art) 2079E Keep sterile
MatTek Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points Fine Science Tools SB12630M
Surgical Scissors-Sharp Nasco 14002-14
Micro-Dissection Scissors Nasco SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX Covidien 8881250172
 Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice Jackson Stock # 028366 Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) World Precision Instruments MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film Pechiney Plastic Packaging
R6101 Dow Corning
6 mL syringe with regular luer tip Monoject
3 mL syringe with regular luer tip Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200B
Data acquisition system (daq) Molecular Devices Digidata 1440A
Signal conditioner Molecular Devices CyberAmp 320
Software Molecular Devices pClamp 10.6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).
  3. Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
  4. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
  5. Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
  6. Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
  7. Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
  8. Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
  9. Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
  10. Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
  11. Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).
  12. Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
  13. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).

Tags

Biyoloji sayı: 139 Gastrointestinal epitel enterochromaffin hücre birincil kültür Bütün hücre Elektrofizyoloji gerilim kelepçe geçerli kelepçe
Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji birincil kültürlü fare Enterochromaffin hücre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knutson, K., Strege, P. R., Li, J.,… More

Knutson, K., Strege, P. R., Li, J., Leiter, A. B., Farrugia, G., Beyder, A. Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells. J. Vis. Exp. (139), e58112, doi:10.3791/58112 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter