Hela cellen elektrofysiologi primära odlade murina Enterochromaffin celler
Summary
Enterochromaffin (EG) celler består av en liten delmängd av gastrointestinala epitelceller. EG celler är elektriskt retbara och släpp serotonin, men svårigheter i odling och identifiera EG celler har begränsad fysiologiska studier. Metoden presenteras här upprättar en primärkulturen modell kan bli föremål för undersökning av enstaka EG celler av elektrofysiologi.
Abstract
Enterochromaffin (EG) celler i det gastrointestinala (GI) epitelet utgör den största subpopulationen av enteroendokrina celler. Som specialiserade sensoriska celler, EG celler känna luminala stimuli och konvertera dem till serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release händelser. Dock är elektrofysiologi av dessa celler bristfällig eftersom de är svåra att kultur och identifiera. Metoden presenteras i detta papper konturer primära EG cellkulturer optimerad för enstaka cell elektrofysiologi. Detta protokoll använder tredjeparts transgena cyan fluorescerande protein (GFP) reporter för att identifiera musen EG celler i blandade primära kulturer, främja metoden till att erhålla högkvalitativa inspelningar av hela cellen elektrofysiologi i spänning – och ström-clamp lägen.
Introduction
Gastrointestinala (GI) epitel är ett mångfaldigt samhälle bestående av flera celltyper. Enteroendokrina celler omfattar omkring 1% av alla epitelceller och enterochromaffin (EG) celler är den största enteroendokrina celler befolkning1. Nyligen genomförda studier visar att enteroendokrina2 och EG3,4 celler är elektriskt retbara. Vi är intresserade av att förstå primära EG cell elektrofysiologi. Således, syftet med denna studie var att upprätta primära EG cellkulturer optimerad för hela cellen elektrofysiologi.
Befintlig EG cell linjer som producerar och utsöndrar 5-HT (t.ex. QGP-15, BON6, KRJ-17) och har använts för att undersöka elektrofysiologi5,8 genereras vanligtvis från förevigade neoplastiska vävnaderna. Medan de upplysningar som erhållits från dessa cellinjer är värdefulla5,8, är studier av primär cell elektrofysiologi nödvändigt att ordentligt förstå EG cellfysiologi. Elektrofysiologi primära EG celler kräver isolering och kultur av enda epitelceller, som har begränsats av låg lönsamhet av epitelial kulturer.
Metoden kultur presenteras i denna studie bygger på transgena möss med fluorescently märkta EG celler, som Tph1-GFP9, används i denna studie. Metoden optimerar blandade primär epitelial kulturer utvecklat tidigare2,10 för enstaka cell elektrofysiologi3. Tidigare metoder används kombinationer av Trypsin/EDTA plus kollagenas A eller EDTA och DTT för enzymatisk nedbrytning och täthetlutningar specifikt isolera och kultur marsvin11 och råtta EG celler12. Mer nyligen, var intestinal organoids genereras och mekaniskt störs elektrofysiologiska inspelningar4. Kulturer med dessa metoder är väl lämpade för serotonin släppa experiment, RT-qPCR-analys och, medan de kunde användas för elektrofysiologi, är beroende av framgången för tidskrävande organoid generation, täthetlutningar att identifiera EG celler, och cellulära störande effekter av Trypsin och EDTA. Däremot i protokollet som beskrivs här förbättrar enzymatisk och mekaniska behandlingar, optimerar odlingsskålar villkor och effektiviserar rutiner för att producera enkel och hälsosam EG celler passar de höga cellulära normer behövs för elektrofysiologi.
Denna metod kommer att vara användbar för forskare som vill arbeta på primära EG celler i blandade kulturer i stället för förevigade kulturer och vill undersöka elektrofysiologi av enstaka celler. Det kan dock bli mindre lämpliga för att studera cellpopulationer som behöver sortering eller långsiktiga kulturer som kräver överlevnad tidigare 72 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fullt ut förstå EG cellens funktion kräver en högkvalitativ primärkulturen metod att generera celler för hela cellen elektrofysiologi. Primära kulturer av GI epitel hade traditionellt varit svårt på grund av låg överlevnad. Denna metod att lindra denna confounding faktor, och ger kulturer av singular EG celler från antingen små eller stora tarm som kan överleva i flera dagar.
Vi hittade att följande var kritiska för att förbättra kvaliteten på kulturer vara lämplig för ele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka fru Lyndsay Busby för administrativt stöd och Mr Robert Highet från Mayo Clinic Division of Engineering för design och 3D-utskrifter av kultur maträtt skäret. Detta arbete stöds av NIH K08 AB (DK106456), Pilot och genomförbarhet Grant till AB från Mayo Clinic Center för cellsignalering i gastroenterologi (NIH P30DK084567) och 2015 American Gastroenterological Association Research Scholar Award (AGA RSA) till AB och NIH R01 till GF (DK52766).
Materials
| High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
| Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
| 100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
| MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
| Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
| Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
| Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| 3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| Electrophysiology Equipment | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
References
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The “normal” endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, 1081-1093 (2011).
- Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
- Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
- Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
- Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
- Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
- Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
- Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
- Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, 5959-5975 (2013).
- Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
