Electrofisiología de células enteras de células enterocromafines murino cultivadas primario
Summary
Las células enterocromafines (EC) constituyen un subconjunto pequeño de las células epiteliales gastrointestinales. CE las células son eléctricamente excitables y liberación de serotonina, sin embargo, las dificultades en el cultivo y la identificación de células EC limitada estudios fisiológicos. El método presentado aquí establece un modelo de cultivo primario susceptible de examen de las células EC por electrofisiología.
Abstract
Las células enterocromafines (CE) en el epitelio gastrointestinal (GI) constituyen la mayor subpoblación de células enteroendocrinas. Como las células sensoriales especializadas, células CE sensación estímulos luminales y convierten en eventos de lanzamiento de la serotonina (5-hyroxytryptamine, 5-HT). Sin embargo, la electrofisiología de estas células es mal entendido porque son difíciles para la cultura y para identificar. El método presentado en este papel contornos primaria CE los cultivos celulares optimizado para electrofisiología celular único. Este protocolo utiliza un reportero de la proteína fluorescente ciánica transgénicos (PPC) para identificar células de ratón CE en cultivos primarios mixtos, avanzar en el enfoque a la obtención de grabaciones de alta calidad de electrofisiología celular todo en modos de voltaje y corriente abrazadera.
Introduction
Epitelio gastrointestinal (GI) es una comunidad diversa que consta de varios tipos celulares. Enteroendocrinas células constituyen aproximadamente el 1% de todas las células epiteliales y células enterocromafines (CE) son el más grande células enteroendocrinas población1. Estudios recientes muestran que enteroendocrinas2 y CE3,4 células eléctricamente excitables. Estamos interesados en la comprensión de electrofisiología de la célula de primaria CE. Así, el propósito de este estudio fue establecer cultivos primarios de células de CE optimizados para electrofisiología celular todo.
Célula de CE existente líneas que producen y secretan 5-HT (p. ej., QGP-15, BON6, KRJ-17) y se han utilizado para estudiar la electrofisiología5,8 se generan típicamente de inmortalizó neoplásicas tejidos. Mientras que la información obtenida de estas líneas celulares es valioso5,8, estudios de electrofisiología celular primaria son necesarios para entender correctamente fisiología de la célula de CE. La electrofisiología de las células primarias de la CE requiere el aislamiento y cultivo de células epiteliales, que se ha visto limitada por la baja viabilidad de cultivos epiteliales.
El método de cultura presentado en este estudio se basa en ratones transgénicos con fluorescencia marcado CE las células, como Tph1-CFP9, utilizado en este estudio. El método optimiza la primaria mixto epiteliales culturas desarrollaron previamente2,10 de unicelular electrofisiología3. Los métodos anteriores utilizan combinaciones de tripsina/EDTA más A de colagenasa o EDTA y TDT para la digestión enzimática y utilizan gradientes de densidad para aislar específicamente y la cultura de conejillo de Indias11 y rata de células CE12. Más recientemente, organitas intestinales generaron y mecánicamente interrumpió las grabaciones electrofisiológicas4. Culturas mediante estos métodos son adecuadas para serotonina liberar experimentos, análisis de RT-qPCR y, aunque podría utilizarse para electrofisiología, dependen el éxito de la generación de organoide desperdiciador de tiempo, gradientes de densidad para identificar células de CE y la celulares efectos perturbadores de la tripsina y EDTA. Por el contrario, el protocolo descrito aquí mejora tratamientos enzimáticos y mecánicos, optimiza las condiciones de cultivo y agiliza los procedimientos para producir células CE únicas y saludables adecuadas para los estándares celulares necesarios para electrofisiología.
Este método será útil para los científicos que desean trabajar en las células primarias de EC en cultivos mixtos en lugar de culturas inmortalizadas y quieren investigar la electrofisiología de las células. Sin embargo, puede resultar menos adecuada para el estudio de poblaciones de células que necesitan cultivos de clasificación o a largo plazo que requieren supervivencia pasado 72 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprender cabalmente la función de la célula CE requiere un método de cultivo primario de alta calidad para generar células para electrofisiología de células enteras. Cultivos primarios de epitelio GI tradicionalmente han sido difíciles debido a la baja supervivencia. Aliviar este factor de confusión, el presente método rendimientos de cultivos de células CE singular del intestino pequeño o grande que son capaces de sobrevivir durante varios días.
Encontramos que los siguientes er…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen la Sra. Lyndsay Busby para asistencia administrativa y el Sr. Robert Highet de Mayo clínica División de ingeniería para el diseño y la impresión 3D de la inserción de plato de cultura. Este trabajo fue financiado por NIH K08 AB (DK106456), piloto y viabilidad beca AB de centro de Mayo Clinic para la señalización celular en gastroenterología (NIH P30DK084567) y 2015 American Gastroenterología Asociación investigación Scholar Award (RSA de AGA) AB y NIH R01 a GF (DK52766).
Materials
| High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
| Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
| 100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
| MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
| Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
| Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
| Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| 3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| Electrophysiology Equipment | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
References
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