Summary
यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए तैयार है और बनाए रखने प्राथमिक पिट्यूटरी medaka से सेल संस्कृतियों (Oryzias latipes) । इस प्रोटोकॉल में अनुकूलित शर्तों इस तरह के तापमान, परासरणीयता के रूप में महत्वपूर्ण मानकों, और पीएच मछली की शारीरिक स्थितियों नकल उतार द्वारा विचार में ले, जिससे शारीरिक रूप से अधिक सार्थक परिणाम को सक्षम करने ।
Abstract
प्राथमिक सेल संस्कृति एक शक्तिशाली आमतौर पर वैज्ञानिकों द्वारा इस्तेमाल के लिए सेलुलर गुण और एक नियंत्रित वातावरण में अलग कोशिकाओं के तंत्र का अध्ययन उपकरण है । स्तनधारियों और मछली के बीच फिजियोलॉजी में विशाल मतभेद के बावजूद, प्राथमिक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल मछली से अक्सर केवल मामूली संशोधनों के साथ अक्सर स्तनधारी संस्कृति की स्थिति पर आधारित हैं । पर्यावरणीय अंतर न केवल शरीर के तापमान को प्रभावित, लेकिन यह भी रक्त सीरम पैरामीटर जैसे परासरणीयता, पीएच, और पीएच बफर क्षमता । सेल संस्कृति मीडिया और इसी तरह काम कर समाधान के रूप में extracellular द्रव और/या रक्त सीरम जो एक सेल अनुकूलित है की विशेषताओं की नकल करने के लिए होती है, यह महत्वपूर्ण है कि इन मापदंडों विशेष रूप से प्रश्न में पशु को समायोजित कर रहे हैं ।
वर्तमान प्रोटोकॉल medaka (Oryzias latipes) के लिए अनुकूलित प्राथमिक संस्कृति स्थितियों का वर्णन करता है । प्रोटोकॉल को अलग करने और एक से अधिक सप्ताह के लिए स्वस्थ असंबद्ध पिट्यूटरी कोशिकाओं को बनाए रखने और निम्न चरणों को शामिल करने के लिए कैसे पर विस्तृत कदम प्रदान करता है: 1. medaka रक्त प्लाज्मा में पाए जाने वाले मानों को परासरणीयता का समायोजन, 2. का समायोजन सामान्य medaka तापमान (यहाँ मछलीघर सुविधा में) के लिए गर्मी तापमान, और 3. समान तापमान पर रहने वाले अन्य मछली प्रजातियों के लिए तुलनीय मूल्यों के लिए पीएच और बिकारबोनिट बफर का समायोजन. परिणाम वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रस्तुत medaka के लिए शारीरिक सार्थक परिणाम को बढ़ावा देने और अंय गैर स्तनधारी प्रजातियों से प्राथमिक सेल संस्कृतियों बनाने वैज्ञानिकों द्वारा एक संदर्भ गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
सेल संस्कृति मुख्य आणविक जैविक अनुसंधान में इस्तेमाल उपकरणों में से एक है, विभिंन जैविक सामांय सेलुलर फिजियोलॉजी से दवा स्क्रीनिंग और1कैंसरजनन को लेकर सवालों का जवाब देने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली प्रदान । प्राथमिक कोशिकाओं, एंजाइमी और/या यांत्रिक तरीकों का उपयोग कर पशु ऊतक से सीधे अलग, अक्सर अधिक तार्किक जैविक प्रतिक्रिया के रूप में सेल लाइनों से संबंधित माना जाता है vivo स्थिति में करीब हो सकता है । प्राथमिक सेल संस्कृतियों की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल प्रत्येक प्रजातियों और ब्याज की कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ताकि विशेषताओं की नकल करने के लिए जो एक सेल के अनुकूल है और शारीरिक सार्थक परिणाम प्राप्त करते हैं ।
कई प्रोटोकॉल स्तनधारी सेल सिस्टम के लिए संस्कृति की स्थिति का वर्णन है, जबकि समान प्रोटोकॉल मछली कोशिकाओं के लिए प्राथमिक संस्कृति की स्थिति का वर्णन बजाय तुलना में दुर्लभ हैं । कोशिकाओं को तापमान, पीएच, और परासरणीयता में तेजी से परिवर्तन की चपेट में हैं, और पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान विशेष रूप से कमजोर हैं । वाणिज्यिक नमक समाधान और संस्कृति मीडिया स्तनधारी सेल संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया teleost मछली के लिए इष्टतम नहीं कर रहे हैं, विशेष रूप से पीएच बफर सिस्टम (ओं) और परासरणीयता के संदर्भ में । इसलिए, उपाय करने के लिए और ब्याज की प्रजातियों में इन मापदंडों के शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्तर के समाधान को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
प्राथमिक पिट्यूटरी संस्कृतियों कई teleost मछली प्रजातियों से बनाया गया है, आम कार्प सहित (सायप्रिनस कार्पियो)2,3, घास कार्प (Ctenopharyngodon idella)4, सुनहरी (Carassius auratus )5, रेनबो ट्राउट (Oncorhynchus mykiss)6, यूरोपीय मछली (एंगुइला एंगुइला)7, tilapia (Oreochromis mossambicus)8, zebrafish (ढाणियो rerio)9, और अटलांटिक कॉड (गाड्स morhua)10. ब्याज की प्रजातियों के लिए मशीन के तापमान का समायोजन करने के अलावा, इन प्रोटोकॉल के कई स्तनधारी पर कोशिकाओं की स्थिति है कि ब्याज की प्रजातियों के लिए इष्टतम हो सकता है की तरह, एक पीएच के साथ ७.२ से एक humidified वातावरण में ७.५ जिसमें 3-5% कं2है । इसके अलावा, यह स्पष्ट नहीं है कि इन प्राथमिक सेल संस्कृतियों के कई तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया समाधान के परासरणीयता समायोजित और विभिंन समाधानों के बीच स्थिर थे ।
वर्तमान प्रोटोकॉल अटलांटिक कॉड10 से प्राथमिक संस्कृतियों के साथ पिछले काम पर आधारित है और मशीन तापमान, परासरणीयता, पीएच के समायोजन शामिल है, और पीएच बफर सिस्टम, कार्बन डाइऑक्साइड (पीसीओ2) के आंशिक दबाव सहित, medaka (ओ. latipes) के फिजियोलॉजी । Medaka एक छोटा (3-4 सेमी) मीठे पानी मछली, पूर्व एशिया के मूल निवासी है । इन दिनों, यह दुनिया भर में कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं में एक मॉडल प्रजातियों के रूप में प्रयोग किया जाता है, के रूप में यह अपेक्षाकृत नस्ल के लिए आसान है और कई आम मछली11रोगों के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी है । वहां एक मॉडल के रूप में medaka का उपयोग कर के कई फायदे हैं, 4 से एक तापमान सहिष्णुता सहित-40 ° c11, एक छोटी पीढ़ी के समय, पारदर्शी भ्रूण, एक सेक्स का निर्धारण जीन12, और एक अनुक्रम जीनोम13, साथ ही कई अंय उपलब्ध आनुवंशिक संसाधन ।
इस प्रोटोकॉल में प्राथमिक संस्कृति शर्तों 26 डिग्री सेल्सियस है कि medakas मछली सुविधा में रखा जाता है के तापमान से मेल करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । इसके अलावा, परासरणीयता ३२० mOsm/किलो से अटलांटिक कॉड से कम नमक पानी में रहने वाले medaka के लिए २९० mOsm/किलो ताजे पानी में रहने के लिए और परासरणीयता प्लाज्मा14के सामांय medaka के अनुसार है । इसकी तुलना में स्तनधारी प्लाज्मा की खासियत परासरणीयता 275 – 295 mOsm15की रेंज में है । मछली के तापमान की एक किस्म में रहता है और गिल कि पानी के साथ सीधे संपर्क में हैं, पीएच और स्तनधारियों में उन लोगों से अलग मछली में रक्त और extracellular द्रव की बफर क्षमता बना रही है । स्तनधारी संस्कृति मीडिया आमतौर पर बफर सिस्टम है कि लगभग ७.४ के पीएच में परिणाम शामिल है जब मीडिया ३७ डिग्री सेल्सियस पर humidified हवा में 5% सह2 के एक मानक वातावरण के लिए equilibrated रहे हैं । पीएच तापमान निर्भर है और तटस्थ पीएच के लिए मूल्य (पानी में) एक घटते तापमान16के साथ बढ़ जाती है । ठेठ teleost मछली प्लाज्मा पीएच ७.७ से ७.९17पर्वतमाला । इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन कॉड के लिए पीएच ७.८५ से 12 डिग्री सेल्सियस पर रखा medaka के लिए पीएच ७.७५ के लिए 1% से सह2 ०.५% से बढ़ कर 26 डिग्री सेल्सियस पर रखा में कमी शामिल थे ।
इसके अलावा, बिकारबोनिट बफर क्षमता मछली और स्तनधारियों में काफी अलग है । 2 कं आसानी से मछली में गिल पर विमर्श किया है और पानी में पीसीओ2 केवल18फेफड़ों में पीसीओ2 का एक छोटा सा अंश है । या तो तापमान या पीसीओ2 बदलने पीएच और मध्यम के बफर बदल जाएगा । नतीजतन, न तो पीएच और न ही पीसीओ2 स्तनधारी कोशिकाओं की मशीन के लिए सिफारिश की मछली कोशिकाओं के लिए इष्टतम है, और इसलिए, संस्कृति मीडिया बफर मछली के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक मूल्यों युक्त प्रणालियों के साथ अनुकूलित किया जाना चाहिए और ब्याज की विशेष प्रजातियों । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे medaka pituitaries से प्राथमिक सेल संस्कृतियों तैयार करने के लिए और मशीन तापमान, परासरणीयता, पीएच, और पीएच बफर सिस्टम के समायोजन शामिल अन्य महत्वपूर्ण मापदंडों के अलावा जब प्राथमिक सेल की तैयारी पर विचार करने के लिए गैर से संस्कृतियों-स्तनधारी प्रजातियों ।
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Protocol
इस अध्ययन में किया पशु प्रयोगों नार्वे जीवन विज्ञान विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया, देखभाल और अनुसंधान पशुओं के कल्याण के लिए दिशानिर्देश के बाद ।
1. समाधान की तैयारी
- सही माप सुनिश्चित करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार osmometer और पीएच मीटर उपकरणों जांचना ।
-
2 Ca के ५०० मिलीलीटर तैयार+-और2 मिलीग्राम +मुक्त है Dulbecco फास्फेट बफर खारा (dPBS), ७.७५ (चरण 1.2.1) और २९० mOsm/kg (चरण 1.2.2) करने के लिए पीएच को समायोजित करने से पहले एक बाँझ निस्पंदन (कदम 1.2.3) ।
- ध्यान से समाधान उभारते हुए एक 1 मीटर NaOH समाधान की बूँदें सावधानी से जोड़ने के द्वारा एक नपे पीएच मीटर के साथ ७.७५ करने के लिए पीएच समायोजित करें ।
- एक नपे osmometer का प्रयोग कर समाधान के परासरणीयता को मापने और परासरणीयता को २९० mOsm/किग्रा बढ़ाने के लिए आवश्यक mannitol की मात्रा की गणना करें । mannitol की आवश्यक मात्रा जोड़ें और फिर सही समायोजन सुनिश्चित करने के लिए समाधान के परासरणीयता को फिर से मापने ।
नोट: mannitol की मात्रा की आवश्यकता परासरणीयता मापा जाता है, जो आमतौर पर विभिन्न बैचेस के बीच भिन्न होता है पर निर्भर करता है । mannitol के एक अणु 1 आसमाटिक कण के बराबर होती है । - बाँझ-फ़िल्टर dPBS एक ०.२ µm फ़िल्टर का उपयोग कर समाधान.
नोट: समाधान 4 डिग्री सेल्सियस से कम 3 महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
- एल-glutamine और बिकारबोनिट के बिना Leibovitz (एल-15) संस्कृति माध्यम के ५०० मिलीलीटर तैयार है, और यह 10 मिमी NaHCO3 (चरण 1.3.1), ४.५ मिमी ग्लूकोज (चरण 1.3.2), और 2 मिमी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध glutamine (कदम 1.3.3) के साथ पूरक । २९० mOsm/किग्रा (step 1.3.4), बाँझ-फ़िल्टर आईटी (step 1.3.5) के लिए समाधान को समायोजित करें, और एक पेनिसिलिन-streptomycin समाधान (step 1.3.6) की २.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
नोट: समाधान 4 डिग्री सेल्सियस से कम 4 सप्ताह के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।- 10 मिमी समाधान प्राप्त करने के लिए संस्कृति माध्यम के ५०० एमएल प्रति NaHCO3 के ४२० मिलीग्राम जोड़ें ।
- एक ४.५ मिमी समाधान प्राप्त करने के लिए संस्कृति माध्यम के ५०० एमएल प्रति ग्लूकोज की ४०५ मिलीग्राम जोड़ें ।
- एक 2 मिमी समाधान प्राप्त करने के लिए संस्कृति माध्यम के ५०० मिलीलीटर में एक glutamine समाधान के 100x स्टॉक के 5 मिलीलीटर जोड़ें । हलचल जब तक सभी solutes भंग कर रहे हैं ।
- समाधान २९० mOsm/kg mannitol के साथ एक osmometer (चरण 1.2.2 में निष्पादित के रूप में) का उपयोग कर समायोजित करें ।
- एक ०.२ µm फिल्टर का उपयोग कर एल-15 मध्यम के एक बाँझ निस्पंदन प्रदर्शन.
- बाँझ निस्पंदन के बाद, एक पेनिसिलिन-streptomycin समाधान के २.५ मिलीलीटर जोड़ने के लिए, इसी ५० U/एमएल का पेनिसिलिन और ५० µ g/streptomycin के एमएल ।
- (०.१%) trypsin प्रकार द्वितीय-संशोधित dPBS में भंग (चरण १.२ में तैयार) का उपयोग कर एक trypsin समाधान की ५० मिलीलीटर तैयार करें । बाँझ प्लास्टिक ट्यूबों में 2 मिलीलीटर की aliquots बनाने और उन्हें-20 डिग्री सेल्सियस उपयोग तक की दुकान ।
नोट: 2 मिलीलीटर के Aliquots को कम 3 महीने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । - एक trypsin अवरोधक का उपयोग कर समाधान की ५० मिलीलीटर तैयार करें 1 मिलीग्राम/एमएल के (०.१%) trypsin अवरोध करनेवाला प्रकार i-S, और यह 2 µ जी के साथ पूरक/DNase मैं संशोधित dPBS (चरण १.२ में तैयार) में भंग की एमएल । बाँझ प्लास्टिक ट्यूबों में 2 मिलीलीटर की aliquots बनाने और उन्हें-20 डिग्री सेल्सियस उपयोग तक की दुकान ।
नोट: 2 मिलीलीटर के Aliquots को कम 3 महीने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
2. उपकरणों की तैयारी
- तैयार ग्लास पिपेट आग चमकाने कोशिका पृथक्करण के लिए टिप । 2 अलग आकार श्रेणियों के साथ युक्तियां बनाओ (0.6-0.8 µm के एक मध्यम खोलने और एक छोटे से खोलने 0.4-0.6 µm) समय और लौ से दूरी के साथ खेलने के द्वारा एक साथ पिपेट मोड़ । एक साफ गिलास कंटेनर में कांच पिपेट प्लेस और आटोक्लेव (४५ मिनट के लिए १०५ डिग्री सेल्सियस पर ठोस मोड का उपयोग कर) ।
- बर्फ के साथ एक polystyrene बॉक्स तैयार करें ।
- संशोधित dPBS के १.५ मिलीलीटर के साथ एक प्लास्टिक ट्यूब तैयार (१.२ कदम में तैयार) के दौरान विच्छेदन के लिए pituitaries हस्तांतरण और यह बर्फ पर रहते हैं ।
- संशोधित dPBS के 10 मिलीलीटर के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब तैयार (चरण १.२ में तैयार) और यह सेल पृथक्करण तक बर्फ पर रखने के लिए ।
- तैयार ताजा या गल aliquots trypsin और trypsin अवरोध करनेवाला समाधान (चरणों में तैयार १.४ और १.५) और उंहें बर्फ पर रखने के लिए जब तक का उपयोग करें ।
- pituitaries के रासायनिक पृथक्करण से पहले पानी वांछित तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए विच्छेदन शुरू करने से पहले 26 ° c करने के लिए पानी स्नान सेट करें ।
- पहले के दौरान ७०% इथेनॉल के साथ सभी विच्छेदन उपकरण साफ, के दौरान, और उपयोग के बाद, ठीक संदंश विच्छेदन और ठीक सुइयों और एक मोम की थाली के लिए उपयोग करने के लिए मछली पिन । कोशिकाओं की एक संभावित संदूषण से बचने के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान साफ दस्ताने (परिवर्तन और अक्सर साफ) का प्रयोग करें ।
3. पिट्यूटरी विच्छेदन और कोशिका पृथक्करण
- यह बर्फ कीचड़ (0 ° c) में डुबो कर मछली Euthanize । एक अपरिवर्तनीय hypothermic सदमे को सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 1 मिनट के लिए बर्फ कीचड़ में मछली छोड़ दें ।
नोट: स्थिरीकरण और संतुलन हानि कुछ सेकंड के बाद हो जाएगा । सुनिश्चित करें कि मछली पूरी तरह से बर्फ के पानी में डूब गया है और बर्फ के शीर्ष पर झूठ नहीं है, के रूप में बाद घुटन और संभावित त्वचा जलने के बजाय एक तेजी से और मानवीय hypothermic सदमे के लिए नेतृत्व करेंगे बनाओ । - जल्दी से विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक मोम की थाली के लिए एक शुद्ध में मछली हस्तांतरण और गर्दन के माध्यम से एक सुई पंच द्वारा रीढ़ को नष्ट ।
- मोम प्लेट ठीक सुइयों का उपयोग कर, सामने में एक सुई डालने के द्वारा (मुंह पर) और सिर के प्रत्येक पक्ष पर एक (मस्तिष्क के पीछे) सिर विच्छेदन से पहले स्थिर करने के लिए मछली के सिर पिन ।
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत मछली देखें और धीरे से एक angled टिप के साथ ठीक संदंश का उपयोग कर सिर के शीर्ष पर तराजू परिमार्जन ।
- ध्यान से त्वचा के नीचे ठीक संदंश की angled टिप को सिर के ऊपर से डालें और धीरे से संदंश को मुंह की दिशा में घुमाते हुए खोपड़ी की छत से निकालें, जबकि खोपड़ी की छत को संदंश में संलग्न करने के लिए एक फर्म पकड़ ले ।
- एक angled टिप के साथ संदंश का उपयोग कर पूरी तरह से बंद रीढ़ की हड्डी में कटौती ।
नोट: समय एक महत्वपूर्ण कारक है, इसलिए काम कुशलता और सटीकता से pituitaries के विच्छेदन से खर्च समय तक सीमित करने के लिए जब तक कोशिकाओं डिश में चढ़ाया जाता है । कुछ अभ्यास के बाद, पिट्यूटरी विच्छेदन 2 के आसपास ले जाना चाहिए-3 मछली प्रति मिनट, जिनमें से केवल लगभग 10 एस जब मस्तिष्क पहले से ही उजागर है पिट्यूटरी लेने की जरूरत है. - ध्यान से मुंह की ओर मस्तिष्क फ्लिप करने के लिए पिट्यूटरी बेनकाब और यह एक सीधे टिप के साथ स्वच्छ संदंश के साथ काटना. एक प्लास्टिक ट्यूब १.५ मिलीलीटर संशोधित dPBS (विवरण के लिए, २.३ कदम देख) बर्फ पर रखा युक्त करने के लिए पिट्यूटरी स्थानांतरण । संदंश की नोक की जांच करें माइक्रोस्कोप के तहत सुनिश्चित करें कि पिट्यूटरी ट्यूब करने के लिए सफलतापूर्वक जोड़ा गया है और कुछ भी नहीं संदंश पर छोड़ दिया है ।
नोट: काटना के रूप में कई pituitaries के रूप में की जरूरत है, संस्कृति व्यंजन है कि एक साथ तैयार होने जा रहे है की संख्या पर निर्भर करता है । अंगूठे का एक नियम के रूप में, पकवान प्रति वयस्क मछली से कम से 10 pituitaries की गणना करने के लिए कोशिकाओं का एक उचित घनत्व है (जो बहाव आवेदन पर निर्भर करता है) । - कमरे के तापमान पर 1-2 के लिए एक तालिका में एक स्थान के ऊपर केंद्रापसारक में pituitaries नीचे स्पिन । एक ग् पिपेट का प्रयोग करके dPBS को सावधानीपूर्वक निकालें और किसी भी pituitaries को हटाने से बचने के लिए सावधानी बरतें ।
- trypsin समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें (१.४ चरण में तैयार) pituitaries धोने के लिए, उंहें स्पिन नीचे एक तालिका में 1 के लिए केंद्रापसारक-2 s, और निकालने से पहले तरल के अधिकांश एक ग्लास पिपेट का उपयोग कर trypsin समाधान के एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर जोड़ने ।
- 30 मिनट के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान में ट्यूब, अधिमानतः कोमल मिलाते, या वैकल्पिक रूप से, झटका ट्यूब समय की एक जोड़ी के साथ गर्मी की अवधि के दौरान ।
- कमरे के तापमान पर 1-2 एस के लिए एक तालिका में pituitaries नीचे स्पिन और सुनिश्चित करें कि सभी pituitaries ट्यूब के तल पर स्थित हैं । एक गिलास पिपेट के साथ trypsin समाधान के अधिकांश निकालें और trypsin को निष्क्रिय और pituitaries धोने के लिए trypsin अवरोधक समाधान (चरण १.५ में तैयार) के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
- कमरे के तापमान पर 1-2 एस के लिए एक तालिका के अंदर एक के लिए उंहें नीचे कताई द्वारा ट्यूब के तल पर pituitaries लीजिए । एक गिलास पिपेट के साथ तरल के अधिकांश निकालें और trypsin अवरोधक समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें (चरण १.५ में तैयार) । 20 मिनट के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान पर ट्यूब प्लेस, अधिमानतः कोमल मिलाते हुए, या वैकल्पिक रूप से, ट्यूब के लिए समय की एक जोड़ी झटका मशीन अवधि के दौरान trypsin को निष्क्रिय करने के लिए ।
- एक ३५ मिमी पाली-डी-lysine-लेपित सेल संस्कृति डिश एक केंद्रीय ग्लास नीचे के साथ एल के 2 मिलीलीटर-15 मध्यम और दे कि मशीन को जोड़ने के द्वारा तैयार 26 डिग्री सेल्सियस और 1% सह2 के साथ कम से कम 10 मिनट के लिए इतना है कि यह कोशिकाओं को चढ़ाना से पहले सही तापमान और पीएच तक पहुंच सकते हैं ।
नोट: एक प्लास्टिक सेल संस्कृति पकवान भी इस्तेमाल किया जा सकता है । एक केंद्रीकृत गिलास नीचे के साथ एक डिश का उपयोग कर के मुख्य लाभ यह है कि क्षेत्र जहां कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है छोटे है, और इसलिए, कम पिट्यूटरी कोशिकाओं के प्रति पकवान की आवश्यकता है । कुछ बहाव आवेदन भी एक गिलास नीचे (यानी, कुछ इमेजिंग तकनीक) की आवश्यकता हो सकती है । - 15 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए ठंडा केंद्रापसारक सेट करने के लिए 4 ° c यह यांत्रिक पृथक्करण शुरू करने से पहले वांछित तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए ।
- trypsin अवरोध करनेवाला समाधान के साथ ट्यूब नीचे कताई द्वारा ट्यूब के तल पर pituitaries लीजिए (३.११ कदम से) एक तालिका में 1 के लिए-2 एस कमरे के तापमान पर और सुनिश्चित करें कि सभी pituitaries ट्यूब के तल पर ध्यान से पहले स्थित हैं एक गिलास पिपेट का उपयोग कर trypsin अवरोधक समाधान के अधिकांश को हटाने.
नोट: किसी लामिना प्रवाह पीठ (एलएएफ) कक्ष कार्य के लिए प्रमाणिकता कोशिकाओं के संक्रमण से बचने के लिए में प्रोटोकॉल के सभी निम्न चरणों का पालन करें । - बर्फ ठंडा संशोधित dPBS के 1 मिलीलीटर जोड़ें (चरण २.४ में तैयार) पिट्यूटरी ऊतक टुकड़े करने के लिए और धीरे ऊतक टुकड़े चूसना ऊपर और नीचे (6-7x) एक आग में पॉलिश ग्लास पिपेट (२.१ कदम में तैयार) ।
नोट: तापमान एक आवश्यक पहलू है, इसलिए 4 ° c पर सभी समाधान रखें । इस बिंदु से आगे, जब संभव हो बर्फ पर सभी कदम प्रदर्शन करते हैं । - कमरे के तापमान पर 1-2 एस के लिए एक तालिका के ऊपरी हिस्से में ऊतक के टुकड़े नीचे स्पिन और ध्यान से असंबद्ध कोशिकाओं (लगभग 1 मिलीलीटर) एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब बर्फ पर रखा करने के लिए युक्त dPBS का उपरी हिस्सा हस्तांतरण । पिपेट को ट्यूब के नीचे की ओर ले जाने से बचें जहां टिशू के टुकड़े रह गए हैं ।
- दोहराएं चरण-dissociating-1, 8 मिलीलीटर में एक समय में बर्फ की ठंड dPBS, जब तक dPBS के सभी 10 मिलीलीटर का उपयोग किया जाता है । एक मध्यम आकार के उद्घाटन के साथ एक गिलास पिपेट का उपयोग शुरू करने और अंत की दिशा में एक छोटे खोलने के साथ एक गिलास पिपेट के लिए स्विच (पिछले के लिए 3-4 dPBS के एमएल जोड़ा) पृथक्करण की । अगर वहां अभी भी दिखाई पृथक्करण प्रक्रिया के अंत में ऊतक टुकड़े कर रहे हैं, पृथक्करण के लिए dPBS के 2 अंतिम चरणों की ओर लगभग 10x के लिए pipetting बढ़ाने के लिए, और अंत में अवशिष्ट ऊतक टुकड़े के पीछे छोड़ दें । कोशिकाओं धीरे resuspend और बुलबुले बनाने से बचने के रूप में यह कोशिका को नुकसान का कारण हो सकता है जब कोशिकाओं बुलबुले की सतह के लिए देते हैं ।
नोट: यह इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम है और कुछ प्रशिक्षण के लिए एक अच्छा परिणाम प्राप्त करने की आवश्यकता है । - केंद्रापसारक में ट्यूब संतुलन (4 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व ठंडा) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २०० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन । जहां सेल गोली होगा ट्यूब के पक्ष को चिह्नित करने के लिए सुनिश्चित करें ।
- ध्यान से केंद्रापसारक से ट्यूब निकालें और धीरे से एक खाली 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब के लिए एक गिलास पिपेट के साथ supernatant हस्तांतरण सीधे केंद्रापसारक के बाद । हो supernatant के सबसे दूर करने के लिए, लेकिन ध्यान रखना छोटे (अक्सर अदृश्य) सेल गोली खोने से बचने के लिए सुनिश्चित करें ।
- ध्यान से 50-100 µ एल के एल-15 संस्कृति माध्यम में सेल गोली पुनः स्थगित ।
नोट: इस कदम पर, यह कोशिकाओं की गणना और/या एक व्यवहार्यता परीक्षण प्रदर्शन (जैसे एक सेल trypan नीले रंग की उपस्थिति में एक hemocytometer का उपयोग कर गिनती के रूप में), लेकिन सावधान रहना है कि इस प्रयोजन के लिए सेल निलंबन के भाग का उपयोग कर उपज कम हो जाएगा । के रूप में यह पकवान के केंद्र के बाहर फैलाना कोशिकाओं के जोखिम में वृद्धि होगी एक बड़े निलंबन की मात्रा का उपयोग करने से बचें । - ध्यान से सेल संस्कृति के बीच में असंबद्ध कोशिकाओं ड्रिप एल के 2 मिलीलीटर-15 मध्यम (३.१३ कदम में तैयार) युक्त पकवान । कोशिकाओं को मशीन के लिए उंहें जाने से पहले लगभग 5 मिनट के लिए पकवान के नीचे करने के लिए सिंक करने के लिए, कांच नीचे के धंसा भाग के बाहर फैल कोशिकाओं होने से बचने के लिए अनुमति देते हैं ।
- 26 डिग्री सेल्सियस और 1% CO2 पर पकवान मशीन सभी कोशिकाओं को अच्छी तरह से सिंक करने के लिए अनुमति देने के लिए और पकवान के नीचे करने के लिए देते हैं ।
- 30 मिनट के बाद, माइक्रोस्कोप में कोशिकाओं को देखो यकीन है कि वे संस्कृति पकवान से जुड़ी है बनाने के लिए ।
- के लिए 26 डिग्री सेल्सियस और 1% सह2पर कोशिकाओं की मशीन जारी रखें ।
- ध्यान से (लेकिन सभी नहीं) मध्यम हर 3-4 दिन के अधिकांश बदल जाते हैं ।
नोट: मध्यम को अधिक बार बदलने से बचें, क्योंकि इससे कोशिकाएं परेशान हो सकती हैं और उन्हें कांच के नीचे से अलग कर सकते हैं । उंहें बोने के बाद एक सप्ताह के भीतर प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें ।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल medaka pituitaries से एक प्राथमिक सेल संस्कृति की तैयारी का वर्णन करता है और स्वस्थ कोशिकाओं है कि एक संस्कृति में कम से एक सप्ताह के लिए बनाए रखा जा सकता है प्रदान करता है । प्रोटोकॉल medaka14 के लिए शारीरिक प्रासंगिक मूल्यों पर आधारित है और इसके अतिरिक्त वयस्क मछली में पिट्यूटरी ऊतक के लिए अनुकूलित है, ७.७५ के एक पीएच का उपयोग कर और मढ़वाया के लिए ऊतक कटाई से पूरी प्रक्रिया के दौरान २९० mOsm/ संस्कृति में कोशिकाओं (चित्रा 1 और चित्रा 2) ।
इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित प्राथमिक सेल संस्कृतियों पर प्रयोगों से प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3, चित्रा 4, और चित्रा 5में प्रदर्शित कर रहे हैं । यहां प्रस्तुत परिणामों के लिए, एक ट्रांसजेनिक medaka लाइन, जहां luteinizing हार्मोन (Lh)-gonadotrope कोशिकाओं ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एक्सप्रेस,19का उपयोग किया गया था । चित्रा 3 दिन से एक प्राथमिक सेल संस्कृति के पकवान में एक प्रतिनिधि क्षेत्र से पता चलता है 7 दिन से बोने के बाद, दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों सहित, GFP-व्यक्त Lh-gonadotrope कोशिकाओं को दिखा । पकवान प्रति लगभग 10 वयस्क medaka pituitaries के आसपास का उपयोग आमतौर पर लगभग 5 x 104 के घनत्व में परिणाम-1 x 10 डिश प्रति5 कोशिकाओं बोने के बाद । संस्कृति में पिट्यूटरी कोशिकाओं की व्यवहार्यता दिन 1, 3 पर संस्कृति में GFP-व्यक्त कोशिकाओं की कुल संख्या के आधार पर गणना की जाती है, और 7 चढ़ाना के बाद, के रूप में 0 दिन की तुलना में (चित्रा 4) । 4 चित्रा में दिखाया गया ग्राफ इंगित करता है कि मरने कोशिकाओं की संख्या लगभग समय के साथ लगातार है, 1 दिन के बाद जीवित कोशिकाओं के ९५% से अधिक है, जबकि ९०% से अधिक 3 दिनों के बाद भी जीवित है । हालांकि समय के साथ सेल व्यवहार्यता में एक छोटी सी गिरावट है, ज्यादातर कोशिकाओं (लगभग ७५%) संस्कृति में एक सप्ताह के बाद भी जीवित हैं । GFP-व्यक्त Lh-gonadotrope कोशिकाओं की Electrophysiological रिकॉर्डिंग (Strandabø, एट अलमें वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया.) 20 दिखाने के लिए है कि कोशिकाओं को कार्रवाई करने में सक्षम है सहज रूप से संस्कृति में 4 दिनों के बाद क्षमता (आंकड़ा 5 ए) । इसके अलावा, गोनॉडोट्रॉफिन जारी हार्मोन की उत्तेजना पर, कोशिका झिल्ली की एक प्रारंभिक क्षणिक hyperpolarization फायरिंग आवृत्ति में एक नाटकीय वृद्धि है कि एक ध्रुवीकरण और कार्रवाई की अवधि में वृद्धि के साथ सहवर्ती है द्वारा पीछा किया जाता है संभावितों (चित्रा 5B) ।
चित्रा 1: पिट्यूटरी प्राथमिक सेल संस्कृति तकनीक का अवलोकन. Pituitaries ठीक संदंश के साथ विच्छेदित और बर्फ पर संशोधित dPBS युक्त एक प्लास्टिक ट्यूब को हस्तांतरित कर रहे है (प्रोटोकॉल के चरण 1) 26 डिग्री सेल्सियस पर Pituitaries के साथ trypsin के एंजाइमी पाचन तक (चरण 2), एक trypsin अवरोध करनेवाला के साथ एक निष्क्रियता के बाद 26 डिग्री सेल्सियस (दिखाया नहीं) । एक गिलास पिपेट के साथ enzymatically पच pituitaries के यांत्रिक पृथक्करण ध्यान से बर्फ पर dPBS में प्रदर्शन किया है (चरण 3), 4 डिग्री सेल्सियस पर एक केंद्रापसारक द्वारा पीछा (चरण 4). अंत में, सेल गोली संस्कृति के माध्यम में भंग और कोशिकाओं को एक कोशिका संस्कृति पकवान (चरण 5) में बाहर चढ़ाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: medaka पिट्यूटरी विच्छेदन का विवरण. (क) एक मैटीरियल medaka (पृष्ठीय दृश्य) का सिर एक मोम की थाली पर पिन कर दिया जाता है, और खोपड़ी की छत के ऊपर मस्तिष्क के शीर्ष को बेनकाब करने के लिए ठीक संदंश के साथ निकल जाता है । (ख) रीढ़ की हड्डी गंभीर है, और मस्तिष्क के सिर के सामने की ओर ऐसी है कि पिट्यूटरी उजागर होता है पर फ़्लिप । (ग) पिट्यूटरी साफ, ठीक संदंश के साथ एकत्र किया जाता है । पैनल बी और सीमें पिट्यूटरी को Arrowhead अंक स्केल बार = १,००० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: Medaka पिट्यूटरी प्राथमिक कोशिका संस्कृति. इन पैनलों एक प्रतिनिधि medaka पिट्यूटरी प्राथमिक सेल संस्कृति के उच्च संकल्प फोकल छवियां दिन में 0, दिन 3, और 7 दिन बोने के बाद दिखाते हैं । ऊपरी पैनल डिश में एक प्रतिनिधि क्षेत्र के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी छवियों से पता चलता है, मध्य पैनल GFP-व्यक्त Lh-gonadotrope कोशिकाओं को प्रदर्शित दृश्य के एक ही क्षेत्र के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों से पता चलता है, और कम पैनल दो के एक उपरिशाई है । स्केल बार = 20 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: संस्कृति में medaka पिट्यूटरी कोशिकाओं की व्यवहार्यता. इस आंकड़े पिट्यूटरी प्राथमिक सेल संस्कृतियों की व्यवहार्यता से पता चलता है दिन में मापा 0, 1, 3, और 7 बोने के बाद. संख्या ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर CellProfiler V2 का उपयोग कर गणना कर रहे हैं और GFP-व्यक्त Lh-gonadotrope कोशिकाओं के प्रति पकवान अलग समय बिंदुओं पर, समय 0 की तुलना में की कुल संख्या पर आधारित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: पिट्यूटरी कोशिकाओं के Electrophysiological रिकॉर्डिंग. ये पैनल एक प्राथमिक सेल संस्कृति में एक GFP-व्यक्त Lh-gonadotrope सेल से electrophysiological रिकॉर्डिंग दिखाने के बोने के बाद 4 दिन में प्रदर्शन किया, दिखा (क) सहज कार्रवाई की क्षमता का एक प्रतिनिधि ट्रेस, (ख) के बाद एक 10 एस के लिए गोनॉडोट्रॉफिन-रिलीजिंग हार्मोन Gnrh1 के साथ उत्तेजना Gnrh1 उत्तेजना कोशिका झिल्ली के एक hyperpolarization के साथ एक biphasic प्रतिक्रिया लाती है, एक ध्रुवीकरण और कार्रवाई की क्षमता की वृद्धि की अवधि के बाद (५०% पीक पर मापा) से ८.९ ± ३.० ms करने के लिए उत्तेजना से पहले २९.२ ± ९.९ ms के बाद उत्तेजना. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणालियों में शोधकर्ताओं के लिए शक्तिशाली उपकरण प्रदान करने के लिए विभिंन जैविक प्रश्नों के ढेर सारे जवाब अगर सही तरीके से इस्तेमाल किया1। यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि असंबद्ध कोशिकाओं है कि पड़ोसी कोशिकाओं को अपने कनेक्शन खो दिया है विभिंन कार्यात्मक गुण प्राप्त हो सकता है से वे मूल रूप से vivo मेंथा । इन विट्रो प्रयोगों से प्राप्त परिणामों की गलत व्याख्या के जोखिम पर होने से बचने के लिए, यह प्रजातियों और सेल प्रकार के हित के लिए प्राथमिक कोशिका संस्कृति प्रक्रिया को समायोजित करने पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. मानक संस्कृति प्रक्रियाओं और इस्तेमाल किया समाधान के भी उदारवादी समायोजन अक्सर एक विशिष्ट कोशिका प्रकार की संस्कृति की स्थिति को काफी बदलने के लिए पर्याप्त हैं ।
इस प्रोटोकॉल की तैयारी और वयस्क medaka pituitaries, जो इस तरह के तापमान, परासरणीयता, पीएच के रूप में मानकों का समायोजन करके प्राप्त किया जा सकता से प्राथमिक सेल संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए अनुकूलित शर्तों का वर्णन करता है, और उपयोग समाधान के पीसीओ2 , इस प्रजाति की दैहिक स्थितियों से मेल खाती है । पीएच तापमान निर्भर है और चाहिए, इसलिए भी विभिंन तापमान17पर रहने वाले teleost मछली के विभिंन प्रजातियों के बीच समायोजित किया जाना चाहिए । कक्ष पृथक्करण और संवर्धन के दौरान उपयोग किए जाने वाले सभी समाधानों के परासरणीयता को भी समायोजित किया जाना चाहिए ताकि कक्षों की दशा में सुधार किया जा सके. विशेष रूप से, यदि अलगाव की प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया विभिंन समाधानों के बीच परासरणीयता में एक विसंगति है, यह संस्कृति की गुणवत्ता पर विनाशकारी प्रभाव हो सकता है, एक कम व्यवहार्यता के लिए अग्रणी (लेखक अपने अप्रकाशित परिणाम) । Hyperosmotic समाधान कोशिकाओं को हटना करने के लिए कारण होगा (और इसके विपरीत), जिससे झिल्ली अखंडता और झिल्ली प्रोटीन समारोह21के साथ हस्तक्षेप. इस संदर्भ में एक महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि ऐसे परासरणीयता और पीएच के रूप में मानकों को आम तौर पर नहीं मापा जाता है और न ही वाणिज्यिक बफ़र्स और संस्कृति स्तनधारी संस्कृति की स्थिति में इस्तेमाल किया मीडिया के विभिंन बैचों के बीच स्थिर । अलगाव की प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल विभिंन समाधानों के बीच परासरणीयता और पीएच में मतभेद हर समय से बचना चाहिए ।
इस प्रोटोकॉल की सफलता दर प्रशिक्षण द्वारा सुधार हुआ है, तो यह उंमीद है शोधकर्ताओं को कुछ समय की जरूरत है तकनीक के विभिंन चरणों से परिचित हो । उदाहरण के लिए, pituitaries के विच्छेदन से समय जब तक कोशिकाओं को पकवान में चढ़ाया जाता है व्युत्क्रम कोशिका स्वास्थ्य से संबंधित है । एक गिलास पिपेट का उपयोग कर pituitaries के यांत्रिक पृथक्करण प्रोटोकॉल का एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण कदम है और यह एक अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता है । पृथक्करण प्रक्रिया आसमाटिक और यांत्रिक तनाव है कि कोशिकाओं के लिए हानिकारक है परिचय कर सकते हैं । यांत्रिक पृथक्करण के लिए दोहराया चरणों में संशोधित dPBS की छोटी मात्रा के अलावा एक gentler पृथक्करण प्रक्रिया जहां पहले से ही असंबद्ध कोशिकाओं को एक नई ट्यूब करने के लिए स्थानांतरित कर रहे है और अछूता छोड़ दिया, जबकि शोधकर्ता के लिए जारी है सुनिश्चित करता है dPBS की एक नई मात्रा में ऊतक से अतिरिक्त कोशिकाओं अलग कर देना ।
इस प्रोटोकॉल वयस्क medaka पिट्यूटरी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित है । विभिंन प्रजातियों, ऊतकों, या एक ही ऊतक के भीतर जानवर की भी अलग जीवन चरणों संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, अपरिपक्व पशुओं से प्राप्त कोशिकाओं और अधिक नाजुक हो सकता है, इसलिए, और अधिक apoptosis और कोशिका मृत्यु की ओर अतिसंवेदनशील और, इस प्रकार, विशेष रूप से एक gentler पृथक्करण प्रक्रिया की ओर, प्रोटोकॉल को समायोजित करने की आवश्यकता जरूरत सकता है । यांत्रिक पृथक्करण एक गिलास पिपेट का उपयोग प्रक्रिया का एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है, के रूप में एक भी सावधान यांत्रिक पृथक्करण एक कम लाभ के लिए नेतृत्व करेंगे, जबकि एक बहुत मोटा एक apoptosis और/ अलग एंजाइमों पृथक्करण के लिए माना जाता है, तो यह एक अलग पाचन समय और एंजाइम एकाग्रता का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है. Medaka pituitaries बहुत छोटे है और अपेक्षाकृत आसान करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग अलग कर देना । हालांकि, अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलन पृथक्करण मलबे को हटाने के लिए के बाद एक जाल फिल्टर के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है. इस प्रोटोकॉल की सफलता भी काफी हद तक बाँझ शर्तों के तहत कदम प्रदर्शन करने के लिए कोशिकाओं को दूषित से बचने पर निर्भर करता है ।
डिश प्रति बीज के लिए कोशिकाओं की संख्या शुरू में pituitaries की संख्या पर निर्भर करता है, साथ ही पृथक्करण प्रक्रिया की सफलता । वहां मोटे तौर पर एक बरकरार वयस्क medaka पिट्यूटरी में लगभग १५,००० कोशिकाओं रहे हैं । हालांकि, कोशिकाओं पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान खो रहे हैं और यह एक प्रयोग के लिए आवश्यक pituitaries की संख्या की गणना करते समय के लिए हिसाब होना चाहिए. डिश प्रति कम से कम 10 pituitaries का प्रयोग आमतौर पर लगभग ५०,००० के घनत्व में परिणाम होगा-पकवान प्रति १००,००० कोशिकाओं । इस घनत्व पर, एकत्रीकरण किसी भी महत्वपूर्ण राशि में नहीं फार्म, यहां तक कि संस्कृति में 7 दिनों के बाद । ध्यान से, एकत्रीकरण पर निर्भर घनत्व लगता है, के रूप में सघन कोशिकाओं वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, और वे कुल करने लगते हैं । कुछ प्रक्रियाओं एक सघन संस्कृति की आवश्यकता हो सकती है और, इसलिए, इष्टतम बीज घनत्व बहाव आवेदन के आधार पर विचार किया जाना चाहिए । यह एक महत्वपूर्ण बात को ध्यान में रखना जब pituitaries की संख्या की योजना बना पकवान प्रति प्रयोग है ।
सबसे आम बहाव अनुप्रयोगों बीज बोने के बाद पहले कुछ दिनों के भीतर प्राथमिक सेल संस्कृतियों का उपयोग करें । यहां प्रस्तुत परिणाम, कोशिका व्यवहार्यता से electrophysiological रिकॉर्डिंग करने के लिए, यह दिखाने के लिए कि यह प्राथमिक सेल संस्कृतियों से अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए 1 सप्ताह के लिए बीज बोने के बाद के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार संभव है । फिर भी, संस्कृतियों अब रखा जा सकता है, और स्वस्थ कोशिकाओं को संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद भी मौजूद है (' लेखक अपने अप्रकाशित परिणाम) । अनुकूलित शर्तों इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत शारीरिक सार्थक परिणाम की सुविधा और अंय गैर से प्राथमिक सेल संस्कृतियों की तैयारी वैज्ञानिकों स्तनधारी कोशिकाओं के लिए फायदेमंद हो सकता है ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है.
Acknowledgments
इस परियोजना के नार्वे के जीवन विज्ञान विश्वविद्यालय और नॉर्वे, अनुदान संख्या २४३८११ और २४४४६१ (जलीय कृषि कार्यक्रम) के अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया । हम मछली की सुविधा को बनाए रखने के लिए नार्वे के जीवन विज्ञान विश्वविद्यालय में लूर्डेस Carreon तन के लिए आभारी हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 mL culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 µg/mL Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straight tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles/insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
References
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