Summary
Ce protocole fournit une méthode pour établir des souris humanisées (hu-NSG) via intrahépatique injection de cellules souches hématopoïétiques humaines à des souris NSG néonatales conditionné par rayonnement. La souris de l’hu-NSG est sensible à l’infection par le VIH et combinatoire antirétrovirales (cART) et sert de modèle physiopathologique adapté pour les enquêtes de réplication et latence du VIH.
Abstract
Règlements éthiques et les défis techniques de recherche en pathologie humaine, immunologie et développement thérapeutique ont mis des petits modèles animaux en forte demande. Avec une étroite ressemblance génétique et comportementale pour les humains, petits animaux tels que la souris sont de bons candidats pour les modèles de maladies humaines, à travers lequel les réponses et l’homme-comme des symptômes peuvent être récapitulées. En outre, le bagage génétique de la souris peut être modifié pour tenir compte des demandes diverses. La sourisnull (NSG) de NOD/SCID/IL2rγ est une des souches de souris immunodéprimées plus largement utilisé ; Il permet la greffe avec des cellules souches hématopoïétiques humaines et/ou des tissus humains et le développement ultérieur du système immunitaire humain fonctionnel. Il s’agit d’un jalon essentiel dans la compréhension le pronostic et la physiopathologie des maladies humaines spécifiques telles que le VIH/sida et d’aider à la recherche d’un remède. Ici, nous présentons un protocole détaillé permettant de générer un modèle de souris humanisé NSG (hu-NSG) par transplantation de cellules souches hématopoïétiques dans une souris NSG néonatale conditionné par rayonnement. Le modèle murin de hu-NSG montre le développement de lignées multiples des cellules souches humaines transplantées et de susceptibilité à l’infection virale du VIH-1. Il récapitule aussi des caractéristiques biologiques clés en réponse à un traitement antirétroviral combinatoire (cART).
Introduction
Parce que l’établissement approprié des modèles animaux de maladies humaines est essentielle pour trouver un remède, modèles animaux appropriés ont été longtemps poursuivis et améliorés au fil du temps. Plusieurs souches de modèles murins immunodéprimés ont été développés qui permettent la prise de la greffe de tissus et/ou de cellules humaines et de l’exécution ultérieure des fonctions humanisé1,2. Ces modèles de souris humanisée sont critiques pour les enquêtes sur les maladies humaines spécifiques3,4,5.
Syndrome d’immunodéficience acquise (sida) résultant de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est un exemple. Avant la création de modèles murins humanisés, des limites éthiques et techniques confinée études animales précliniques de VIH/sida aux primates non humains3. Toutefois, les dépenses élevées et les exigences pour des soins spécialisés pour tel animal gênent études de VIH/sida dans les milieux universitaires typiques. Principalement, le VIH infecte les cellules humaines CD4 + T et impact sur le développement et les réactions immunitaires des autres cellules immunitaires humaines telles que les lymphocytes B, les macrophages et les cellules dendritiques6; C’est pourquoi, petits modèles animaux transplantés ayant un système immunitaire humain fonctionnel sont en forte demande.
Une percée est venue en 1988, quand CB17 -scid souris présentant une mutation Prkdcscid ont été conçus et ont montré une greffe réussie du système immunitaire humain1. Les résultats de mutation Prkdcscid dans les fonctions de cellules B et T défectueux et une ablation du système immunitaire adaptatif chez la souris, permettant ainsi la prise de greffe des périphériques humains de sang cellules mononucléaires (PBMC), les cellules souches hématopoïétiques (CSH), et les tissus hématopoïétiques foetaux7,8. Néanmoins, les faibles niveaux de prise de greffe sont fréquemment observées dans ce modèle ; les causes possibles sont 1) résiduelle activité du système immunitaire innée modulée par l’intermédiaire de tueuses naturelles (NK)-cellules et 2) le dernier stade de développement des souris (perméabilité) de lymphocytes T et B5. Le développement ultérieur de la non obèses diabétiques (Adi)-modèle de sourisscid atteint la régulation à la baisse spectaculaire de l’activité des cellules NK ; ainsi, il est capable de soutenir un niveau plus élevé et plus greffe durable du système immunitaire humain composants9. En plus d’autres suppriment ou entravent le développement de l’immunité innée, portant le total opercule de l’interleukine-2 récepteurs-chaîne γ (Il2rg) ou de troncature dans la (NOD) des modèles de souris -scid arrière-plan ont été établis. Il2rg, également connu sous le nom commun cytokine-receptor γ-chaîne, est un élément indispensable de diverses cytokines récepteurs10,11,12,13. Souches comme clin de œil. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) et NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) présentent des perturbations robuste de signalisation des cytokines de souris et une ablation complète du développement des cellules NK, dans Ajout d’une insuffisance sévère de l’immunité adaptative14,15,16.
Trois modèles de souris humanisée portant un scid , mutation et Il2rg knock-out sont fréquemment employés dans la recherche sur le VIH/sida : le modèle de BLT (moelle osseuse/foie/Thymus), le modèle PBL (leucocytes périphériques de sang) et le modèle SRC (cellule de repeuplement de SCID) 3. modèle le BLT est créé via transplantation chirurgicale du foie foetal humain et le thymus sous la capsule rénale de souris accompagné d’une injection intraveineuse de foetus foie autorenouveler3,17,18. Le modèle de souris BLT offre une efficacité élevée de greffe, développement de cellules hématopoïétiques humaines dans toutes les lignées et mise en place d’un système immunitaire fort ; en outre, les lymphocytes T sont instruits dans un thymus autologue humain et pièce restriction HLA des réponses immunitaires4,5,17,19. Toutefois, l’obligation pour les procédures chirurgicales reste l’inconvénient majeur du modèle BLT. Le modèle de souris PBL est établi par une injection intraveineuse avec des cellules lymphoïdes périphériques humaines. Le modèle PBL offre commodité et rendements greffe réussie de lymphocytes, mais son application est limitée en raison insuffisante de B-cellule et greffe de cellules myéloïdes, greffe faible niveaux globales et l’apparition de sévère greffon - versus - host disease (GVHD)3 ,,20. Le modèle de souris SRC s’établit par l’injection de csh humaine dans nouveau-né ou un jeunes adultes souris SCID. Il montre efficacité greffe moyen supérieur à 25 % (évalué comme sang périphérique CD45 pourcentage) et prend en charge le développement de multiple-lignée de csh injectée et l’élaboration d’un système immunitaire inné. Toutefois, la limitation du modèle SRC est que la réponse des lymphocytes est souris H2 restreints au lieu de restriction HLA humain14,21.
Le modèle de souris SRC est considéré comme un modèle fiable et facile pour le VIH/sida petits animaux des études précliniques, illustrée par la prise de greffe cohérente d’un système immunitaire et hématopoïétique mise au point. Précédemment, nous avons signalé la mise en place d’un modèle de souris de NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) et décrit son application dans la réplication du VIH et de la latence des études22,23,24. Ce modèle de souris de hu-NSG présente des niveaux élevés de domiciliation de la moelle osseuse, la susceptibilité à l’infection par le VIH et la récapitulation de l’infection par le VIH et la pathogenèse. En outre, le modèle de souris de hu-NSG réagit de façon appropriée à une thérapie antirétrovirale combinatoire (charrette) et récapitule le rebond viral plasmatique après le retrait de chariot, confirmant la mise en place d’un VIH latence réservoir25,26 ,,27. Ce réservoir de latence du VIH est étayé par la production d’aptes à la réplication du VIH virus ex vivo induite par l’homme au repos CD4 + T-cellules isolées de souris infectés et traités panier hu-NSG.
Ici, les auteurs décrivent le protocole détaillé pour la mise en place du modèle souris hu-NSG de souris néonatales de soins infirmiers, y compris les procédures relies au traitement du VIH infection et panier pour le développement de la latence. Nous espérons que ce protocole d’offrir un nouvel ensemble d’approches dans les études sur des animaux concernant le VIH virologie, latence et traitement du VIH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tous les soins des animaux et des procédures ont été réalisées selon les protocoles revus et approuvés par la ville de Hope institutionnels Animal Care et utilisation Comité (IACUC) détenu par le chercheur principal de cette étude (Dr John Rossi, 12034 # IACUC). Tissu du foie foetal humain provient d’Advanced Bioscience ressources (Alameda, CA), un organisme sans but lucratif, conformément à la réglementation fédérale et d’état. Le vendeur a son propre Institutional Review Board (IRB) et est conforme aux exigences de protection des sujets humains. PBMC humaines est isolées à partir des échantillons de sang périphérique mis au rebut de donneurs sains anonymes de la ville de centre de donneur de sang de Hope (Duarte, CA), avec aucune identification concernant l’âge, la race, sexe ou l’origine ethnique. LA CISR #/ REF #: 97071/075546
1. Généralités pratiques aseptiques
- Réaliser des expériences de culture de tissus en désigné à flux laminaire.
- Garder le milieu de culture tissulaire et de suppléments dans des conditions stériles et filtrer à l’aide d’un avant d’unité de filtration 0,22 µm à utiliser.
- Préserver préparés autorenouveler humaine dans des tubes stériles et rester sur la glace jusqu'à l’injection.
- En raison d’un déficit immunitaire sévère, gérer la souris NSG aseptiquement. Porter une robe de chirurgie jetables, cap de cheveux, masque facial, couvre-chaussures et des gants pour éviter la contamination. Désinfecter la surface de banc, titulaire de l’irradiation et chambre d’induction de l’anesthésie avec agent de stérilisation chlore dioxyde de base (p. ex., Clidox) avant et après expériences.
- Après rétro-orbitaire hémorragie pour éviter la sécheresse des yeux, appliquer la pommade ophtalmique à base de pétrole.
- Changer d’antibiotique contenant alimentation pour prévenir l’infection en raison de saignements de rétro-orbitaire.
2. infectés par le Virus de manipulation de VIH, rongeurs et les échantillons de sang et les tissus contenant des Virus
Attention : Le VIH est un pathogène humain classe 3 ; les règles de manutention doivent être suivies à la lettre.
- Gérer les échantillons contenant le virus VIH a désigné BSL2 + / espace laboratoire 3. Verrouiller les réactifs contenant des virus solidement dans un conteneur secondaire pendant le transport. Désinfecter la surface extérieure de tous les conteneurs en l’essuyant approfondie avec 10 % eau de Javel et l’isopropanol avant le transport.
- Garder tous les déchets contenant des virus dans des conteneurs de déchets désignés avec 2 ou 3 couches de sacs de déchets biologiques. Avant l’élimination des déchets, désinfecter en pulvérisant généreusement les déchets avec iode/éthoxylés nonylphénol solution (par exemple, Wescodyne) et stériliser.
- Porter des équipements de protection individuelle : bouchon de cheveux, couvercle frontal, écran facial anti-éclaboussure, couvre-chaussures, robe de chirurgie jetables et gants de double-couche.
- Gérer des rongeurs infectés avec une extrême prudence. Procéder à des injections et des collections de sang tandis que les souris sont sous anesthésie (étapes 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3 et 8.1-8,2).
3. isolement de cellules souches hématopoïétiques
- Préparer la solution de collagénase/a pour la digestion du tissu.
- Dissoudre la poudre de collagénase/a pour faire la solution-mère à une concentration de 100 mg/mL et stocker la solution mère de collagénase/a dans 150 µL d’extraits à-20 ° C.
- Pour utiliser la solution de collagènase, diluer 150 µL de stock de collagénase/a avec 15 mL de milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de FCS et 1 % la pénicilline/streptomycine.
Remarque : La concentration finale de collagénase/a pour la digestion du tissu est de 1 mg/mL.
- Avec une lame de rasoir stérile, couper le tissu hépatique foetal (16 à 24 semaines de gestation) en petits morceaux (environ 2-3 mm3 en taille) suivi par digestion avec solution de collagénase/a (1 mg/mL) pendant 30 minutes à température ambiante. Ajuster le volume de solution de digestion afin que tous les morceaux de tissus sont complètement submergées. Utilisez l’extrémité arrière du piston de la seringue pour meuler doucement l’échantillon de tissu pour faciliter la digestion.
- Passer le mélange de digestion à travers un filtre de maille de nylon stérile de 70 µm pour acquérir une suspension de cellules du même.
- Enrichir pour CD34 + CSS en utilisant un système de MACS par les instructions du fabricant.
- Compter le pourcentage viable d’enrichi CD34 + CSS à l’aide d’un hémacytomètre28 et procéder à l’injection intrahépatique dans souris néonatales de soins infirmiers.
- Congeler le restant enrichi CD34 + GPX en gelant les médias (p. ex., CryoStor CS2) et préserver les cellules dans un réservoir d’azote liquide. Lors de l’utilisation future, racontent le pourcentage viable de décongelé CD34 + autorenouveler avant l’injection. Avec l’utilisation de médias de gel, dégel après viabilité est entre 80 et 90 %.
4. intrahépatique Injection de csh humaines CD34 + souris néonatales NSG
NOTE : Souris néonatales NSG 2-3 jours après la naissance sont plus appropriés pour cette procédure, car ils sont assez forts pour supporter l’irradiation à dose létale moitié, tandis que de jeunes suffisamment pour avoir totalement vicié le système immunitaire. Aucune anesthésie n’est nécessaire pour l’injection de HSC.
- Placez la litière entière de souris néonatales de NSG (généralement de 5 à 10 souris, les deux sexes) dans une cage de l’irradiation en forme de camembert stérile et exposer à une dose totale de 200-250 cGy rayons gamma rayonnement d’une source de rayonnement de césium-137. S’assurer que cette dose de rayonnement se situe dans la plage, comme la perte de poids significative ou même la mort peut être observée lorsque les souris NSG sont exposés à de fortes doses d’irradiation. 12
Remarque : Le rayonnement est un danger pour la santé, protection des personnes contre les rayonnements doit être prise. - Après irradiation, injecter chaque souris NSG néonatale avec 5 x 105 viable humaine CD34 + CSS en utilisant une aiguille de seringue/configuration (Figure 1). Injecter directement des cellules au niveau du foie.
5. prise de greffe Validation par le biais de rétro-orbitaire hémorragie et analyse en cytométrie en flux
- L’injection de 10-12 semaines post-HSC, anesthésier la souris à l’aide d’un appareil d’inhalation isoflurane/oxygène. Régler le débit d’oxygène afin de maintenir le pourcentage d’isoflurane à 4-5 %. L’anesthésie prend 3-5 minutes, en fonction des souris. La souris correctement anesthésiée montrent une lente et profonde respiration et aucune réaction à la stimulation d’orteil-pincement.
- Collecter 50-100 µL de sang périphérique de chaque souris par le biais d’échantillonnage rétro-orbitaire28. Stocker les échantillons de sang dans les K2EDTA ou les tubes de prélèvement de sang hépariné pour éviter la coagulation.
NOTE : Les tubes de prélèvement sanguin sont tenus d’avoir revêtement anticoagulant afin que les souris PBMC peut être isolé du sang pour analyse en cytométrie en flux. EDTA est connu pour inhiber les réactions enzymatiques comme la PCR et qRT-PCR ; ainsi, si les réactions enzymatiques en aval sont nécessaires, utiliser un appareil de collecte de sang hépariné. - Centrifuger les échantillons de sang à 2 000 x g pendant 20 minutes à 4 ° C pour granuler globules.
- Transférer les surnageants de plasma dans de nouveaux tubes de microcentrifuge après centrifugation et conserver à-80 ° C si l’analyse de cytokine est nécessaire.
- Lyse des globules rouges (hématies) dans le culot de cellules sanguines à température ambiante pendant 10 minutes à l’aide du tampon de lyse des globules rouges (Table des matières).
Remarque : Si les échantillons de plasma ne sont pas nécessaires, lyse directement le sang total avec solution de lyse sans centrifugation.
- Pellet globules restantes après la lyse de la RBC à 300 x g pendant 5 minutes à 4 ° C ; aspirer le surnageant. Laver les granules cellulaires avec 0,01 % de BSA contenant du SPD, centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes à 4 ° C et aspirer le surnageant. Répétez l’étape de lavage une fois de plus.
- Bloquer des cellules avec 100 µL de 1 x blocage cocktail (tableau 3 pour la recette) pendant 20 minutes à 4 ° C.
- Après le blocage, directement ajouter chaque solution d’anticorps dans la suspension de cellules à une concentration de 2 µL/106 cellules et incuber à 4 ° C pendant 30 minutes. Anticorps pour la validation de la prise de greffe sont : anti-humain CD45 (leucocytes, IDRM : AB_2732068), anti-humain CD3 (T-cells, IDRM : AB_396896), anti-humain CD4 (les cellules T helper, IDRM : AB_397037), anti-human CD8 (lymphocytes T cytotoxiques, IDRM : AB_2722501), anti-humain CD14 (monocytes, IDRM : AB_10373536) et anti-humain CD19 (lymphocytes B, IDRM : AB_10373382). Pour panneau de débit suggéré, veuillez consulter le tableau 4 et Table des matières pour les numéros de catalogue, les RRIDs et les numéros de lot.
NOTE : Souillure d’anticorps en bloquant la solution élimine la liaison non spécifique des anticorps anti-humaines vers des marqueurs de surface de souris, comme plusieurs marqueurs de surface partager homologie entre l’humain et de souris. - Isoler les PBMC humains provenant de donneurs sains et préparer les colorés à simple flux cytometry compensation contrôles à l’aide de PBMC humaines purifiées. alternativement, utilisez des microsphères marquées fluorescence comme compensation contrôle29.
- Analyse des échantillons de sang périphérique à l’aide d’un cytomètre de flux et de quantifier le pourcentage de cellules humaines CD45 +, CD3 + des cellules humaines, humains cellules CD14 + et CD19 + cellules humaines de cellules du sang périphérique totales.
- Pour l’infection à VIH en aval et des études de latence, calculer le pourcentage de lymphocytes T CD4 + et CD8 + T-cellules au sein des cellules CD3 +.
Remarque : En règle générale, un ratio de CD4:CD8 entre 1,5 et 2,5 est observé avant le VIH infection30.
- Pour l’infection à VIH en aval et des études de latence, calculer le pourcentage de lymphocytes T CD4 + et CD8 + T-cellules au sein des cellules CD3 +.
6. analyse de l’infection par le VIH de hu-NSG souris et de la charge virale plasmatique par qRT-PCR
- Propager le stock viral VIH BaL dans les PBMC humains provenant de donneurs sains, récolter à post-infection jour 10 et titrer à l’aide de p24 ELISA kit31.
- Humaine CD45 + souris sélectionnez hu-NSG avec plus de 20 % des cellules dans le sang périphérique d’infection à VIH.
- Anesthésier souris hu-NSG à l’aide d’un appareil d’inhalation isoflurane/oxygène (étape 5.1).
- Après avoir confirmé l’animal est anesthésié, injecter le virus VIH BaL à une dose de 200 ng de p24 par souris par voie intrapéritonéale.
NOTE : Soyez très prudent avec l’aiguille, ne pas réutiliser les aiguilles et jeter immédiatement après utilisation dans le récipient de sharp désigné. Désinfectez la zone d’injection après administration de virus. - Après l’infection trois semaines, d’offrir une souris hu-NSG et recueillir le sang périphérique par le biais de rétro-orbitaire hémorragie en utilisant hépariné tubes capillaires et les tubes de prélèvement.
- Séparé plasma et cellules sanguines par centrifugation à 2 000 x g pendant 20 minutes.
- Lyse des globules rouges Block et tacher les autres globules avec anticorps pour analyse en cytométrie en flux (Section 5.3-5.8).
Remarque : Analyse en cytométrie en flux devrait se concentrer sur la comparaison CD4:CD8 ratio avant et après l’infection. Une diminution significative de la numération des cellules CD4 + est prévue, comme le CD4 antigène sert un corécepteur pour entrée virale. - Utilisation des échantillons de plasma pour analyser le VIH viral chargement par qRT-PCR. Isoler l’ARN viral des échantillons de plasma à l’aide d’un kit de mini ARN viral. Effectuer qRT-PCR avec des amorces spécifiques LTR du VIH-1 et sonde fixe (détails de la séquence dans le tableau 5), en utilisant le protocole du fabricant.
7. orale du panier et la Validation de la Suppression virale (facultatif)
Remarque : Cette étape est facultative pour les enquêtes concernant le pronostic de VIH, virologie ou physiopathologie liée à l’infection au cours de la phase aiguë de l’infection. Panier traitement HIV-infected hu-NSG sert à récapituler la latence du VIH chez les patients humains recevant cART. Les souris infectées avec succès hu-NSG sont donnés panier pendant 4 semaines. Le régime de panier compose de fumarate de ténofovir disoproxil (TDF, 300 mg/capsule), emtricitabine (FTC ; 200 mg/capsule) et le raltégravir (RAL ; 400 mg/capsule). La dose de chariot pour le traitement de souris infectées par le VIH hu-NSG est ajustée selon corps superficie (tableau 1, l’équation 1, tableau 2)32.
- Calculer la quantité de chaque médicament requis pour chaque cage durant une semaine de traitement, prenant en considération le volume de la bouteille d’eau, le nombre de souris dans chaque cage et un apport quotidien en eau moyenne de 4 mL par souris.
Remarque : Le point essentiel dans cette étape est d’assurer que chaque souris acquiert sa dose quotidienne dans 4 mL de l’eau potable. - Broyer tous les trois médicaments par doses ajustées en poudre fine et dissoudre le mélange de poudre dans l’eau sucrée (par exemple, Medidrop Suralose). Changer la bouteille d’eau chaque semaine au cocktail fraîchement dissous panier fourni dans l’eau sucrée.
Remarque : La poudre de drogue ne peut-être pas dissoudre immédiatement, agiter vigoureusement pour obtenir une suspension homogène avant de retourner la bouteille à la cage de rétention. - Prélever des échantillons de sang périphérique via rétro-orbitaire hémorragie toutes les deux semaines et d’analyser tous les deux le ratio de CD4:CD8 à l’aide de la cytométrie en flux (Section 5.3-5.8) et la charge virale plasmatique par qRT-PCR (Section 6.6).
Remarque : Généralement après 4 semaines de traitement, la charge virale plasmatique diminue au dessous de la limite de détection et un ratio de CD4:CD8 typique est rétabli.
8. validation du rebond Viral sur chariot retrait (facultatif)
Remarque : Cette étape est essentielle à la validation du modèle de latence, comme rebond viral après le retrait de chariot fournit une preuve directe d’un réservoir de latence. Il est également recommandé pour servir comme une expérience de contrôle pour les études thérapeutiques sur le VIH rebond abat.
- Plan de retrait du panier après une charge virale plasmatique d’échantillons de sang périphérique est inférieures à la limite de détection et le ratio de CD4:CD8 est restauré sur une plage comprise entre 1.5 et 2.5.
- Prélever des échantillons de sang périphérique par le biais de rétro-orbitaire hémorragie toutes les 2 semaines après le retrait de la charrette. Surveiller étroitement la variation de la charge virale plasmatique (Section 6.6) ainsi que le ratio de CD4:CD8 (Section 5.3-5.8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse en cytométrie en flux est souvent effectué pour valider la pureté du CSH isolé, évaluer les niveaux de prise de greffe, le profil des réponses immunitaires aux infections virales et efficacité de chariot de l’enquête. Un panel d’anticorps typique contient des anticorps fluorescent étiquetés individuelles 4-6 ; ainsi, un cytomètre en flux avec plusieurs lasers et un large choix de filtres est crucial pour parvenir à des résultats précis.
Pour la validation de la prise de greffe initiale, le nombre de cellules CD45 + humain peut varier de 20 % à 80 %, et des sous-ensembles des leucocytes humains devraient apparaître comme des populations distinctes sur la dot-parcelle de débit (Figure 2). Le ratio de CD4:CD8 reste entre 1,5 et 2,5 pour un individu sain ; CD4 + l’épuisement significatif est généralement observée lors de l’infection virale, ce qui donne un ratio inférieur de CD4:CD8 ; et restauration du ratio sain est observée après traitement de chariot (Figure 3).
qRT-PCR donne une limite de détection de RNA 40 copies/mL de plasma ; des dilutions appropriées sont nécessaires avant l’expérience. Une charge virale plasmatique détectée par qRT-PCR au cours de l’infection et chariot le régime peut être tracée et utilisée pour évaluer l’efficacité de l’infection et chariot (Figure 4).
La figure 1. Seringue/aiguille d’installation utilisée pour l’injection intrahépatique.
La configuration / l’aiguille de la seringue de Hamilton 80508 sur mesure comprend une aiguille de calibre 30, 51-mm de long avec un bord biseauté et une seringue en verre attaché 50 µL. Volume d’injection maximal dans cette procédure est 25 µL. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. Cytométrie en flux de données représente une greffe réussie et l’évolution des cellules lymphoïdes et myéloïdes dans le sang périphérique.
Des échantillons de sang périphérique correctement préparés devraient avoir des séparations de population discrète et une souris bien implantée hu-NSG doit avoir des lymphocytes T, lymphocytes B et monocytes positive population présente dans le sang périphérique. Un graphique CD4:CD8 est recommandé pour le calcul du taux. un) greffe réussie a montré plus de 25 % CD45 + leucocytes humains dans le sang périphérique ; une population discrète de b) cellules B, c) monocytes, d) T-cellules chez les humains CD45 + leucocytes ; e) CD4 + les cellules T helper et f) CD8 + T-cellules cytotoxiques sont bien séparées, et g) donne un ratio entre 1,5 à 2,5 dans cette hu-NSG non infecté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. CD4 + cellules comte des changements au cours de l’infection virale, chariot et chariot à se retirer.
À mesure que progresse l’infection, le rapport de CD4:CD8 diminue de 1,5-2,5 à > 1.0, CD4:CD8 ratio a été servi comme un paramètre clinique pour évaluer le pronostic du VIH ainsi que le traitement efficacité. un) les données de flux représentant indiquant le changement dans les rapports de CD4:CD8 au cours expérimentaux ; b) comparatif des tendances indiquant l’efficacité du chariot, qui peut être identifié comme restauré pourcentage de lymphocytes t CD4 +. Détection du nombre de cellules T CD4 + par cytométrie en flux. N: nombre de souris testées = 6 ; Barres d’erreur : signifie ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001, *** p < 0,0001, ns : non significatif différent. Analyse de variance bidirectionnelle est employée. La figure est reproduite avec la permission de22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 4. Modifications de l’ARN viral sérique copier les numéros au cours de l’infection virale, chariot et chariot à retirer
Détection de la virémie plasmatique chez les souris infectées par le VIH hu-NSG par qRT-PCR. La zone ombrée indique la période pendant laquelle les souris a reçu le chariot (à partir de 28 jour à jour 70 tel qu’illustré). La limite de détection (indiquée par la ligne pointillée) de la PCR est (~ 110-160 RNA copies/mL) dans 50 à 80 µL de plasma obtenu par l’intermédiaire de la veine caudale. Étoile (*) indique l’ARN viral non détecté chez les animaux de chariot traité à 56 jours. Nombre de copies du RNA viral sérique a analysé des échantillons de sang périphérique sert comme preuve directe concernant le degré d’infection virale. Il devrait être dans l’accord avec l’analyse de flux de CD4. N: nombre de souris testées = 6 ; Barres d’erreur : signifie ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001, ns : non significatif différent. Analyse de variance bidirectionnelle est employée. La figure est reproduite avec la permission de22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Équation 1. Dose de traduction basée sur la surface corporelle (BSA).
Équation pour la traduction humaine dose de dosage contre les petits animaux de laboratoire. Le facteurm K se trouvent dans le tableau 2.
| Médicament | Dose quotidienne (mg) |
| Fumarate de ténofovir disoproxil | 300 |
| Emtricitabine | 200 |
| Raltégravir | 800 |
Table 1. Dose quotidienne de médicaments individuels dans le schéma de chariot
| Espèces | Poids (kg) | BSA (m2) | Facteur Km |
| Humaine | |||
| Adulte | 60 | 1.6 | 37 |
| Enfant | 20 | 0,8 | 25 |
| Souris | 0,02 | 0,0007 | 3 |
Le tableau 2. Poids, BSA et Km tableau de facteur de conversion de dose
| Réactif | Volume (µl) * | Concentration finale |
| 0,01 % de BSA dans du PBS | 98 | |
| 10 mg/ml IgG humain | 1 | 100 μg/ml |
| 10 mg/ml IgG de souris | 1 | 100 μg/ml |
| 100 | ||
| * Recette est pour un échantillon de cellules bloqué dans 100 µL de blocage cocktail. Ajuster le volume en conséquence avec un nombre d’échantillon. | ||
Tableau 3. Blocage de cocktail pour les cellules isolées de sang
| Anticorps | Fluorophore | Ex. Max | Em. Max |
| CD45 | BB515 | 490 nm | 515 nm |
| CD3 | PE-Cy7 | 496 nm | 785 nm |
| CD4 | Bleu Pacifique | 401 nm | 452 nm |
| CD8 | BUV395 | 348 nm | 395 nm |
| CD14 | APC-Alexa 750 | 650 nm | 774 nm |
| CD19 | PE | 496 nm | 578 nm |
Tableau 4. Suggéré de panneau de multi-couleur flow
| Primer avant | 5'-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTG-3 ' | |||
| Inverser l’apprêt | 5'-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3 ' | |||
| Sonde * | 5'-AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTAGTGTTGACT-3 ' | |||
| * 5'-FAM, trou 3'-noir Quenche 1 | ||||
Tableau 5. Amorces LTR du VIH-1 et la sonde
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Des souris immunodéprimées greffés avec cellules/tissus humains présentent des caractéristiques physiologiques humanoïde et sont une valeur énorme pour les études de pathologie et physiopathologie, immunologie concernant les maladies spécifiques à l’homme. Parmi les nombreuses souches de souris immunodéficientes, le clin de œil. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji modèle (NSG) est la plus immunodéprimés en raison de son manque d’immunité innée et adaptative, ainsi que roussis cytokines de souris spécifiques signalisation3,12,19 . Par conséquent, souris NSG ont été largement utilisés dans le processus d’humanisation, et il est bien établi que repeuplement de cellules humaines dans le sang périphérique murin, lymphoïde et myéloïdes tissus et que les souris présentent ouvrir la réponse immunitaire humaine à stimulations infectieuses comme le VIH27,,33.
En raison de la restriction d’hôte du VIH, études sur l’animal précliniques de pronostic de virologie et d’infection par le VIH ont été précédemment limités aux primates non humains infectés par le virus (SIV, la version de primate non humain du VIH) de l’immunodéficience simienne3. Les progrès scientifiques dans la recherche sur les cellules souches et la génération de souris NSG ont ouvert la possibilité d’effectuer des recherche sur le VIH sur les rongeurs murins à moindre coût et plus rapidement expérimental chiffre d’affaires. Actuellement, humanisation des soins infirmiers est possible par la transplantation de tissus 1) foetales et humaine csh (modèle BLT), 2) humaine PBMC (modèle PBL) et 3) humaine csh (modèle SRC). Le modèle de BLT offre la plus grande efficacité de la prise de greffe et le développement complet de ces deux fonctions lymphoïde et myéloïde34,35, mais est techniquement difficile. Le modèle PBL est plus confortable de mettre en place mais a une petite fenêtre expérimentale à la prise de greffe résultant du greffon contre l’hôte ; en outre, il ne vous propose les réponses de lymphocytes périphériques décents et n’a pas de développement lymphoïde et myéloïde. Pour ces raisons, nous avons utilisé le modèle SRC dans ce protocole, avec les adaptations nécessaires pour répondre aux exigences des enquêtes de VIH. Le modèle hu-NSG est complètement dépourvu de la fonction immunitaire et efficace à la moelle osseuse d’autoguidage à rayonnement et à la transplantation ; plus, il permet défi viral et des enquêtes ultérieures à un âge plus jeune, en évitant le développement de problèmes pathologiques liées à l’âge connu à l’arrière-plan de la souche de clin de œil. Bien que les cellules T dans le modèle de hu-NSG sont éduqués dans un environnement thymique de la souris et ne sont restreints H2, multiples, si pas tous, sous-ensembles de cellules immunitaires humaines peuvent se développer dans et coloniser les organes lymphoïdes et myéloïdes de souris. Visiblement, le tissu lymphoïde associé intestin du modèle hu-NSG est également reconstitué avec des cellules immunitaires humaines ; ainsi, ce modèle pourrait soutenir potentiellement muqueuse la transmission du VIH, semblable au modèle BLT22,23.
Un des obstacles majeurs à l’éradication du VIH est l’existence d’un réservoir de latence chez les patients traités avec chariot suppressive33,36,37,38,39. Les cellules infectées de façon latente restent quiescentes et contribuent à rebond viral VIH après le retrait de la charrette. Réservoirs de latence sont anatomiquement situés dans le foie, rate, cerveau et d’autres tissus lymphoïdes et sont principalement composées de memory CD4 + T-cellules36,40,41. Tel que rapporté par notre groupe, le modèle hu-NSG soutient pleinement le développement de la lignée de cellules T, ce qui convient pour la modélisation pathologique de la latence du VIH. Nous avons montré que ce modèle est très sensible à l’infection virale et par la suite au régime panier via l’administration par voie orale. Rebond viral dramatique se produit immédiatement après le retrait de chariot, qui soutient pleinement l’existence d’un réservoir de latence. Infectés de façon latente memory CD4 + T-cellules peut être isolé dans les organes lymphoïdes hu-NSG infectés par le VIH au cours de la charrette, et tests viraux excroissance récapitulent rebond viral ex vivo41. Le modèle hu-NSG et le schéma d’infection/chariot VIH décrites dans le présent protocole ont donc des applications larges dans les domaines liés au VIH virologie, pronostic de l’infection, physiopathologie de la latence et développement thérapeutiques antirétrovirales.
Le modèle de souris de hu-NSG dans ce protocole nécessite irradiation et injection intrahépatique de GPX à jour naissance après 2-3 ; par conséquent, élevage interne et conditions de logement spécifiques sont nécessaires. Bien que la greffe de csh néonatale donne généralement l’efficacité élevée de greffe, dans certains cas GVH sévère peut se produire. Dans certains cas, une diminution significative de la numération des cellules périphérique CD45 + peut être observée lors de l’infection, et dans des conditions extrêmes, sang périphérique CD45 + épuisement peut être observé ; analyse de sang collecte et l’écoulement cytometry peut donc s’avérer difficile. Une des principales limites de ce modèle de souris de hu-NSG se trouve dans la nature chimérique de ses lymphocytes T. Cellules T dans le modèle murin de hu-NSG sont instruits au sein de l’environnement du thymus de souris et sont restreints H2 au lieu d’être restreinte HLA ; par conséquent, une récapitulation complète des changements dynamiques des sous-ensembles de T-cellules infectées est moins probable. En outre, bien que le modèle de souris de hu-NSG expositions bonne sensibilité à l’infection par le VIH-1, la charge virale plasmatique observée peut être plusieurs fois plus faible que dans le modèle de BLT, peut-être en raison de la reconstitution incomplètes des fonctions humaines de lymphoïdes et myéloïdes.
En résumé, la souris hu-NSG décrite dans le présent protocole propose une méthodologie simple et efficace pour générer un modèle de souris humanisée pour études de virologie et de la latence du VIH, comme une alternative au modèle BLT. Malgré ses limites dans le vaste développement lymphoïde et myéloïde, le modèle hu-NSG a été prouvé, susceptibles d’être infectées et réceptif au panier traitement ou autres produits thérapeutiques22,23,24. Le modèle de pathologie de latence établi selon ce protocole résume le VIH rebond viral in vivo et latentes infecté memory que CD4 + T-cellules peuvent être isolées pour complément d’enquête.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne divulguer aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health [subvention numéros R01AI29329, R01AI42552 et R01HL07470 à J.J.R.] et le National Cancer Institute de la National Institutes of Health [numéro de licence P30CA033572 pour soutenir la ville de Hope génomique intégrative Pharmacologie analytique et des noyaux de cytométrie analytique]. Le réactif suivant a été obtenu par le biais de la NIH recherche sur le sida et le programme des réactifs de référence, Division of AIDS, NIAID, NIH : virus HIV BaL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
| CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
| IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
| Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
| Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
| Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
| Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
| Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
| Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
| QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
| TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
| HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
| IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
| APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
| PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |
References
- Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
- Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
- McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
- McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
- Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
- King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
- Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
- Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
- Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
- Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
- Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
- Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O'Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
- Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
- Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
- Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
- van't Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
- Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
- Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
- Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
- Chun, T. -W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
- Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
- Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).
