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Immunology and Infection

मानवीय मंजूरी/SCID/IL2rγअशक्त (हू-एनएसजी) एचआईवी प्रतिकृति और विलंबता अध्ययन के लिए माउस मॉडल

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58255
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

इस प्रोटोकॉल विकिरण वातानुकूलित नवजात एनएसजी चूहों में मानव टेम स्टेम कोशिकाओं के intrahepatic इंजेक्शन के माध्यम से मानव चूहों (हू-एनएसजी) स्थापित करने के लिए एक विधि प्रदान करता है । हू-एनएसजी माउस एचआईवी संक्रमण और मिश्रित एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (गाड़ी) के लिए अतिसंवेदनशील है और एचआईवी प्रतिकृति और विलंबता जांच के लिए एक उपयुक्त pathophysiological मॉडल के रूप में कार्य करता है ।

Abstract

मानव विकृति, इम्यूनोलॉजी, और चिकित्सीय विकास में अनुसंधान के लिए नैतिक विनियमों और तकनीकी चुनौतियां उच्च मांग में छोटे पशु मॉडल रखा है । मनुष्य के लिए एक करीबी आनुवंशिक और व्यवहार समानता के साथ, माउस के रूप में छोटे जानवरों मानव रोग मॉडल, जिसके माध्यम से मानव के लक्षण और प्रतिक्रियाओं की तरह recapitulated जा सकता है के लिए अच्छे उम्मीदवार हैं । इसके अलावा, माउस आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए विभिंन मांगों को समायोजित बदला जा सकता है । मंजूरी/SCID/IL2rγअशक्त (एनएसजी) माउस सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रतिरक्षा माउस उपभेदों में से एक है; यह मानव टेम स्टेम कोशिकाओं और/या मानव ऊतकों और एक कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के बाद के विकास के साथ engraftment की अनुमति देता है । इस तरह के एचआईवी के रूप में मानव-विशिष्ट रोगों का पूर्वानुमान और pathophysiology को समझने में एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर है और एक इलाज के लिए खोज सहायता । साथ ही, हम एक विकिरण वातानुकूलित नवजात एनएसजी माउस में टेम स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन द्वारा एक मानव निर्मित एनएसजी माउस मॉडल (हू-एनएसजी) पैदा करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट । हू-एनएसजी माउस मॉडल प्रत्यारोपण मानव स्टेम सेल और एचआईवी-1 वायरल संक्रमण के लिए संवेदनशीलता का बहु वंश विकास से पता चलता है । यह भी मिश्रित एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (गाड़ी) के जवाब में प्रमुख जैविक विशेषताओं recapitulates ।

Introduction

क्योंकि मानव रोगों के लिए उपयुक्त पशु मॉडल की स्थापना एक इलाज खोजने के लिए महत्वपूर्ण है, उपयुक्त जानवरों के मॉडल लंबे समय से पीछा किया गया है और सुधार हुआ है । प्रतिरक्षा murine मॉडल के कई उपभेदों विकसित किया गया है कि मानव कोशिकाओं और/या ऊतकों और मानव कार्य1,2के बाद के निष्पादन के engraftment की अनुमति है । मानव विशेष रोगों की जांच के लिए इस तरह के मानवतावादी माउस मॉडल महत्वपूर्ण है3,4,5।

मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) के साथ संक्रमण से उत्पन्न प्रतिरक्षा कमी सिंड्रोम (एड्स) का अधिग्रहण एक उदाहरण है । मानवतावादी माउस मॉडल की स्थापना करने से पहले, गैर-मानव रहनुमाओं को एचआईवी/एड्स पूर्व नैदानिक पशु अध्ययनों की नैतिक और तकनीकी सीमाएं3। हालांकि, इस तरह के पशुओं के लिए विशेष देखभाल के लिए उच्च व्यय और आवश्यकताओं एचआईवी में बाधा/ एचआईवी मुख्यतः मानव CD4 + टी कोशिकाओं को संक्रमित और अंय मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विकास और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के प्रभाव जैसे बी-कोशिकाओं, मैक्रोफेज, और वृक्ष कोशिकाओं6; इसलिए, छोटे पशु कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ प्रत्यारोपण मॉडल उच्च मांग में हैं ।

एक सफलता १९८८ में आया था, जब एक Prkdcscid उत्परिवर्तन के साथ CB17-scid चूहों विकसित और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली1के सफल engraftment दिखाया गया । Prkdcscid दोषपूर्ण टी में उत्परिवर्तन परिणाम और बी सेल कार्य और चूहों में एक ablated अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली, जिससे मानव परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs), टेम स्टेम कोशिकाओं (HSCs) के engraftment को सक्षम करने, और भ्रूण टेम ऊतकों7,8. फिर भी, engraftment के निम्न स्तर अक्सर इस मॉडल में मनाया जाता है; संभावित कारण हैं 1) अवशिष्ट जन्मजात प्रतिरक्षा गतिविधि प्राकृतिक हत्यारा (NK) के माध्यम संग्राहक-कोशिकाओं और 2) देर से चरण विकास माउस के टी-और बी-कोशिकाओं (leakiness)5. गैर मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (मंजूरी) के बाद के विकास-scid माउस मॉडल नाटकीय नीचे हासिल NK-सेल गतिविधि के विनियमन; इस प्रकार, यह एक उच्च स्तर और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के घटक9के अधिक टिकाऊ engraftment का समर्थन करने में सक्षम है । आगे को दबाने या सहज प्रतिरक्षा के विकास में बाधा, माउस मॉडल (मंजूरी) में interleukin-2 रिसेप्टर γ-चेन (Il2rg) का असर जनचेतना या कुल नॉकआउट-scid पृष्ठभूमि की स्थापना की गई । Il2rg, भी आम cytokine रिसेप्टर γ-श्रृंखला के रूप में जाना जाता है, विभिन्न cytokine रिसेप्टर्स की एक अनिवार्य घटक है10,11,12,13. मंजूरी जैसे संवेदनहीन । तटरक्षक-PrkdcscidIl2rgtm1Wji (एनएसजी) और NODShi.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug (नोग) वर्तमान में माउस के मजबूत व्यवधान cytokine संकेतन और पृथक-सेल विकास के पूर्ण NK, में अनुकूली उन्मुक्ति की गंभीर हानि के अलावा14,15,16.

तीन मानवतावादी माउस मॉडल एक scid उत्परिवर्तन और Il2rg नॉकआउट असर अक्सर एचआईवी/एड्स अनुसंधान में कार्यरत हैं: बीएलटी (अस्थि मज्जा/जिगर/थाइमस) मॉडल, PBL (परिधीय रक्त ल्युकोसैट) मॉडल, और SRC (scid पुनः आबाद सेल) मॉडल 3. बीएलटी मॉडल मानव भ्रूण जिगर और थाइमस भ्रूण जिगर HSCs3,17,18के नसों में इंजेक्शन के साथ साथ माउस गुर्दे कैप्सूल के तहत सर्जिकल प्रत्यारोपण के माध्यम से बनाया गया है । बीएलटी माउस मॉडल उच्च engraftment प्रभावकारिता प्रदान करता है, सभी वंश में मानव टेम कोशिकाओं के विकास, और एक मजबूत मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की स्थापना; इसके अतिरिक्त, टी कोशिकाओं को एक मानव ऑटोलॉगस थाइमस और प्रदर्शन एचएलए-प्रतिबंधित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं4,5,17,19में शिक्षित कर रहे हैं । हालांकि, शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए आवश्यकता बीएलटी मॉडल की प्रमुख खामी बनी हुई है । PBL माउस मॉडल मानव परिधीय लसीकावत् कोशिकाओं के साथ नसों में इंजेक्शन द्वारा स्थापित किया गया है । PBL मॉडल सुविधा और पैदावार सफल टी सेल engraftment प्रदान करता है, लेकिन अपने आवेदन अपर्याप्त बी सेल और माइलॉयड कोशिका engraftment, कम engraftment समग्र स्तर के कारण सीमित है, और गंभीर भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग (GVHD) 3 की शुरुआत ,20. SRC माउस मॉडल मानव HSCs के इंजेक्शन के माध्यम से नवजात या युवा वयस्क SCID चूहों में स्थापित किया गया है । यह 25% से ऊपर औसत engraftment दक्षता दर्शाती है (परिधीय रक्त CD45 प्रतिशत के रूप में मूल्यांकन) और इंजेक्शन HSCs के कई वंश विकास और एक सहज मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के विस्तार का समर्थन करता है । हालांकि, SRC मॉडल की सीमा है कि टी-सेल प्रतिक्रिया माउस H2-प्रतिबंधित के बजाय मानव एचएलए-प्रतिबंधित14,21है ।

SRC माउस मॉडल नैदानिक एचआईवी के लिए एक सतही और विश्वसनीय मॉडल माना जाता है/एड्स छोटे जानवर अध्ययन, उदाहरण एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और सफल टेम विकास के अनुरूप engraftment द्वारा । हम पहले एक एनएसजी हू-SRC-SCID (हू-एनएसजी) माउस मॉडल की स्थापना की सूचना और एचआईवी प्रतिकृति और विलंबता अध्ययन में अपने आवेदन वर्णित22,23,24। यह हू-एनएसजी माउस मॉडल अस्थि मज्जा होमिंग के उच्च स्तर को दर्शाती है, एचआईवी संक्रमण के लिए संवेदनशीलता, और एचआईवी संक्रमण और रोगजनन के recapitulation । इसके अतिरिक्त, हू-एनएसजी माउस मॉडल के लिए उचित जवाब मिश्रित एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (गाड़ी) और recapitulates प्लाज्मा गाड़ी वापसी पर वायरल खुशहाली लौटने लगी, एक एचआईवी विलंबता जलाशय की स्थापना की पुष्टि25,26 ,27. इस एचआईवी विलंबता जलाशय और प्रतिकृति सक्षम एचआईवी वायरस के उत्पादन से पुष्टि की है पूर्व मानव आराम CD4 से प्रेरित vivo + टी कोशिकाओं संक्रमित और गाड़ी से अलग-इलाज किया हू-एनएसजी चूहों ।

साथ ही, हम नवजात एनएसजी चूहों से हू-एनएसजी माउस मॉडल की स्थापना के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें विलंबता विकास के लिए एचआईवी संक्रमण और गाड़ी के उपचार से संबंधित प्रक्रियाएं शामिल हैं । हम इस प्रोटोकॉल एचआईवी वायरोलॉजी, विलंबता के बारे में एचआईवी पशु अध्ययन में दृष्टिकोण का एक नया सेट की पेशकश करने की उंमीद है, और उपचार ।

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Protocol

सभी पशु देखभाल और प्रक्रियाओं के अनुसार प्रदर्शन किया गया है प्रोटोकॉल की समीक्षा की और आशा की शहर द्वारा अनुमोदित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) इस अध्ययन के प्रमुख अंवेषक द्वारा आयोजित (डॉ जॉन रोसी, IACUC #12034) । मानव भ्रूण जिगर ऊतक उन्नत विज्ञान संसाधनों (Alameda, सीए), एक nonprofit संगठन संघीय और राज्य के नियमों के अनुसार, से प्राप्त किया गया था । विक्रेता अपने संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) है और मानव विषय संरक्षण आवश्यकताओं के अनुरूप है । मानव PBMCs आशा रक्त दाता केंद्र (Duarte, CA) के शहर से गुमनाम स्वस्थ दाताओं से हटा परिधीय रक्त नमूनों से पृथक कर रहे हैं, कोई उंर के बारे में पहचान के साथ, जाति, लिंग, या जातीयता । आईआरबी #/REF #: 97071/075546

१. सामान्य अपूतित अभ्यास

  1. निर्दिष्ट लामिना प्रवाह अलमारियां में ऊतक संस्कृति प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं ।
  2. उपयोग करने से पहले एक ०.२२-µm निस्पंदन इकाई का उपयोग कर ऊतक संस्कृति मध्यम और बाँझ शर्तों और फिल्टर के तहत की खुराक रखें ।
  3. संरक्षित तैयार मानव HSCs बाँझ ट्यूबों में और इंजेक्शन तक बर्फ पर रखने के लिए ।
  4. गंभीर प्रतिरक्षा की कमी का एक परिणाम के रूप में, संभाल एनएसजी चूहों aseptically । संदूषण को रोकने के लिए एक डिस्पोजेबल सर्जरी गाउन, हेयर कैप, फेस मास्क, शू कवर, और दस्ताने पहनें । पीठ की सतह, विकिरण धारक, और क्लोरीन डाइऑक्साइड आधारित बाँझ के साथ संज्ञाहरण के लिए प्रेरण कक्ष साफ (जैसे, Clidox) से पहले और प्रयोगों के बाद ।
  5. सूखी आंखों को रोकने के लिए रेट्रो कक्षीय रक्तस्राव के बाद पेट्रोलियम आधारित आई ऑइंटमेंट लागू करें ।
  6. रेट्रो परिक्रमा रक्तस्राव के कारण संक्रमण को रोकने के लिए एंटीबायोटिक युक्त आहार को बदलें ।

2. एचआईवी वायरस हैंडलिंग, संक्रमित कुतर, और वायरस युक्त रक्त/

चेतावनी: एचआईवी एक वर्ग 3 मानव रोगज़नक़ है; हैंडलिंग नियमों का ठीक से पालन किया जाना चाहिए ।

  1. एक नामित BSL2 +/3 प्रयोगशाला अंतरिक्ष में एचआईवी वायरस युक्त नमूनों को संभालना । सुरक्षित रूप से परिवहन के दौरान एक द्वितीयक कंटेनर में वायरस युक्त रिएजेंट ताला । 10% ब्लीच और isopropanol परिवहन से पहले के साथ पूरी तरह से पोंछते द्वारा सभी कंटेनरों की बाहरी सतह को संक्रमित ।
  2. निर्धारित अपशिष्ट कंटेनरों में सभी वायरस युक्त अपशिष्टों को 2-3 परतों वाले खतरनाक अपशिष्ट थैलों के साथ रखें. पहले अपशिष्ट निपटान के लिए, उदारता से आयोडीन के साथ अपशिष्ट छिड़काव द्वारा विसंक्रमित/ethoxylated nonylphenol समाधान (जैसे, Wescodyne) और आटोक्लेव ।
  3. पहनें व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण: हेयर कैप, चेहरा कवर, विरोधी स्पलैश चेहरा ढाल, जूता कवर, डिस्पोजेबल सर्जरी गाउन, और डबल परत दस्ताने ।
  4. अत्यधिक सावधानी से संक्रमित कुतर को संभालें । आचरण इंजेक्शन और रक्त संग्रह जबकि चूहों संज्ञाहरण के तहत कर रहे हैं (कदम 5.1-5.2, 6.3-6.5, ७.३, और 8.1-8.2).

3. टेम स्टेम कोशिकाओं का अलगाव

  1. ऊतक पाचन के लिए collagenase/dispase समाधान तैयार करें ।
    1. collagenase/dispase पाउडर भंग १०० मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर स्टॉक समाधान करने के लिए, और स्टोर collagenase/dispase स्टॉक समाधान १५० µ l aliquots में-20 डिग्री सेल्सियस पर ।
    2. वर्किंग collagenase सॉल्यूशन के लिए, पतला १५० µ l का collagenase/dispase शेयर के 15 मिलीलीटर के साथ RPMI १६४० के पूरक 10% FCS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin.
      नोट: ऊतक पाचन के लिए collagenase/dispase के अंतिम एकाग्रता है 1 मिलीग्राम/एमएल ।
  2. एक बाँझ उस्तरा ब्लेड के साथ, भ्रूण जिगर ऊतक में कटौती (16-24 सप्ताह के गर्भ) छोटे टुकड़ों में (लगभग 2-3 मिमी आकार में3 ) collagenase/dispase समाधान के साथ पाचन द्वारा पीछा (1 मिलीग्राम/एमएल) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए । ताकि सभी ऊतक टुकड़े पूरी तरह से जलमग्न हो पाचन समाधान की मात्रा को समायोजित करें । सिरिंज गोताख़ोर के पीछे के अंत का उपयोग करने के लिए धीरे पाचन की सुविधा के लिए ऊतक के नमूने पीसने ।
  3. एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए एक ७०-µm बाँझ नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से पाचन मिश्रण पारित.
  4. निर्माता के निर्देश के अनुसार एक एमएसीएस प्रणाली का उपयोग कर CD34 + HSCs के लिए समृद्ध ।
  5. एक hemacytometer28 का उपयोग कर समृद्ध CD34 + HSCs के व्यवहार्य प्रतिशत गिनती और नवजात एनएसजी चूहों में इंजेक्शन intrahepatic के लिए आगे बढ़ना ।
  6. फ्रीज में शेष समृद्ध CD34 + HSCs मीडिया (उदाहरणके लिए, CryoStor CS2) और एक तरल नाइट्रोजन टैंक में कोशिकाओं की रक्षा । भविष्य का उपयोग करने पर, इंजेक्शन से पहले गल CD34 + HSCs के व्यवहार्य प्रतिशत का ब्योरा । ठंड मीडिया के उपयोग के साथ, के बाद गल व्यवहार्यता ८० से ९०% के बीच है ।

4. नवजात एनएसजी चूहों में मानव CD34 + HSCs का Intrahepatic इंजेक्शन

नोट: नवजात एनएसजी चूहों जन्म से 2-3 दिन इस प्रक्रिया के लिए सबसे उपयुक्त हैं, के रूप में वे काफी मजबूत करने के लिए आधे में विकिरण सह घातक खुराक रहे हैं, जबकि काफी युवा पूरी तरह से बिगड़ा प्रतिरक्षा प्रणाली है । कोई संज्ञाहरण HSC इंजेक्शन के लिए आवश्यक है ।

  1. नवजात एनएसजी चूहों के पूरे कूड़े प्लेस (आमतौर पर 5-10 चूहों, दोनों लिंग) एक बाँझ पाई के आकार का विकिरण पिंजरे में और एक सीज़ियम-१३७ विकिरण स्रोत से 200-250 cGy गामा-रे विकिरण की कुल खुराक के लिए बेनकाब. यह सुनिश्चित करें कि विकिरण खुराक सीमा के भीतर है, के रूप में महत्वपूर्ण वजन घटाने या यहां तक कि मौत देखा जा सकता है जब एनएसजी चूहों विकिरण की उच्च खुराक के लिए उजागर कर रहे हैं । 12
    नोट: विकिरण एक स्वास्थ्य खतरा है, विकिरण के खिलाफ व्यक्तिगत संरक्षण लिया जाना चाहिए ।
  2. विकिरण के बाद, एक सिरिंज का उपयोग कर 5 x 105 व्यवहार्य मानव CD34 + HSCs के साथ प्रत्येक नवजात एनएसजी माउस सुई/ सीधे जिगर में कोशिकाओं सुई ।

5. रेट्रो-कक्षीय रक्तस्राव और प्रवाह Cytometry विश्लेषण के माध्यम से Engraftment सत्यापन

  1. 10-12 सप्ताह के बाद HSC इंजेक्शन, anesthetize चूहों एक isoflurane/ऑक्सीजन साँस लेना तंत्र का उपयोग कर । 4-5% पर isoflurane प्रतिशत बनाए रखने के लिए ऑक्सीजन के प्रवाह को समायोजित करें । संज्ञाहरण 3-5 मिनट लेता है, व्यक्तिगत माउस के आधार पर । ठीक से anesthetized चूहों एक धीमी और गहरी श्वास पैटर्न दिखाने के लिए, और पैर की अंगुली-चुटकी उत्तेजना के लिए कोई प्रतिक्रिया.
  2. रेट्रो कक्षीय नमूना28के माध्यम से प्रत्येक माउस से परिधीय रक्त के 50-100 µ एल लीजिए. K2EDTA या heparinized रक्त संग्रह ट्यूबों में रक्त के नमूनों की दुकान जमावट को रोकने के लिए ।
    नोट: रक्त संग्रह ट्यूबों थक्कारोधी कोटिंग है ताकि माउस PBMCs प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए पूरे रक्त से पृथक किया जा सकता करने के लिए आवश्यक हैं । EDTA ऐसी पीसीआर और qRT-पीसीआर के रूप में एंजाइमी प्रतिक्रियाओं को बाधित करने के लिए जाना जाता है; इस प्रकार, यदि बहाव एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता है, एक heparinized रक्त संग्रह उपकरण का उपयोग करें ।
  3. २,००० x g पर रक्त के नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए रक्त कोशिकाओं गोली ।
    1. स्थानांतरण के बाद नए microcentrifuge ट्यूबों के लिए प्लाज्मा supernatants को स्थानांतरित करें और ८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर अगर cytokine विश्लेषण की आवश्यकता है ।
    2. लाइसे लाल रक्त कोशिका गोली के भीतर (RBCs) कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए रेड ब्लड सेल Lysis बफर (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर ।
      नोट: यदि प्लाज्मा नमूनों की आवश्यकता नहीं है, सीधे लाइसे के साथ पूरे रक्त lysis समाधान के बिना केंद्रापसारक ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर आरबीसी lysis के बाद शेष रक्त कोशिकाओं गोली; महाप्राण supernatant । DPBS युक्त ०.०१% BSA के साथ सेल छर्रों धोने, 4 डिग्री सेल्सियस और महाप्राण supernatant में 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । एक और समय धुलाई कदम दोहराएं ।
  5. 1x अवरुद्ध कॉकटेल के १०० µ एल के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक (टेबल 3 रेसिपी के लिए) 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ।
  6. ब्लॉक करने के बाद, सीधे 2 µ एल की एकाग्रता पर सेल निलंबन में प्रत्येक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें/106 कोशिकाओं और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी । engraftment सत्यापन के लिए एंटीबॉडी हैं: एंटी ह्यूमन CD45 (ल्यूकोसाइट्स, RRID: AB_2732068), एंटी ह्यूमन CD3 (टी-सेल, RRID: AB_396896), एंटी ह्यूमन CD4 (हेल्पर टी-सेल, RRID: AB_397037), एंटी ह्यूमन सीडी 8 (साइटोटोक्सिक टी-सेल, RRID: AB_2722501), एंटी ह्यूमन CD14 (monocytes, RRID: AB_10373536), और एंटी ह्यूमन CD19 (बी-सेल, RRID: AB_10373382) । सुझाव प्रवाह पैनल के लिए, सूची संख्या, RRIDs और बहुत संख्या के लिए सामग्री की तालिका 4 और तालिका देखें ।
    नोट: एंटीबॉडी अवरुद्ध समाधान में धुंधला विरोधी माउस सतह मार्करों की ओर मानव एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बंधन समाप्त, के रूप में कई सतह मार्करों मानव और माउस के बीच समरूपता साझा करें ।
  7. स्वस्थ दाताओं से मानव PBMCs को अलग और एक दाग प्रवाह cytometry मुआवजा शुद्ध मानव PBMCs का उपयोग कर नियंत्रण तैयार करते हैं । वैकल्पिक रूप से, का उपयोग प्रतिदीप्ति-लेबल microspheres क्षतिपूर्ति के रूप में29नियंत्रित करता है ।
  8. एक प्रवाह cytometer का उपयोग परिधीय रक्त के नमूनों का विश्लेषण और कुल परिधीय रक्त कोशिकाओं से मानव CD45 + कोशिकाओं, मानव CD3 + कोशिकाओं, मानव CD14 + कोशिकाओं, और मानव CD19 + कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ाता है ।
    1. बहाव एचआईवी संक्रमण और विलंबता अध्ययन के लिए, CD3 + कोशिकाओं के भीतर CD4 + टी कोशिकाओं और सीडी 8 + टी कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना ।
      नोट: आमतौर पर, एक CD4:१.५ और २.५ के बीच सीडी 8 अनुपात एचआईवी संक्रमण30से पहले मनाया जाता है ।

6. qRT-पीसीआर का उपयोग कर हू-एनएसजी चूहों और प्लाज्मा वायरल लोड के एचआईवी संक्रमण का विश्लेषण

  1. प्रचारित एचआईवी बाल स्वस्थ दाताओं से मानव PBMCs में वायरल शेयर, 10 दिन में फसल के बाद संक्रमण, और अनुमापन p24 एलिसा किट31का उपयोग कर ।
  2. एचआईवी संक्रमण के लिए परिधीय रक्त में 20% से अधिक मानव CD45 + कोशिकाओं के साथ हू-एनएसजी चूहों का चयन करें ।
  3. एक isoflurane/ऑक्सीजन साँस लेना तंत्र (५.१ कदम) का उपयोग कर Anesthetize हू-एनएसजी चूहों ।
  4. पुष्टि पशु anesthetized है के बाद, intraperitoneal मार्ग के माध्यम से माउस प्रति p24 के २०० एनजी की एक खुराक में एचआईवी बाल वायरस इंजेक्षन ।
    नोट: सुई के साथ अत्यंत सतर्क हो, सुई का पुनः प्रयोग न करें, और निर्दिष्ट तेज कंटेनर में उपयोग के बाद तुरंत त्यागें. वायरस प्रशासन के बाद इंजेक्शन के क्षेत्र को संक्रमित.
  5. तीन सप्ताह के बाद संक्रमण, anesthetize हू-एनएसजी चूहों और heparinized केशिका ट्यूबों और संग्रह ट्यूबों का उपयोग रेट्रो कक्षीय रक्तस्राव के माध्यम से परिधीय रक्त इकट्ठा ।
  6. 20 मिनट के लिए २,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा अलग प्लाज्मा और रक्त कोशिकाओं ।
  7. लाइसे RBCs. Block और दाग शेष रक्त कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी के साथ फ्लो cytometry विश्लेषण (धारा 5.3-5.8).
    नोट: प्रवाह cytometry विश्लेषण CD4 की तुलना पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए: सीडी 8 अनुपात से पहले और संक्रमण के बाद । CD4 antigen वायरल प्रविष्टि के लिए एक सह-रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है के रूप में CD4 + सेल गणना में महत्वपूर्ण कमी, अपेक्षित है ।
  8. qRT-पीसीआर का उपयोग कर एचआईवी वायरल लोड का विश्लेषण करने के लिए प्लाज्मा नमूनों का प्रयोग करें । एक वायरल आरएनए मिनी किट का उपयोग कर प्लाज्मा नमूनों से वायरल आरएनए को अलग । , निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एचआईवी-1 के साथ-साथ qRT-विशेष प्राइमरों और जांच सेट ( तालिका 5में अनुक्रम विवरण) के साथ पीसीआर प्रदर्शन ।

7. गाड़ी और वायरल दमन के सत्यापन के मौखिक प्रशासन (वैकल्पिक)

नोट: यह चरण तीव्र संक्रमण चरण के दौरान एचआईवी रोग का निदान, वायरोलॉजी, या संक्रमण से संबंधित pathophysiology के बारे में जांच के लिए वैकल्पिक है । एचआईवी संक्रमित हू-एनएसजी की गाड़ी उपचार गाड़ी प्राप्त मानव रोगियों के बीच एचआईवी विलंबता दोहराऊंगा करने के लिए प्रयोग किया जाता है । सफलतापूर्वक एचआईवी संक्रमित हू-एनएसजी चूहों को ४ सप्ताह के लिए गाड़ी दी जाती है. कार्ट आहार tenofovir disoproxil fumarate (TDF; ३०० मिलीग्राम/कैप्सूल), emtricitabine (FTC; २०० mg/कैप्सूल), और raltegravir (्ल; ४०० mg/कैप्सूल) के होते हैं । एचआईवी संक्रमित हू-एनएसजी चूहों के इलाज के लिए गाड़ी की खुराक शरीर की सतह क्षेत्र (तालिका 1, समीकरण 1, तालिका 2)३२के अनुसार समायोजित किया गया है ।

  1. उपचार के एक सप्ताह के दौरान प्रत्येक पिंजरे के लिए आवश्यक प्रत्येक दवा की मात्रा की गणना, ध्यान में पानी की बोतल की मात्रा, प्रत्येक पिंजरे में चूहों की संख्या, और माउस प्रति 4 मिलीलीटर की एक औसत दैनिक पानी का सेवन ।
    नोट: इस चरण में महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि प्रत्येक माउस पीने के पानी की 4 मिलीलीटर के भीतर अपनी दैनिक खुराक प्राप्त सुनिश्चित करने के लिए है ।
  2. ठीक पाउडर में समायोजित खुराक के साथ सभी तीन दवाओं पीस और मीठा पानी में पाउडर मिश्रण भंग (जैसे, Medidrop Suralose). पानी की बोतल नए सिरे से भंग गाड़ी कॉकटेल मीठा पानी में आपूर्ति के साथ हर हफ्ते बदलें ।
    नोट: दवा पाउडर तुरंत भंग नहीं हो सकता है, जोरदार शेक को पकड़ पिंजरे में बोतल लौटने से पहले एक सजातीय निलंबन प्राप्त करने के लिए ।
  3. हर दो हफ्तों में रेट्रो परिक्रमा रक्तस्राव के माध्यम से परिधीय रक्त के नमूने ले लीजिए और दोनों CD4 का विश्लेषण: सीडी 8 अनुपात प्रवाह cytometry का उपयोग (खंड 5.3-5.8) और प्लाज्मा वायरल लोड qRT-पीसीआर (धारा ६.६) का उपयोग कर ।
    नोट: आमतौर पर उपचार के 4 सप्ताह के बाद, प्लाज्मा वायरल लोड कम हो जाती है पता लगाने की सीमा और एक ठेठ CD4 के नीचे: सीडी 8 अनुपात पुनर्स्थापित किया जाता है ।

8. गाड़ी वापसी पर वायरल खुशहाली का सत्यापन (वैकल्पिक)

नोट: यह कदम विलंबता मॉडल मान्य करने में महत्वपूर्ण है, के रूप में वायरल गाड़ी वापसी पर खुशहाली लौटने लगी एक विलंबता जलाशय के प्रत्यक्ष सबूत प्रदान करता है । यह भी एचआईवी रिबाउंड suppressants पर चिकित्सीय जांच के लिए एक नियंत्रण प्रयोग के रूप में सेवा करने के लिए सिफारिश की है ।

  1. प्लाज्मा के बाद गाड़ी वापसी के लिए योजना-परिधीय रक्त के नमूनों से वायरल लोड पता लगाने की सीमा और CD4 के नीचे हैं: सीडी 8 अनुपात १.५ और २.५ के बीच एक श्रेणी में पुनर्स्थापित किया जाता है ।
  2. गाड़ी वापसी के बाद हर 2 सप्ताह रेट्रो कक्षीय रक्तस्राव के माध्यम से परिधीय रक्त के नमूने ले लीजिए । बारीकी से प्लाज्मा वायरल लोड में परिवर्तन की निगरानी (धारा ६.६) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से CD4: सीडी 8 अनुपात (धारा 5.3-5.8) ।

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Representative Results

प्रवाह cytometry विश्लेषण अक्सर अलग HSCs की पवित्रता को मांय करने के लिए प्रदर्शन किया है, engraftment स्तर का मूल्यांकन, वायरल संक्रमण के लिए प्रोफ़ाइल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, और सर्वेक्षण गाड़ी प्रभावकारिता । एक ठेठ एंटीबॉडी पैनल 4-6 व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी शामिल हैं; इस प्रकार, एकाधिक पराबैंगनीकिरण और फिल्टर की एक विस्तृत चयन के साथ एक प्रवाह cytometer सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

प्रारंभिक engraftment सत्यापन के लिए, मानव CD45 + सेल गिनती 20% से ८०% करने के लिए रेंज कर सकते हैं, और मानव ल्यूकोसाइट्स के सबसेट प्रवाह डॉट पर असतत आबादी के रूप में दिखाई देना चाहिए-भूखंड (चित्रा 2) । CD4 का अनुपात: सीडी 8 एक स्वस्थ व्यक्ति के लिए १.५ और २.५ के बीच रहता है; महत्वपूर्ण CD4 + कमी आम तौर पर वायरल संक्रमण पर मनाया जाता है, CD4 का एक कम अनुपात: सीडी 8 उपज; और स्वस्थ अनुपात की बहाली गाड़ी उपचार (चित्रा 3) पर मनाया जाता है ।

qRT-पीसीआर ४० आरएनए की जांच सीमा देता है/ प्रयोग करने से पूर्व उचित कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है । प्लाज्मा वायरल लोड संक्रमण और गाड़ी आहार के पाठ्यक्रम में qRT-पीसीआर का उपयोग कर पाया साजिश रची जा सकता है और संक्रमण और गाड़ी की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया (चित्रा 4) ।

Figure 1
चित्र 1. सिरिंज/सुई सेटअप intrahepatic इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया ।
कस्टम बनाया हैमिल्टन ८०५०८ सिरिंज/सुई सेटअप एक 30 गेज, ५१ मिमी लंबी सुई एक बेवल बढ़त के साथ और एक संलग्न ५०-µ एल ग्लास सिरिंज शामिल हैं । इस प्रक्रिया में अधिकतम इंजेक्शन की मात्रा 25 µ एल है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2. प्रवाह cytometry डेटा सफल engraftment और परिधीय रक्त में लसीकावत् और माइलॉयड कोशिकाओं के विकास का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
सफलतापूर्वक तैयार परिधीय रक्त के नमूनों असतत जनसंख्या जुदाई होना चाहिए, और एक अच्छी तरह से engrafted हू-एनएसजी माउस टी सेल, बी सेल और monocyte सकारात्मक परिधीय रक्त में प्रस्तुत आबादी होनी चाहिए । एक CD4: सीडी 8 चार्ट अनुपात गणना के लिए सिफारिश की है । a) सफल engraftment ने परिधीय रक्त में 25% से अधिक CD45 + मानव ल्यूकोसाइट्स दिखाया; बी की असतत जनसंख्या ) बी-कोशिकाओं, ग) monocytes, घ) मानव CD45 के बीच टी कोशिकाओं + ल्युकोसैट; e) CD4 + हेल्पर टी-कोशिकाओं और च) सीडी 8 + साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं को अच्छी तरह से अलग कर रहे हैं, और जी) इस संक्रमित हू-एनएसजी में १.५ से २.५ के बीच एक अनुपात पैदावार । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. CD4 + सेल वायरल संक्रमण, गाड़ी और गाड़ी वापस लेने के दौरान पूरे परिवर्तन गिनती ।
के रूप में संक्रमण की प्रगति, CD4: सीडी 8 अनुपात 1.5-2.5 से > 1.0, CD4: सीडी 8 अनुपात एचआईवी रोग का निदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपचार efficacies मूल्यांकन में एक नैदानिक पैरामीटर के रूप में कार्य किया गया है घट जाती है । a) प्रतिनिधि प्रवाह CD4 में परिवर्तन का संकेत डेटा: प्रायोगिक पाठ्यक्रम के दौरान सीडी 8 अनुपात; ख) तुलना रुझान गाड़ी की प्रभावशीलता का संकेत चार्ट, जो CD4 + टी कोशिकाओं के बहाल प्रतिशत के रूप में पहचाना जा सकता है । प्रवाह cytometry द्वारा CD4 + T सेल गणना का पता लगाना । N: परीक्षण चूहों की संख्या = 6; त्रुटि पट्टियां: का अर्थ है ± SEM. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * *p < 0.001, * * * * p < 0.0001, ns: कोई महत्वपूर्ण अलग । दो तरह के ANOVA एनालिसिस कार्यरत हैं । चित्र22अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. सीरम वायरल आरएनए के परिवर्तन वायरल संक्रमण, गाड़ी और गाड़ी वापस लेने के दौरान की संख्या में प्रतिलिपि
qRT-पीसीआर द्वारा एचआईवी संक्रमित हू-एनएसजी चूहों में प्लाज्मा viremia का पता लगाना. छायांकित क्षेत्र उस समय अवधि को इंगित करता है जिसके दौरान चूहों ने कार्ट प्राप्त किया (28 दिन से लेकर ७० दिन तक दिखाया गया है) । जांच की सीमा (डैश्ड रेखा से संकेत) पीसीआर परख की है (~ 110-160 आरएनए प्रतियां/एमएल) ५० में ८० µ एल के लिए पूंछ नस के माध्यम से प्राप्त की प्लाज्मा । स्टार (*) की ओर इशारा करता है वायरल आरएनए गाड़ी में नहीं पाया इलाज पशुओं के दिन ५६ । सीरम वायरल आरएनए नकल परिधीय रक्त के नमूनों से विश्लेषण संख्या वायरल संक्रमण की डिग्री के विषय में प्रत्यक्ष सबूत के रूप में कार्य करता है. यह CD4 प्रवाह विश्लेषण के साथ समझौते में होना चाहिए । N: परीक्षण चूहों की संख्या = 6; त्रुटि पट्टियां: का अर्थ है ± SEM. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001, ns: कोई महत्वपूर्ण अलग । दो तरह के ANOVA एनालिसिस कार्यरत हैं । चित्र22अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Equation
समीकरण 1 । शरीर की सतह क्षेत्र (BSA) के आधार पर खुराक अनुवाद ।
मानव खुराक के अनुवाद के लिए समीकरण छोटे प्रयोगात्मक जानवरों के खिलाफ खुराक के लिए । Km कारक तालिका 2में पाया जा सकता है ।

दवा दैनिक खुराक (mg)
Tenofovir disoproxil fumarate ३००
Emtricitabine २००
Raltegravir ८००

तालिका 1. कार्ट आहार में व्यक्तिगत दवा की दैनिक खुराक

प्रजातियों वजन (किग्रा) BSA (एम2) Km फैक्टर
मानव
वयस्क ६० १.६ ३७
बच्चे 20 ०.८ 25
माउस ०.०२ ०.०००७ 3

तालिका 2. वजन, BSA और कश्मीर खुराक रूपांतरण के लिए एम फैक्टर चार्ट

अभिकर्मक मात्रा (μl) * अंतिम एकाग्रता
पंजाब में ०.०१% BSA ९८
10 मिलीग्राम/एमएल मानव आईजीजी 1 १०० μg/एमएल
10 मिलीग्राम/एमएल माउस आईजीजी 1 १०० μg/एमएल
१००
* नुस्खा एक सेल १०० μl अवरुद्ध कॉकटेल में अवरुद्ध नमूना के लिए है । मात्रा तदनुसार नमूना संख्या के साथ समायोजित करें ।

तालिका 3. पृथक रक्त कोशिकाओं के लिए कॉकटेल अवरुद्ध

एंटीबॉडी Fluorophore उदा. मैक्स उन्हें. अधिकतम
CD45 BB515 ४९० एनएम ५१५ एनएम
CD3 पे-Cy7 ४९६ एनएम ७८५ एनएम
CD4 प्रशांत नीला ४०१ एनएम ४५२ एनएम
सीडी 8 BUV395 ३४८ एनएम ३९५ एनएम
CD14 APC-Alexa ७५० ६५० एनएम ७७४ एनएम
CD19 पीई ४९६ एनएम ५७८ एनएम

तालिका 4. सुझाया बहु रंग फ्लो पैनल

फॉरवर्ड प्राइमर 5 '-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTG-3 '
रिवर्स प्राइमर 5 '-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3 '
जांच 5 '-AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTAGTGTTGACT-3 '
* 5 '-FAM, 3 '-ब्लैक होल शमन 1

तालिका 5. एचआईवी-1 लीटर प्राइमर और जांच

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Discussion

प्रतिरक्षा चूहों मानव कोशिकाओं के साथ engrafted/मानव की तरह शारीरिक विशेषताओं और विकृति के लिए एक जबरदस्त मूल्य रहे हैं, pathophysiology, और इम्यूनोलॉजी मानव विशेष रोगों के विषय में अध्ययन. प्रतिरक्षा चूहों के कई उपभेदों के बीच, मंजूरी । तटरक्षक-PrkdcscidIl2rgtm1Wji (एनएसजी) मॉडल की कमी के कारण सबसे immunodeficient है जन्मजात और अनुकूल उन्मुक्त दोनों, साथ ही ablated माउस-विशिष्ट cytokine संकेतन3,12,19 . इसलिए, एनएसजी चूहों बड़े पैमाने पर humanization प्रक्रिया में उपयोग किया गया है, और यह अच्छी तरह से स्थापित है कि मानव कोशिकाओं murine परिधीय रक्त, लसीकावत् और माइलॉयड ऊतकों में फिर से आबाद है, और है कि चूहों के लिए उपयुक्त मानव प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन ऐसे एचआईवी27,३३के रूप में संक्रामक उत्तेजना ।

एचआईवी वायरोलॉजी और संक्रमण पूर्वानुमान के पूर्व नैदानिक पशु अध्ययन के मेजबान प्रतिबंध के कारण पहले गैर मानव simian इम्यूनो वायरस (SIV, एचआईवी के गैर मानव रहनुमा संस्करण)3से संक्रमित रहनुमाओं तक सीमित थे । स्टेम सेल अनुसंधान और एनएसजी चूहों की पीढ़ी में वैज्ञानिक प्रगति ने कम लागत और तेजी से प्रायोगिक कारोबार के साथ छोटे murine पशुओं पर एचआईवी अनुसंधान आयोजित करने की संभावना को खोल दिया है । वर्तमान में, एनएसजी humanization 1 के प्रत्यारोपण के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है) भ्रूण के ऊतकों और मानव HSCs (बीएलटी मॉडल), 2) मानव PBMCs (PBL मॉडल), और 3) मानव HSCs (SRC मॉडल) । बीएलटी मॉडल उच्चतम engraftment दक्षता के रूप में अच्छी तरह से दोनों लसीकावत् और माइलॉयड कार्यों३४,३५के व्यापक विकास प्रदान करता है, लेकिन तकनीकी रूप से मांग कर रहा है । PBL मॉडल स्थापित करने के लिए सबसे सुविधाजनक है, लेकिन GVHD से उत्पन्न engraftment पर एक छोटी प्रयोगात्मक खिड़की है; इसके अतिरिक्त यह केवल सभ्य परिधीय टी सेल प्रतिक्रियाओं प्रदान करता है और लसीकावत् और माइलॉयड विकास का अभाव है । इन कारणों के लिए, हम इस प्रोटोकॉल में SRC मॉडल कार्यरत, रूपांतरों के साथ एचआईवी जांच के लिए आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए । हू-एनएसजी मॉडल प्रतिरक्षा समारोह और विकिरण और प्रत्यारोपण पर अस्थि मज्जा होमिंग में कुशल से पूरी तरह से रहित है; इसके अलावा, यह एक छोटी उंर में वायरल चुनौती और बाद में जांच की अनुमति देता है, उंर से संबंधित रोग की मंजूरी तनाव पृष्ठभूमि के लिए जाना जाता समस्याओं के विकास से परहेज । यद्यपि हू-एनएसजी मॉडल में टी-कोशिकाओं को एक माउस thymic वातावरण में शिक्षित कर रहे है और केवल H2-प्रतिबंधित कर रहे हैं, एकाधिक, नहीं तो सभी, मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सबसेट में विकसित कर सकते है और उपनिवेश माउस लसीकावत् और माइलॉयड अंगों । लसीकावत्, हू-एनएसजी मॉडल के आंत से जुड़े ऊतक भी मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ पुनर्गठन किया जाता है; इस प्रकार, इस मॉडल संभवतः एचआईवी श्लैष्मिक संचरण, बीएलटी मॉडल22,23के समान समर्थन कर सकता है ।

एचआईवी उंमूलन के लिए प्रमुख बाधाओं में से एक दमन गाड़ी३३,३६,३७,३८,३९के साथ इलाज रोगियों के बीच एक विलंबता जलाशय के अस्तित्व है । अव्यक्त रूप से संक्रमित कोशिकाओं quiescent रहते हैं, और गाड़ी वापसी पर एचआईवी वायरल खुशहाली लाने में योगदान । विलंबता जलाशयों जिगर में स्थित anatomically हैं, तिल्ली, मस्तिष्क, और अन्य लसीकावत् ऊतकों, और मुख्य रूप से स्मृति CD4 से बना रहे हैं + टी कोशिकाओं३६,४०,४१. के रूप में हमारे समूह द्वारा रिपोर्ट, हू-एनएसजी मॉडल पूरी तरह से टी सेल वंश के विकास का समर्थन करता है, यह एचआईवी विलंबता के रोग मॉडलिंग के लिए उपयुक्त बना । हम इस मॉडल से पता चला है अत्यधिक वायरल संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील और बाद में मौखिक प्रशासन के माध्यम से गाड़ी आहार के लिए । नाटकीय वायरल खुशहाली गाड़ी वापसी है, जो पूरी तरह से एक विलंबता जलाशय के अस्तित्व का समर्थन करता है पर तुरंत होता है । अव्यक्त रूप से संक्रमित स्मृति CD4 + टी कोशिकाओं गाड़ी के दौरान एचआईवी संक्रमित हू-एनएसजी के लसीकावत् अंगों से अलग किया जा सकता है, और वायरल वृद्धि परख दोहराऊंगा वायरल रिबाउंड पूर्व vivo४१। हू-एनएसजी मॉडल और एचआईवी संक्रमण/कार्ट आहार इस प्रकार इस प्रोटोकॉल में वर्णित एचआईवी वायरोलॉजी, संक्रमण रोग का निदान, विलंबता pathophysiology, और एंटीरेट्रोवाइरल चिकित्सकीय विकास से संबंधित क्षेत्रों में व्यापक अनुप्रयोगों है ।

इस प्रोटोकॉल में हू-एनएसजी माउस मॉडल को जन्म के बाद दिन 2-3 में HSCs के विकिरण और intrahepatic इंजेक्शन की आवश्यकता होती है; इसलिए, घर में प्रजनन और विशिष्ट आवास की स्थिति की आवश्यकता है । हालांकि नवजात HSC ट्रांसप्लांटेशन आम तौर पर उच्च engraftment क्षमता पैदावार, कुछ मामलों में गंभीर GVHD हो सकता है । कुछ मामलों में, परिधीय CD45 में एक महत्वपूर्ण कमी + कोशिका गिनती संक्रमण पर देखा जा सकता है, और चरम स्थितियों में, परिधीय रक्त CD45 + घट मनाया जा सकता है; इसलिए रक्त संग्रह और फ्लो cytometry एनालिसिस चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इस हू-एनएसजी माउस मॉडल की प्रमुख सीमाओं में से एक अपनी टी कोशिकाओं के chimeric प्रकृति के भीतर निहित है । हू-एनएसजी माउस मॉडल में टी-कोशिकाओं को माउस thymic वातावरण के भीतर शिक्षित किया जाता है और एचएलए-प्रतिबंधित होने के बजाय H2-प्रतिबंधित कर रहे हैं; इसलिए, संक्रमण होने पर T-cell सबसेट के डायनेमिक परिवर्तन की पूर्ण recapitulation की संभावना कम है । इसके अलावा, हालांकि हू-एनएसजी माउस मॉडल एचआईवी के लिए अच्छा संवेदनशीलता प्रदर्शित-1 संक्रमण, मनाया प्लाज्मा वायरल लोड बीएलटी मॉडल की तुलना में कई गुना कम हो सकता है, संभवतः मानव लसीकावत् और माइलॉयड कार्यों के व्यापक पुनर्गठन के कारण ।

सारांश में, हू-एनएसजी माउस इस प्रोटोकॉल में चित्रित एचआईवी वायरोलॉजी और विलंबता अध्ययन के लिए एक मानवीय माउस मॉडल, बीएलटी मॉडल के लिए एक विकल्प के रूप में पैदा करने के लिए एक आसान और कुशल पद्धति प्रदान करता है । व्यापक लसीकावत् और माइलॉयड विकास में अपनी सीमाओं के बावजूद, हू-एनएसजी मॉडल संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील सिद्ध किया गया है और गाड़ी के उपचार या अन्य चिकित्सीय चिकित्सा के लिए उत्तरदायी22,23,24. इस प्रोटोकॉल के अनुसार स्थापित लेटेंसी पैथोलॉजी मॉडल vivo में एचआईवी वायरल रिबाउंड recapitulates और अव्यक्त रूप से संक्रमित मेमोरी CD4 + टी कोशिकाओं को अतिरिक्त जांच के लिए आगे अलग किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई संघर्ष का खुलासा ।

Acknowledgments

इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था [अनुदान संख्या R01AI29329, R01AI42552 और R01HL07470 के लिए J.J.R.] और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर इंस्टीट्यूट [अनुदान संख्या P30CA033572 को आशा एकीकृत जीनोमिक्स के शहर का समर्थन , विश्लेषणात्मक औषध, और विश्लेषणात्मक Cytometry कोर] । निंनलिखित एजेंट NIH एड्स अनुसंधान और संदर्भ एजेंट कार्यक्रम, एड्स, NIAID, NIH: एचआईवी बाल वायरस के विभाजन के माध्यम से प्राप्त किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४३ नवजात एनएसजी माउस मानवतावादी चूहों HSCs एचआईवी गाड़ी विलंबता
मानवीय मंजूरी/SCID/IL2rγ<sup>अशक्त</sup> (हू-एनएसजी) एचआईवी प्रतिकृति और विलंबता अध्ययन के लिए माउस मॉडल
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Xia, X., Li, H., Satheesan, S.,… More

Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).

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