Summary
Denne protokollen gir en metode for å etablere humanized mus (hu-NSG) via intrahepatic injeksjon for menneskelige blodkreft stamceller i stråling-conditioned neonatal NSG mus. Hu-NSG musen er utsatt for HIV-smitte og kombinasjon antiretroviral terapi (handlevogn) og fungerer som en egnet patofysiologiske modell for HIV replikering og ventetid undersøkelser.
Abstract
Etiske regler og tekniske utfordringer for forskning i menneskelig patologi, immunologi og terapeutiske utvikling har plassert små dyr modeller i høy etterspørsel. Med en nær genetiske og atferdsmessige likhet med mennesker er små dyr som musen gode kandidater for menneskelig sykdom modeller som menneske-lignende symptomer og svar kan bli recapitulated. Videre kan musen genetisk bakgrunnen endres for å imøtekomme ulike krav. Hilsen/SCID/IL2rγnull . (NSG) musen er en av de mest brukte immunsupprimerte musen stammene; Det kan engraftment med menneskelige blodkreft stamceller og/eller menneskelig vev og senere utvikling av en funksjonell menneskets immunsystem. Dette er en viktig milepæl i forstå prognosen og patofysiologi av menneske-spesifikke sykdommer som HIV/AIDS og hjelpe søk etter en kur. Her, rapportere vi en detaljert protokoll for å generere en humanized NSG musemodell (hu-NSG) ved blodkreft stamcelletransplantasjon i stråling-conditioned neonatal NSG mus. Hu-NSG musemodell viser flere avstamning utvikling av transplantert menneskelige stamceller og mottakelighet for HIV-1 virusinfeksjon. Det viser også viktige biologiske egenskaper svar kombinasjon antiretroviral terapi (handlevogn).
Introduction
Etablere passende dyr modeller for menneskelig sykdommer er nøkkelen til å finne en kur, har lenge riktig dyr modeller blitt forfulgt og bedre over tid. Flere stammer av immunsupprimerte murine modeller har blitt utviklet som tillater engraftment av menneskelige celler og/eller vev og den påfølgende henrettelsen humanized funksjoner1,2. Slike humanized musen modeller er avgjørende for undersøkelser av menneske-spesifikke sykdommer3,4,5.
Ervervet uimottakelig mangel syndrom (AIDS) som følge av infeksjon med humant immunsviktvirus (HIV) er ett eksempel. Før etableringen av humanized musen modeller begrenset etiske og teknisk begrensninger HIV/AIDS prekliniske dyrestudier til ikke-menneskelige primater3. Men hindre den høye utgifter og krav for spesialisert omsorg for slike dyr HIV/AIDS studier i vanlige akademiske innstillinger. HIV primært infiserer menneskelige CD4 + T-celler og virkninger utvikling og immunreaksjoner av andre menneskelige immunceller som B-celler, makrofager og dendrittiske celler6; små dyr modeller transplantert med funksjonell menneskelige immunforsvar er derfor i høy etterspørsel.
Et gjennombrudd kom i 1988, da CB17 -scid mus med en Prkdcscid mutasjon var utviklet og viste vellykkede engraftment av menneskets immunsystem1. Prkdcscid mutasjon resultatene i defekt T - og B-celle funksjoner og en ablated adaptive immunsystemet i mus, og dermed gjør engraftment for menneskelig perifere blod mononukleære celler (PBMCs), blodkreft stamceller (HSCs), og fosterets blodkreft vev7,8. Likevel, lave nivåer av engraftment er ofte observert i denne modellen; mulige årsaker er 1) gjenværende medfødte immunforsvaret aktivitet modulert via naturlig killer (NK)-celler og 2) sent utviklingen av musen T - og B-celler (leakiness)5. Senere utvikling av den ikke-obese diabetiker (NIKKER)-scid musemodell oppnådd dramatiske ned-regulering av NK celler aktivitet. Dermed er det støtte et høyere nivå og mer bærekraftig engraftment menneskets immunsystem komponenter9. Å undertrykke eller hindre utvikling av medfødt immunitet, musen modeller med trunkering eller total knockout av interleukin-2 reseptor γ-kjeden (Il2rg) (NIKK) -scid bakgrunn ble etablert. Il2rg, også kjent som vanlig cytokin-reseptor γ-kjeden, er en uunnværlig del av ulike cytokin reseptorer10,11,12,13. Belastninger NIKK. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) og NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presentere robust avbrudd musen cytokin signalnettverk og komplett ablasjon av NK celler utvikling, i tillegg til alvorlig svekkelse av adaptiv immunitet14,15,16.
Tre humanized musen modeller bærer en scid mutasjon og Il2rg knockout er ofte ansatt i HIV/AIDS-forskning: BLT (benmarg/lever/Thymus) modell, PBL (perifert blod leukocytter) modellen og SRC (SCID Repopulating celle) modellen 3. the BLT modell er skapt via kirurgiske transplantasjon av menneskelig fosterets leveren og thymus under mus nyre kapselen sammen med intravenøs injeksjon fosterets lever HSCs3,17,18. BLT musemodell tilbyr høy engraftment effekt, utvikling av menneskelige blodkreft cellene i alle linjene, og etablering av en sterk menneskets immunsystem; i tillegg T-celler er utdannet en menneskelig autologous thymus og utstillingen HLA-begrenset immunreaksjoner4,5,17,19. Kravet om kirurgiske prosedyrer er imidlertid den store ulempen av BLT modellen. PBL musemodell er etablert av intravenøs injeksjon med perifere lymfoide menneskeceller. PBL modellen tilbyr bekvemmeligheten og gir vellykket T-celle engraftment, men programmet er begrenset på grunn av utilstrekkelig B-celle og myelogen celle engraftment, lav engraftment nivåer generelle og utbruddet av alvorlig graft - versus - host sykdom (GVHD)3 ,20. SRC musemodell opprettes via injeksjon av menneskelig HSCs i nyfødte eller unge voksne SCID mus. Den viser gjennomsnittlig engraftment effektivitet over 25% (innebærer perifert blod CD45 prosent) og støtter flere-lineage utviklingen av injisert HSCs og utdypning av en medfødte immunsystemet. Begrensning av SRC-modellen er imidlertid at den T-celle responsen er musen H2-begrenset i stedet for menneskelig HLA-begrenset14,21.
SRC musemodell anses lettvinte og pålitelig modell for prekliniske HIV/AIDS liten dyrestudier, eksemplifisert ved den konsekvent engraftment av menneskets immunsystem og vellykket blodkreft utvikling. Vi har tidligere rapportert etableringen av en NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) musemodell og beskrevet anvendelsen i HIV replikering og ventetid studier22,23,24. Denne hu-NSG musemodell har høye nivåer av benmarg homing, mottakelighet for HIV-smitte og recapitulation av HIV-smitte og patogenesen. I tillegg hu-NSG musemodell svarer riktig kombinasjon antiretroviral terapi (handlevogn) og viser plasma viral etterpå på handlevognen tilbaketrekking, bekrefter etableringen av en HIV ventetid reservoaret25,26 ,27. Dette HIV ventetid reservoar understrekes ytterligere av produksjonen av replikering kompetente HIV virus ex vivo indusert av menneskelig hviler CD4 + T-celler isolert fra infiserte og handlevogn-behandlet hu-NSG mus.
Her beskriver vi detaljerte protokollen for etablering av hu-NSG musemodell fra neonatal NSG mus, inkludert prosedyrer knyttet til HIV-infeksjon og kjerre behandling for ventetid utvikling. Vi forventer denne protokollen å tilby et nytt sett med tilnærminger i HIV dyrestudier om HIV virologi, ventetid og behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr omsorg og prosedyrer er utført i henhold til protokoller vurdert og godkjent av byen av håp institusjonelle dyr omsorg og bruk Committee (IACUC) av rektor investigator av denne studien (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Menneskelige fosterets leveren vev er Hentet fra avansert Bioscience ressurser (Alameda, CA), en ideell organisasjon, i henhold til føderale og statlige regler. Leverandøren har egne institusjonelle Review Board (IRB) og er kompatibel med subjektet beskyttelseskravene. Menneskelig PBMCs er isolert fra forkastet perifert blod prøver fra anonyme sunn givere fra City of Hope blod Donor Center (Duarte, CA), med ingen identifikasjon om alder, rase, kjønn eller etnisitet. IRB #/ REF #: 97071/075546
1. generelle aseptiske praksis
- Utføre vev kultur eksperimenter i utpekte laminær strømning skap.
- Holde vev kultur medium og kosttilskudd under sterile forhold og filtrere ved hjelp av en 0.22-µm filtrering enhet før du bruker.
- Bevare forberedt menneskelige HSCs i sterilt rør og holde på is til injeksjon.
- Som et resultat av alvorlig immunsvikt, håndtere NSG mus tas aseptisk. Bruk en engangs kirurgi kjole, hår cap, ansiktsmaske, skoovertrekk og hansker for å hindre forurensning. Rense den benken overflaten, bestråling holderen og induksjon kammer for anestesi med klor dioxide basert sterilisering (f.eksClidox) før og etter eksperimenter.
- Bruke oljebaserte øye ointment etter retro-orbital blødning å hindre tørre øyne.
- Endre til antibiotika inneholder kosthold for å hindre smitte på grunn av retro-orbital blødning.
2. håndtering HIV-viruset, infisert gnagere og Virus inneholder blod/vevsprøver
FORSIKTIG: HIV er en klasse 3 human patogen; handling-reglene som må følges nøyaktig.
- Håndtere HIV virus inneholder eksempler i en angitt BSL2 / 3 laboratoriet plass. Låse viruset inneholder reagenser trygt i en sekundær beholder under transport. Desinfiser den ytre overflaten av alle beholdere av grundig tørke med 10% blekemiddel og isopropanol før transport.
- Holde alle virus inneholder avfall i utpekte avfall beholdere med 2-3 lag av biologisk farlige avfall poser. Før avfallshåndtering, Desinfiser av sjenerøst sprøyting avfall med jod/ethoxylated nonylphenol løsning (f.eks Wescodyne) og autoclave.
- Bruk personlig verneutstyr: hår cap, ansikt dekselet, anti-splash ansiktsskjerm, skoovertrekk, disponibel kirurgi kappe og tolags hansker.
- Håndtere infiserte gnagere med ekstrem forsiktighet. Gjennomføre injeksjoner og blod mens mus er under anesthesia (trinn 5.1-5.2 6.3-6.5, 7.3 og 8.1-8.2).
3. isolering av blodkreft stamceller
- Forberede collagenase/dispase løsning for vev fordøyelsen.
- Oppløse collagenase/dispase pulveret å gjøre lagerløsning i en konsentrasjon av 100 mg/mL og lagrer collagenase/dispase lagerløsning på 150 µL dele på 20 ° C.
- Fortynne 150 µL av collagenase/dispase lager med 15 mL RPMI 1640 supplert med 10% FCS og 1% penicillin/streptomycin samarbeider collagenase løsning.
Merk: Den siste konsentrasjonen av collagenase/dispase for vev fordøyelsen er 1 mg/mL.
- Med et sterilt barberblad kuttet fosterets leveren vev (16-24 svangerskapsuke) i små biter (ca 2-3 mm3 i størrelse) etterfulgt av fordøyelsen collagenase/dispase løsning (1 mg/mL) i 30 minutter ved romtemperatur. Juster volumet på fordøyelsen løsning slik at alle vev brikkene er fullstendig neddykket. Bruk baksiden av sprøytestempelet å forsiktig slipe Vevsprøve for å lette fordøyelsen.
- Fordøyelsen blandingen passere en 70-µm sterilt nylon maske filter å erverve en enkeltcelle suspensjon.
- Berike for CD34 + HSCs ved å bruke en Mac per produsentens instruksjoner.
- Telle levedyktig andelen beriket CD34 + HSCs bruker en hemacytometer28 og videre til intrahepatic injeksjon i neonatal NSG mus.
- Fryse den gjenværende beriket CD34 + HSCs i iskaldt media (f.eksCryoStor CS2) og bevare celler i en flytende nitrogen tank. På fremtidig bruk, telle levedyktig andelen tinte CD34 + HSCs før injeksjon. Bruk av frysing media, ligger etter Tin levedyktighet mellom 80-90%.
4. intrahepatic injeksjon for menneskelige CD34 + HSCs i Neonatal NSG mus
Merk: Neonatal NSG mus 2-3 dager fra fødselen er mest egnet til dette som de er sterk nok til å tåle irradiation halv-dødelig dose, mens små nok å helt har svekket uimottakelig systemer. Ingen anestesi kreves for HSC injeksjon.
- Plasser hele søppel neonatal NSG mus (vanligvis 5-10 mus, begge kjønn) i et sterilt pie-formet bestråling bur og utsette for en total dose 200-250 cGy gamma-ray-stråling fra en cesium 137 strålingskilder. Kontroller at stråling dose er serien som betydelig vekttap eller død kan observeres når NSG mus blir utsatt for høye doser av bestråling. 12
Merk: Stråling er helsefarlig, personlig beskyttelse mot stråling bør tas. - Etter bestråling, injisere hver neonatal NSG musen med 5 x 105 levedyktig menneskelige CD34 + HSCs bruker en sprøyte/p oppsett (figur 1). Direkte injisere cellene i leveren.
5. engraftment validering gjennom Retro-Orbital blødning og flyt cytometri analyse
- På 10-12 uker innlegg-HSC injeksjon, bedøve mus ved hjelp av et isoflurane/oksygen innånding apparat. Justere oksygen for å opprettholde isoflurane andel på 4-5%. Anestesi tar 3-5 minutter, avhengig av individuelle musen. Riktig bedøvet mus viser en langsom og dyp pusting mønster, og ingen reaksjon på tå-knipe stimulering.
- Samle inn 50-100 µL av perifert blod fra hver musen gjennom retro-orbital prøvetaking28. Lagre blodprøver i K2EDTA eller heparinized blod samling rør for å hindre koagulering.
Merk: Blod samling rør er pålagt å ha antikoagulerende belegg slik at musen PBMCs kan isoleres fra fullblod for flyt cytometri analyse. EDTA er kjent for å hemme enzymatiske reaksjoner som PCR og qRT PCR; Dermed, hvis nedstrøms enzymatiske reaksjoner er nødvendig, bruk en heparinized blod samling apparater. - Sentrifuge blodprøver 2000 x g i 20 minutter på 4 ° C pellets blod celler.
- Overføre plasma-supernatants til nye microcentrifuge rør etter sentrifugering og butikk på-80 ° C hvis cytokin analyse.
- Lyse røde blodlegemer (RBCs) innen blodlegemer pellet ved romtemperatur i 10 minutter ved hjelp av røde blodlegemer lyseringsbuffer (Tabell for materiale).
Merk: Hvis plasmaprøver ikke er nødvendig, direkte lyse fullblod lysis løsning uten sentrifugering.
- Pellets gjenværende blodlegemer etter RBC lysis 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C; Sug opp nedbryting. Vask celle pellets med 0,01% BSA som inneholder DPBS, sentrifuger 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C og Sug opp nedbryting. Gjenta trinnet vask en gang.
- Blokkere celler med 100 µL av 1 x blokkerer cocktail (tabell 3 for oppskrift) i 20 minutter på 4 ° C.
- Etter blokkering, direkte legge hver antistoff løsning i cellen suspensjon i en konsentrasjon av 2 µL/106 celler og ruge på 4 ° C i 30 minutter. Antistoffer for engraftment validering er: anti-menneskelige CD45 (leukocytter, RRID: AB_2732068), anti-CD3 (T-celler, RRID: AB_396896), anti-CD4 (hjelper T-celler, RRID: AB_397037), anti-CD8 (cytotoksisk T-celler, RRID: AB_2722501), anti-CD14 (monocytter, RRID: AB_10373536), og anti-human CD19 (B-celler, RRID: AB_10373382). Foreslåtte flyt panel, se Tabell 4 og Tabell av materialer for katalogen, RRIDs og partinumre.
Merk: Antistoff flekker i blokkering løsningen eliminerer uspesifisert binding av anti-menneskelige antistoffer mot musen overflate markører, som flere overflate markører deler homologi mellom menneske og mus. - Isolere menneskelige PBMCs fra friske blodgivere og forberede single-farget flyt cytometri kompensasjon kontroller bruker renset menneskelige PBMCs. Alternativt, bruke fluorescens-merket mikrosfærer som kompensasjon kontroller29.
- Analyser eksterne blodprøvene å bruke en flow cytometer og kvantifisere prosentandelen av menneskelige CD45 + celler, menneskeceller CD3 +, menneskelige CD14 + celler og menneskelige CD19 + celler fra total perifert blod celler.
- Nedstrøms HIV-smitte og ventetid studier, beregning av CD4 + T-celler og CD8 + T-celler i CD3 + cellene.
Merk: Vanligvis CD4:CD8 forholdet mellom 1,5 og 2.5 er observert før HIV infeksjon30.
- Nedstrøms HIV-smitte og ventetid studier, beregning av CD4 + T-celler og CD8 + T-celler i CD3 + cellene.
6. analyse av HIV-smitte av hu-NSG mus og Plasma Virusmengden bruker qRT PCR
- Overføre HIV BaL viral aksjer i menneskelig PBMCs fra friske blodgivere høste på dag 10 etter infeksjon og sjarmere bruker p24 ELISA kit31.
- Velg hu-NSG mus med mer enn 20% menneskelige CD45 + celler i perifert blod for HIV-infeksjon.
- Bedøve hu-NSG mus ved hjelp av et isoflurane/oksygen innånding apparat (trinn 5.1).
- Etter å ha bekreftet dyr er anesthetized, injisere HIV BaL virus på en dose på 200 ng av p24 per musen gjennom intraperitoneal rute.
Merk: Vær svært forsiktig med nålen, ikke bruke nåler, og forkaste umiddelbart etter bruk i angitt skarpe beholder. Desinfiser området injeksjon etter virus administrasjon. - Tre uker etter infeksjon, bedøve hu-NSG mus og samle perifert blod gjennom retro-orbital blødning bruker heparinized kapillær rør og samling rør.
- Separat plasma og blod celler med sentrifugering 2000 x g i 20 minutter.
- Lyse RBCs. Block og flekken gjenværende blod celler med antistoffer for flyt cytometri analyse (del 5.3-5.8).
Merk: Flyt cytometri analyse bør fokusere på å sammenlikne CD4:CD8 forholdet før og etter smitte. Betydelig reduksjon i CD4 + celletall forventes, som CD4 antigen fungerer som en co reseptor for viral oppføring. - Bruk plasmaprøver analysere HIV viral laste bruker qRT PCR. Isolere viral RNA fra plasmaprøver ved hjelp av en viral RNA mini kit. Utføre qRT PCR med HIV-1 LTR-spesifikke primere og sonde setter (sekvens detaljer i tabell 5), bruker produsentens protokollen.
7. peroral administrering av handlekurven og validering av Viral undertrykkelse (valgfritt)
Merk: Dette trinnet er valgfritt for undersøkelser om HIV prognose, virologi eller infeksjon-relaterte patofysiologi i akutt infeksjon fasen. Handlevogn behandling av HIV-smittede hu-NSG brukes til recapitulate HIV ventetid blant menneskelige pasienter mottar handlevognen. Er HIV-smittede hu-NSG mus gis handlekurv for 4 uker. Handlevogn diett består av tenofovir disoproxil fumarate (TDF, 300 mg/kapsel), emtricitabine (FTC, 200 mg/kapsel) og raltegravir (RAL, 400 mg/kapsel). Dosen av handlekurven for behandling av HIV-smittede hu-NSG mus er justert etter kroppen areal (tabell 1, Formel 1, tabell 2)32.
- Beregne hvor mye hver medisiner kreves for hver bur under en uke behandling, hensyntatt volumet av vann flasken, antall mus i hver bur, og en gjennomsnittlig daglig vanninntaket 4 ml per musen.
Merk: Hovedpoenget i dette trinnet er å sikre at hver musen får sin daglige dose innen 4 mL av drikkevann. - Grind alle tre medisiner med justerte doser til fint pulver og oppløse den pulver blandingen i sukret vann (f.eks Medidrop Suralose). Endre vannflasken hver uke med fersk oppløst handlevogn cocktail i sukret vann.
Merk: Narkotika pulver kan ikke løses umiddelbart, rist kraftig for å oppnå en homogen suspensjon før retur flasken til holde buret. - Samle perifert blodprøver via retro-orbital blødning annenhver uke og analysere både CD4:CD8 forholdet flowcytometri (del 5.3-5.8) og plasma Virusmengden bruker qRT PCR (avsnitt 6.6).
Merk: Vanligvis etter 4 uker med behandling, plasma viral belastning reduseres til under gjenkjenning grensen og en typisk CD4:CD8 forhold er gjenopprettet.
8. validering av Viral etterpå på handlevognen uttak (valgfritt)
Merk: Dette trinnet er kritisk validere ventetid modellen, viral etterpå på handlevognen uttak gir direkte bevis av en ventetid reservoaret. Det anbefales også å tjene som en kontroll eksperiment for terapeutisk undersøkelser på HIV etterpå suppressants.
- Planlegger for handlekurven uttak etter plasma viral belastning fra perifert blodprøver er under Deteksjonsgrensen og CD4:CD8 forholdet gjenopprettes til mellom 1,5 og 2.5.
- Samle perifert blodprøver gjennom retro-orbital blødning annenhver uke etter handlevogn tilbaketrekning. Nøye overvåke endringen i plasma viral belastning (avsnitt 6.6) samt CD4:CD8 forholdet (del 5.3-5.8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flyt cytometri analyse utføres ofte for å validere renheten av isolerte HSCs, evaluere engraftment nivåer, profil immunreaksjoner til viral infeksjon, og undersøkelser handlevogn effekt. En typisk antistoff-panelet inneholder 4-6 individuelle fluorescently merket antistoffer; Dermed er en flyt cytometer med flere lasere og et bredt utvalg av filtre avgjørende for å oppnå nøyaktige resultater.
For første engraftment validering, den menneskelige CD45 + celletall varierer fra 20% til 80% og delsett av menneskelig leukocytter skal vises som separate bestander på flyt dot-handlingen (figur 2). Forholdet mellom CD4:CD8 forblir mellom 1,5 og 2.5 i en frisk person; betydelig CD4 + uttømming er vanligvis observert på virusinfeksjon, gir en lavere andel av CD4:CD8; og restaurering av sunne forholdet er observert på handlevognen behandling (Figur 3).
qRT PCR gir en gjenkjenning grense på 40 RNA Kopier/mL plasma; riktig fortynninger kreves før eksperimentet. Plasma viral belastning oppdaget bruker qRT PCR i løpet av infeksjon og kjerre diett kan tegnes og brukes til å evaluere effektiviteten av infeksjon og kjerre (Figur 4).
Figur 1. Sprøyte/nål installasjonen brukes for intrahepatic injeksjon.
Skreddersydd Hamilton 80508 sprøytenålen/oppsettet inkluderer en 30-gauge, 51 mm lang nål med en skråkant og en tilknyttet 50-µL glass sprøyten. Maksimal injeksjon volum i denne fremgangsmåten er 25 µL. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Flow cytometri data representerer vellykket engraftment og utviklingen av lymfoide og myeloide celler i perifert blod.
Vellykket forberedt perifert blodprøver må diskret befolkningen separasjoner, og godt engrafted hu-NSG musen bør ha T-celle, B-celle og monocytt positiv bestander presentert i perifert blod. Et CD4:CD8-diagram anbefales for beregning av forholdet. en) vellykket engraftment viste mer enn 25% CD45 + menneskelige leukocytter i perifert blod; diskret befolkningen i b) B-celler, c) monocytter, d) T-celler blant menneskelige CD45 + leukocytter; e) CD4 + hjelper T-celler og f) CD8 + cytotoksisk T-celler skilles godt, og g) gir et forhold mellom 1,5 til 2,5 i denne infisert hu-NSG. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. CD4 + celle antall endringer i løpet av virusinfeksjon, handlekurv og kjerre trekke.
Som infeksjonen utvikler seg, CD4:CD8 forholdet reduseres 1.5-2.5 til > 1.0, CD4:CD8 forholdet har blitt servert som en klinisk parameter i vurderingen HIV prognose samt behandling efficacies. en) representant flyt data indikerer endring i CD4:CD8 prosenter i eksperimentell løpet; b) sammenligning trend diagram som viser effektiviteten av handlevognen som kan identifiseres som gjenopprettet prosentandel av CD4 + T celler. Gjenkjenning av CD4 + T celletall av flowcytometri. N: mange testet mus = 6; Feilfelt: betyr ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001, *** p < 0.0001, ns: nei betydelig annerledes. Toveis VARIANSANALYSE analyse er ansatt. Figur er gjengitt med tillatelse22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Endringer i serum viral RNA kopiere tall i løpet av virusinfeksjon, handlekurv og kjerre trekke
Gjenkjenning av plasma viremia i HIV-smittede hu-NSG mus ved qRT PCR. Skygget indikerer område tidsperioden der mus mottatt handlevogn (fra dag 28 til dag 70 som vist). Grensen for påvisning (angitt med den stiplede linjen) til PCR analysen er (~ 110-160 RNA Kopier/mL) i 50 til 80 µL av plasma fra halen venen. Stjerne (*) angir viral RNA ikke funnet i handlekurven behandlet dyr på dag 56. Serum viral RNA kopi nummer analysert fra perifert blodprøver serverer som direkte bevis om graden av virusinfeksjon. Det bør være i avtalen med CD4 flyt analyse. N: mange testet mus = 6; Feilfelt: betyr ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0.0001, ns: nei betydelig annerledes. Toveis VARIANSANALYSE analyse er ansatt. Figur er gjengitt med tillatelse22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Formel 1. Dose oversettelse basert på kroppen areal (BSA).
Formel for oversette menneskelige dose til dosering mot små forsøksdyr. Km -faktoren kan finnes i tabell 2.
| Medisinering | Daglig Dose (mg) |
| Tenofovir disoproxil fumarate | 300 |
| Emtricitabine | 200 |
| Raltegravir | 800 |
Tabell 1. Daglig dose av enkelte medisiner i handlevognen diett
| Arter | Vekt (kg) | BSA (m2) | K-m -faktoren |
| Menneskelige | |||
| Voksen | 60 | 1.6 | 37 |
| Barn | 20 | 0,8 | 25 |
| Mus | 0,02 | 0.0007 | 3 |
Tabell 2. Vekt, BSA og Km faktor diagram for dose konvertering
| Reagens | Volum (μl) * | Siste konsentrasjon |
| 0,01% BSA i PBS | 98 | |
| 10 mg/ml menneskelige IgG | 1 | 100 μg/ml |
| 10 mg/ml musen IgG | 1 | 100 μg/ml |
| 100 | ||
| * Oppskriften er for en celle utvalg blokkert i 100 μl blokkerer cocktail. Justere volumet tilsvarende med eksempel tall. | ||
Tabell 3. Blokkerer cocktailparty for isolert blodlegemer
| Antistoff | Fluorophore | Ex. Max | EM. Max |
| CD45 | BB515 | 490 nm | 515 nm |
| CD3 | PE-Cy7 | 496 nm | 785 nm |
| CD4 | Pacific Blue | 401 nm | 452 nm |
| CD8 | BUV395 | 348 nm | 395 nm |
| CD14 | APC-Alexa 750 | 650 nm | 774 nm |
| CD19 | PE | 496 nm | 578 nm |
Tabell 4. Foreslåtte multi-farge flyt-panelet
| Fremover Primer | 5-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTG-3 " | |||
| Omvendt Primer | 5-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3 " | |||
| Sonden * | 5-AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTAGTGTTGACT-3 " | |||
| * 5'-FAM, 3-svart hull Quenche 1 | ||||
Tabell 5. HIV-1 LTR primere og probe
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunsupprimerte mus engrafted med menneskelige celler/vev presentere menneskelignende fysiologiske egenskaper og er en enorm verdi for patologi, pathophysiology og immunologi studier om human-spesifikke sykdommer. Blant flere stammer av immunsupprimerte mus, NIKK. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) er den mest immunodeficient på grunn av sin mangel på både medfødte og adaptive immunitet, samt ablated mus-spesifikke cytokin signalering3,12,19 . Derfor NSG mus har blitt mye utnyttet i menneskeliggjøring prosessen, og det er godt etablert at menneskelige celler gjenbefolke i murine perifert blod, lymfoide og myeloid vev, og at mus viser aktuelle menneskelige immunreaksjoner til smittsomme stimulations som HIV27,33.
På grunn av verten begrensningen av HIV var preklinisk dyrestudier HIV virology og infeksjoner prognose tidligere begrenset til ikke-menneskelige primater smittet med simian immunsvikt-virus (SIV, ikke-menneskelige primas versjonen av HIV)3. Vitenskapelige fremskritt i stamcelleforskning og generering av NSG mus har åpnet opp muligheten for HIV forsker på murine smådyr med lavere kostnader og raskere eksperimentelle omsetning. Foreløpig oppnås NSG menneskeliggjøring gjennom transplantasjon av 1) fetal vev og menneskelige HSCs (BLT modell), 2) menneskelig PBMCs (PBL-modellen), og 3) menneskelig HSCs (SRC modell). BLT modellen tilbyr den høyeste engraftment effektivitet samt omfattende utvikling både lymfoide og myeloide funksjoner34,35, men teknisk krevende. PBL modellen er det mest praktisk å etablere, men har en kort eksperimentelle vindu på engraftment som følge av GVHD; i tillegg det bare tilbyr anstendig eksterne T-celle svar og mangler lymfoide og myeloide utvikling. For disse grunner ansatt vi SRC modellen i denne protokollen tilpasninger oppfyller kravene for HIV undersøkelser. Hu-NSG modellen er helt blottet for immunforsvar og effektiv benet margtransplantasjon homing stråling og transplantasjon; Videre tillater viral utfordring og senere undersøkelser i yngre alder, unngå utviklingen av alder-relaterte patologisk problemer kjent for hilsen belastning bakgrunnen. Selv om T-celler i hu-NSG modellen er utdannet i musen thymic omgivelser, og er bare H2-begrenset, kan flere, hvis ikke alle delsett av menneskelig immunceller utvikle og kolonisere musen lymfoide og myeloide organer. Merkbart, er gut-assosiert lymfoid vev av hu-NSG modellen også rekonstruert med menneskelige immunceller; Således, denne modellen kan potensielt oppbacking HIV mucosal overføring, ligner på BLT modell22,23.
En av de største hindringene for utrydde HIV er eksistensen av et ventetid reservoar blant pasienter behandlet med undertrykkende handlevogn33,36,37,38,39. Latently infiserte celler forblir quiescent, og bidra til HIV viral etterpå på handlevognen tilbaketrekning. Ventetid reservoarer ligger anatomisk i leveren, milt, hjernen og andre lymfoide vev og består hovedsakelig av minne CD4 + T-celler36,40,41. Som rapportert av vår gruppe, støtter hu-NSG modellen fullt utviklingen av T celle avstamning, godt egnet for patologisk modellering av HIV ventetid. Vi viste denne modellen er svært utsatt i viral infeksjon og senere til handlekurven diett via peroral administrering. Dramatiske viral etterpå skjer umiddelbart på handlevognen tilbaketrekking, som støtter eksistensen av en ventetid reservoaret. Latently infisert minne CD4 + T-celler kan være isolert fra lymfoide organer i HIV-smittede hu-NSG under handlevogn, og viral utvekst analyser recapitulate viral etterpå ex vivo41. Hu-NSG modellen og HIV infeksjon/cART diett beskrevet i denne protokollen dermed har bred programmer i felt knyttet til HIV virologi, infeksjon prognose, ventetid patofysiologi og antiretroviral therapeutics utvikling.
Hu-NSG musemodell i denne protokollen krever bestråling og intrahepatic injeksjon av HSCs på dag 2-3 etter fødsel; Derfor, internt avl og bestemt boforhold er nødvendig. Selv om neonatal HSC transplantasjon generelt gir høy engraftment effektivitet, i noen tilfeller kan alvorlige GVHD oppstå. I noen tilfeller, en betydelig reduksjon i eksterne CD45 + celletall kan observeres på infeksjon, og i ekstreme forhold, perifert blod CD45 + uttømming kan observeres; Derfor kan blod samling og flyt cytometri analyse være utfordrende. En av de store begrensningene av denne hu-NSG musemodell ligger innenfor chimeric natur T-cellene. T-celler i hu-NSG musemodell er utdannet i musen thymic miljøet og er H2-begrenset stedet for å være HLA-begrenset. full recapitulation av de dynamiske endringene av T-celle delsett på infeksjon er derfor mindre sannsynlig. Videre, selv om hu-NSG musemodell utstillinger god mottakelighet for HIV-1 smitte, observerte plasma viral belastning kan være several-fold lavere enn i BLT modellen, sannsynligvis incomprehensive rekonstituering menneskelige lymfoide og myeloide funksjoner.
I sammendraget gir hu-NSG musen avbildet i denne protokollen en enkel og effektiv metode for å generere en humanized musemodell for HIV virologi og ventetid studier, som et alternativ til BLT modellen. Til tross for dens begrensninger i omfattende lymfoide og myeloide utvikling, har hu-NSG modellen vist mottagelig å infeksjon og responsive til behandling eller andre therapeutics22,23,24. Ventetid patologi modellen etablert etter denne protokollen viser HIV viral etterpå i vivo og latently infiserte minne CD4 + T-celler kan ytterligere isolert for videre undersøkelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne avsløre noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [gi nummer R01AI29329, R01AI42552 og R01HL07470 til J.J.R.] og National Cancer Institute av National Institutes of Health [bevilgning nummer P30CA033572 å støtte byen av håpe integrerende Genomics Analytiske farmakologi og analytisk cytometri kjerner]. Følgende reagensen var oppnådd gjennom NIH AIDS-forskning og referanse reagens Program, avdeling av AIDS, NIAID, NIH: HIV BaL virus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
| CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
| IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
| Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
| Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
| Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
| Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
| Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
| Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
| QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
| TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
| HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
| IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
| APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
| PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |
References
- Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
- Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
- McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
- McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
- Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
- King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
- Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
- Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
- Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
- Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
- Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
- Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O'Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
- Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
- Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
- Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
- van't Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
- Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
- Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
- Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
- Chun, T. -W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
- Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
- Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).
