Summary

استراتيجية فعالة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بتحرير الجينوم

Published: September 19, 2018
doi:

Summary

نقدم هنا، وسيلة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بالاستعاضة عن إكسون الترميز الأول من الجينات مع برامج النسخ. الأسلوب كريسبر/Cas9-تعتمد يضع تسلسل ترانساكتيفاتور تحت تنظيم الجين حل محل الذاتية، ويسهل التعبير ترانسكتيفاتور حصرا في أنماط الزمانية المكانية الخاصة بالجينات وبالتالي.

Abstract

نظم النسخ ثنائي أدوات قوية الوراثية المستخدمة على نطاق واسع لتصور، والتلاعب بالخلية التعبير مصير والجينات في مجموعات محددة من الخلايا أو الأنسجة في الكائنات نموذج. هذه النظم تحتوي على عنصرين هما كخطوط منفصلة وراثيا. سطر برنامج تشغيل يعرب منشط النسخي تحت السيطرة من الأنسجة على حدة المروجين/القدرة على، ومرافئ خط مراسل/المستجيب جين المستهدف وضع مجرى النهر إلى موقع ربط المنشط النسخ. حمل الحيوانات التي تأوي كل من مكونات ترانساكتيفيشن الخاصة بالانسجة لتعبير الجينات المستهدفة. دقة التعبير الزمانية المكانية للجينات في الأنسجة المستهدفة حاسمة بالنسبة لتفسير غير متحيز لنشاط الخلية/الجينات. ولذلك، وضع أسلوب لتوليد خطوط الحصرية الخاصة بخلية/الأنسجة سائق ضروري. هنا نقدم طريقة لإنشاء نظام التعبير العالية الخاصة بالانسجة المستهدفة باستخدام “متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب تكرار/كريسبر-المرتبطة” (كريسبر/Cas)-على أساس الجينوم تحرير الأسلوب. في هذا الأسلوب، دليل اندونوكليسي ويستهدف Cas9 اثنين تشيميريك الكشف (جرنة) إلى مواقع محددة في إكسون الترميز الأول للجينات في الجينوم المورفولوجية لإنشاء فواصل مزدوجة-ستراند (جهاز تسوية المنازعات). فيما بعد، باستخدام بلازميد مانحة خارجية تحتوي على تسلسل ترانساكتيفاتور، آلات إصلاح الخلية ذاتية تمكن الإصلاح الموجه من التماثل (HDR) من جهاز تسوية المنازعات، مما يؤدي إلى الحذف الدقيق واستبدال إكسون مع ترانساكتيفاتور التسلسل. وأعرب عن ترانساكتيفاتور طرقت في حصرا في الخلايا حيث رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية لاستبدال الجينات الوظيفية. البروتوكول خطوة بخطوة مفصلة تقدم هنا لتوليد سائق النسخي ثنائي المعرب عنها في صندوق الأجيال القادمة المورفولوجية/فروعها-إنتاج الخلايا الظهارية/العصبية يمكن اعتمادها لأي تعبير الجينات أو أنسجة محددة.

Introduction

الأدوات الجينية للجينات المستهدفة قد وضعت أيضا في المورفولوجية، يجعلها واحدة من أفضل أنظمة نموذجية للتحقيق في وظيفة الجينات المشاركة في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية. نظم ثنائية التعبير، مثل الخميرة Gal4/UAS (التسلسل التنشيط المنبع)، اعتمد أولاً للأنسجة على حدة محسن ميسيكسبريشن الملائمة والجينات في نموذج الجينية المورفولوجية 1 (الشكل 1). هذا النظام على تيسير تطوير عدد كبير من تقنيات مثل تنظيم الزمانية المكانية overexpression الجينات، ميسيكسبريشن، وخروج المغلوب في مجموعات محددة من الخلايا، وكذلك كما هو الحال في خلية التذرية، ووسم الخلية، واقتفاء أثر مباشر الخلوية والجزيئية العمليات في الأجنة والأنسجة وتتبع النسب والتحليلات فسيفساء أثناء التطوير. عدد من النسخ ثنائي النظام، مثل البكتيريا ليزا نيوروسبورا س-نظام، ونظامليزاالبروتوكول الاختياري (الشكل 1) هي أدوات قوية الجينية التي تستخدم الآن على نطاق واسع في المورفولوجية، بالإضافة إلى نظام Gal4/UAS الأصلي للجينات المستهدفة التعبير1،،من23.

وهنا نقدم طريقة لإنشاء نظام موثوق بها للغاية الخاصة بالانسجة ثنائي التعبير باستخدام أسلوب التحرير الجينوم. التطورات الأخيرة في كريسبر/Cas9 الجينوم تكنولوجيا تحرير أتاحت فرصاً غير مسبوقة لإجراء تغييرات جينوم الموجهة في طائفة واسعة من الكائنات الحية. بالمقارنة مع التقنيات المتاحة الجينوم التحرير الأخرى، نظام كريسبر/Cas9 رخيصة وفعالة وموثوق بها. وتستخدم هذه التكنولوجيا مكونات الجهاز المناعي التكيفي البكتيرية: اندونوكليسي Cas9 العقدية المقيّحة يقوم بإنشاء فاصل مزدوج-ستراند (جهاز تسوية المنازعات)، ودليل تشيميريك رنا (جرنة)، التي توجه Cas9 لموقع معين جينوم ل جهاز تسوية المنازعات المستهدفة4. الخلايا تحتوي على إليه لإصلاح جهاز تسوية المنازعات باستخدام مسارات مختلفة. نهاية مثلى عدم الالتحاق بالعمل (نج) يؤدي إلى الصغيرة عمليات الإدراج أو الحذف لتعطيل وظيفة الجينات، وحين يدخل الإصلاح الموجه من التماثل (HDR) من معرفة الموجهة/مرغوب فيه الجينوم تدق-في/المغلوب باستخدام جهة مانحة خارجية في تقرير التنمية البشرية كقالب. كفاءة يمكن أن تستخدم استراتيجية استبدال المستندة إلى تقرير التنمية البشرية لإنشاء نظام موثوق بها للغاية الخاصة بالانسجة ثنائي تعبير، التي يمكن التغلب على جميع القيود المفروضة على أساليب فخ محسن التقليدية. يصف لنا إجراء خطوة بخطوة للاستفادة إصلاح HDR كريسبر/Cas9-تعتمد في توليد خط نسخ ثنائي برنامج تشغيل التي يتم التعبير عنها تحت سيطرة الذاتية تنظيم النسخي وبوستترانسكريبشونال المورفولوجية الجينات. في هذا البروتوكول، ونظهر توليد خط برنامج تشغيل محدد فروعها (bnl) الجينات ترميز بروتين أسرة صندوق الأجيال القادمة الذي ينظم morphogenesis المتفرعة من مجرى الهواء الرغامى ظهارة5. في هذا المثال، استعيض إكسون الترميز الأول من الجينات bnl تسلسل تسلسل ترانساكتيفاتور ليزا البكتيرية دون تغيير أي الذاتية رابطة الدول المستقلة-تسلسل الجين bnl التنظيمية. نظهر أن الاستراتيجية التي تم إنشاؤها بخط سائق bnl-ليزا سباتيوتيمبورالي يتحكم في التعبير عن الجينات مراسل وضعت المتلقين للمعلومات من ليكساوبيراتور (ليكساوب أو لكسو) حصرا في bnl- وإذ تعرب عن الخلايا الظهارية/الوسيطة/العصبية.

Protocol

1-تصميم وتشييد جرنة “ناقلات التعبير” لتحل محل منطقة محددة بفترة طويلة من إكسون دقة، استخدم جرنة مزدوج نهج6، التي تستهدف كل جرنة يمكن على وجه التحديد طرفي المنطقة المحددة التي تهم. للحصول على تعبير الزمانية المكانية الخاصة بالجينات دقيقة من برنامج التشغيل، حدد اثنين من ال?…

Representative Results

هذا البروتوكول استخدمت بنجاح لإنشاء تعبير ثنائي المستهدف مراسل نظام محدد ل bnl معربا عن الخلايا5. رابطة الدول المستقلة-لا تتسم العناصر التنظيمية (CREs) التي تتحكم في التعبير الزمانية المكانية المعقدة bnl . ولذلك، صمم إكسون الترميز الأول فقط من bnl</…

Discussion

تقليديا، تم إنشاؤها المورفولوجية محسن الفخاخ بطريقتين مختلفتين. واحدة من الطرق تشمل الإدراج عشوائي من برنامج التشغيل (على سبيل المثال.، Gal4) تسلسل جينوم بتبديل (مثلاً.، تبديل عنصر P)1 . بدلاً من ذلك، يمكن وضع تسلسل سائق تحت سيطرة منطقة محسن/المروج المفترضة في بناء ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور ف. منفذ والدكتور ك. أوكونور-جايلز الدكتور س. فنغ للمناقشات بشأن الاستراتيجية كريسبر؛ الدكتور يد كورنبرغ، ومركز الأسهم بلومينغتون الكواشف؛ الخفة في التصوير المرافق الأساسية؛ وتمويل من المعاهد الوطنية للصحة: R00HL114867 و R35GM124878 بريال.

Materials

X-Gal/IPTG Gentrox (Genesee Scientific) 18-218 cloning
LB-Agar BD Difco BD 244520 cloning
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253 Molecular Biology
EDTA Sigma Aldrich E1161 Molecular Biology
NaCl Sigma Aldrich S7653 Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water ThermoFisher Scientific 10977-023 Molecular Biology
10%SDS Sigma Aldrich 71736 Molecular Biology
KOAc Fisher-Scientific P1190 Molecular Biology
EtOH Fisher-Scientific 04-355-451 Molecular Biology
GeneJET Miniprep ThermoFisher Scientific K0503 Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits ThermoFisher Scientific K210006 Maxiprep
BbsI NEB R0539S Restriction enzyme
Primers IDT-DNA PCR
pCFD4 Kornberg Lab DNA template and vector for gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) Kapa biosystems KK2601 PCR
Q5-high fidelity Taq NEB NEB #M0491 PCR
Gibson Assembly Master Mix NEB NEB #E2611 DNA assembly
pBPnlsLexA:p65Uw Addgene DNA template for LexA amplification
Proteinase K ThermoFisher Scientific 25530049 Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red) Sydlab MB067-EQ2R Molecular Biology
Gel elution kit Zymo Research (Genesee Scientific) 11-300 Molecular Biology
TRI reagent Sigma-Aldrich Molecular Biology
Direct-zol RNA purification kits Zymo Research (Genesee Scientific) 11-330 Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR Kit NEB E5315S Molecular Biology
lexO-CherryCAAX Kornberg Lab Fly line
UAS-CD8:GFP Kornberg lab Fly line
btl-Gal4 Kornberg lab Fly line
MKRS/TB6B Kornberg lab Fly line
Confocal Microscope SP5X Leica Imaging expression pattern
CO2 station Genesee Scientific 59-122WCU fly pushing
Stereo microscope Olympus SZ-61 fly pushing
Microtube homogenizing pestles Fisher-Scientific 03-421-217 genomic DNA isolation
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-1000 DNA quantification

References

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
  3. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  4. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).
  6. Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
  7. Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O’Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).
  8. Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  9. Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
  10. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), 657-664 (2013).
  11. Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Lin, C. -. C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).
  13. Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).

Play Video

Cite This Article
Du, L., Zhou, A., Sohr, A., Roy, S. An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing. J. Vis. Exp. (139), e58268, doi:10.3791/58268 (2018).

View Video