Summary

Genom düzenleyerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için etkili bir strateji

Published: September 19, 2018
doi:

Summary

Burada, ilk kodlama exon genlerin transkripsiyon sürücüleri ile değiştirerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için bir yöntem mevcut. CRISPR/Cas9-tabanlı yöntemi bir transactivator sıra değiştirilen bir gen endojen Yönetmeliği altında yerleştirir ve sonuç olarak transctivator ifade sadece şekillerindeki gene özgü kronolojik zamanmekansal kolaylaştırır.

Abstract

İkili transkripsiyon sistemleri görselleştirme ve hücre kader ve gen ifade hücrelerin belirli gruplar veya model organizmalar içinde doku manipülasyonu için yaygın olarak kullanılan güçlü genetik araçlardır. Bu sistemlerde iki bileşeni ayrı transgenik çizgiler olarak bulunmaktadır. Bir sürücü çizgi transkripsiyon bir aktivatör doku özel Rehberleri/arttırıcılar kontrolünü ve hedef gen aşağı transkripsiyon harekete geçirmek bağlama sitesine yerleştirilen bir muhabir/efektör satır limanları altında ifade eder. Her iki bileşenin yataklık hayvan doku özgü transactivation bir hedef Gen ifadesinin neden. Kesin kronolojik zamanmekansal gen hedeflenen dokularda hücre/gen etkinliğini tarafsız yorumlanması için kritik ifadesidir. Bu nedenle, özel hücre/doku özel sürücü satırları oluşturmak için bir yöntem geliştirmek esastır. Burada istihdam ederek yüksek doku özel hedeflenmiş ifade sistemi oluşturmak için bir yöntem mevcut bir “düzenli olarak kümelenmiş Interspaced kısa palindromik tekrar/CRISPR-ilişkili” (CRISPR/CA)-Teknik düzenleme genom dayalı. Bu yöntemde, bir genin iki iplikçikli kırılmalar (DSB) oluşturmak için Drosophila genom içinde ilk kodlama exon belirli sitelere RNA’ların (gRNA) yol Cas9 chimeric iki tarafından hedeflenen endonükleaz. Daha sonra transactivator sıra içeren bir eksojen donör plazmid kullanmak, hücre özerk onarım makineleri Homoloji yönetmen onarım (HDR) kesin silme ve değiştirme exon transactivator ile sonuçlanan DSB, sağlar sıra. Knocked olarak transactivator sadece hücrelerde ifade edilir nerede CIS-eski yerine koymak gen düzenleyici elemanlarının fonksiyonel. Burada ikili bir transkripsiyon sürücü Drosophila fgfiçinde ifade oluşturmak için sunulan ayrıntılı adım adım Protokolü /branchless-epitel/nöronal hücreleri üreten kabul için herhangi bir gen veya doku özel ifade.

Introduction

Genetik toolbox için hedeflenen Gen ifadesinin de dahil çok çeşitli hücresel genlerin işlevi araştırmak için en iyi model sistemleri biri haline Drosophila, geliştirilmiştir. Maya Gal4/UAS (ters yönde harekete geçirmek sıra) gibi ikili ifade sistemleri ilk doku özgü artırıcı bindirme ve gen misexpression Drosophila genetik model1 (Şekil 1) için kabul edilmiştir. Bu sistem çok sayıda gen overexpression, misexpression, seçili grup hücreleriyle de olduğu gibi hücre ablasyon, hücre işaretleme, hücresel ve moleküler canlı izleme nakavt kronolojik zamanmekansal düzenlenmesi gibi teknikleri geliştirilmesi kolaylaştırdı embriyo ve doku, soy izleme ve mozaik analizleri geliştirme sırasında süreçleri. Bakteriyel LexAgibi ikili transkripsiyon sistemi bir dizi /LexAop sistemi (Şekil 1) ve Neurospora Q-sistem, şimdi yaygın olarak Drosophila, ek olarak kullanılan güçlü genetik Araçlar Orijinal Gal4/UAS sistemi için hedeflenen gen ifade1,2,3.

Burada, genom düzenleme tekniği istihdam ederek son derece sağlam doku özel ikili ifade sistemi oluşturmak için bir yöntem mevcut. CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisinde son gelişmeler çok çeşitli organizmalar yönlendirilmiş genom değişiklikler yapmak eşi görülmemiş fırsat sağladı. Diğer kullanılabilir genom düzenleme teknikleri için karşılaştırıldığında, CRISPR/Cas9 sistem, verimli, ucuz ve güvenilir. Bu teknoloji bakteriyel adaptif bağışıklık sisteminin bileşenleri kullanır: bir Cas9 endonükleaz iki iplikçikli mola (DSB) oluşturan Streptococcus pyogenes ve Cas9 için belirli genom sitesine kılavuzları chimeric Kılavuzu RNA (gRNA), hedeflenen DSB4. Hücreleri farklı yollar kullanarak DSB onarmak için makine içerir. Sigara homolog sonunda (NHEJ) katılmadan küçük eklemelerin veya silmelerin eksojen bir HDR donör şablon olarak kullanarak bir tanımlanmış yönetmen/arzu genomik knock-içinde/knock-out Homoloji yönetmen onarım (HDR) tanıttı iken gen işlevi, bozmaya yol açar. HDR tabanlı yedek stratejisi verimli bir şekilde geleneksel artırıcı tuzak yöntemleri tüm sınırlamalar üstesinden son derece sağlam doku özel ikili ifade sistemi oluşturmak için yararlı olabilir. Biz bir Drosophila endojen transkripsiyon ve çoğu düzenleme kontrolü altında ifade edilir bir ikili transkripsiyon sürücü çizgi oluşturma HDR CRISPR/Cas9-esaslı onarım kullanımı için adım adım bir yordam tarif gen. Bu protokol için biz göstermek için belirli bir sürücü satır nesil branchless trakeal hava yolu epitel5dallanma morfogenez düzenleyen bir FGF aile protein kodlama (bnl) Gen. Bu örnekte, bir bakteriyel LexA transactivator sıra sıra tarafından herhangi bir endojen CISdeğiştirmeden ilk kodlama exon bnl gen değiştirildi- bnl gen düzenleyici diziler. Biz strateji sadece bnl – içinde LexAoperator (LexAop veya LexO) aşağı yerleştirilen bir muhabir gen ifadesi spatiotemporally denetleyen bir bnl LexA sürücü satır oluşturulan gösterir epitel/mezenkimal/nöronal hücre ifade ediyorum.

Protocol

1. tasarlama ve gRNA ifade vektör oluşturma Tam bir exon uzun tanımlanmış bir bölgenin değiştirmek için her gRNA özellikle ilgi seçili bölgenin iki ucu hedefleyebilirsiniz bir çift gRNA yaklaşım6, kullanın. Sürücünün doğru bir gen özgü kronolojik zamanmekansal ifade elde etmek için iki gRNA hedef site içinde ilk kodlama exon genin seçin. Drosophila melanogasteriçin flyCRISPR en iyi hedef bulma aracını (http://tools.flycrispr.molbio…

Representative Results

Bu iletişim kuralı başarıyla hedeflenen ikili ifade muhabir sistem belirli hücreleri5ifade bnl için bir oluşturmak için kullanılan. BDT-karmaşık kronolojik zamanmekansal bnl ifade kontrol düzenleyici elemanlarının (CREs) değil karakterize. Bu nedenle, kronolojik zamanmekansal ifade endojen bnl Düzenleyici sıralı denetim altında elde etmek için yalnızca ilk kodlama exon bnl , bakteriyel LexA …

Discussion

Geleneksel olarak, Drosophila artırıcı tuzakları iki farklı yöntemlerle üretilen. Bir yolu bir sürücü rasgele yerleştirilmesi içerir (örneğin., Gal4) genom tarafından devralınmasına sırayla (e.g., P-eleman transpozisyonu)1 . Alternatif olarak, sürücü dizileri sonra genom3,11ektopik bir siteye entegre bir plazmid yapısında bir sözde artırıcı/organizatörü bölgesinin transkripsiyon kont…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. F. liman, Dr. K. O’Connor-Giles ve Dr. S. Feng CRISPR strateji üzerine tartışmalar için teşekkürler; Dr. T.B. Kornberg ve reaktifler Bloomington stok merkezi; UMD görüntüleme çekirdek tesis; ve NIH finansman: R00HL114867 ve R35GM124878 SR.

Materials

X-Gal/IPTG Gentrox (Genesee Scientific) 18-218 cloning
LB-Agar BD Difco BD 244520 cloning
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253 Molecular Biology
EDTA Sigma Aldrich E1161 Molecular Biology
NaCl Sigma Aldrich S7653 Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water ThermoFisher Scientific 10977-023 Molecular Biology
10%SDS Sigma Aldrich 71736 Molecular Biology
KOAc Fisher-Scientific P1190 Molecular Biology
EtOH Fisher-Scientific 04-355-451 Molecular Biology
GeneJET Miniprep ThermoFisher Scientific K0503 Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits ThermoFisher Scientific K210006 Maxiprep
BbsI NEB R0539S Restriction enzyme
Primers IDT-DNA PCR
pCFD4 Kornberg Lab DNA template and vector for gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) Kapa biosystems KK2601 PCR
Q5-high fidelity Taq NEB NEB #M0491 PCR
Gibson Assembly Master Mix NEB NEB #E2611 DNA assembly
pBPnlsLexA:p65Uw Addgene DNA template for LexA amplification
Proteinase K ThermoFisher Scientific 25530049 Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red) Sydlab MB067-EQ2R Molecular Biology
Gel elution kit Zymo Research (Genesee Scientific) 11-300 Molecular Biology
TRI reagent Sigma-Aldrich Molecular Biology
Direct-zol RNA purification kits Zymo Research (Genesee Scientific) 11-330 Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR Kit NEB E5315S Molecular Biology
lexO-CherryCAAX Kornberg Lab Fly line
UAS-CD8:GFP Kornberg lab Fly line
btl-Gal4 Kornberg lab Fly line
MKRS/TB6B Kornberg lab Fly line
Confocal Microscope SP5X Leica Imaging expression pattern
CO2 station Genesee Scientific 59-122WCU fly pushing
Stereo microscope Olympus SZ-61 fly pushing
Microtube homogenizing pestles Fisher-Scientific 03-421-217 genomic DNA isolation
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-1000 DNA quantification

References

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
  3. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  4. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).
  6. Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
  7. Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O’Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).
  8. Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  9. Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
  10. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), 657-664 (2013).
  11. Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Lin, C. -. C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).
  13. Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).

Play Video

Cite This Article
Du, L., Zhou, A., Sohr, A., Roy, S. An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing. J. Vis. Exp. (139), e58268, doi:10.3791/58268 (2018).

View Video