Summary

Uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila editando genoma

Published: September 19, 2018
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Summary

Aqui, apresentamos um método para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila , substituindo o primeiro exon codificação de genes com drivers de transcrição. O método baseado em CRISPR/Cas9 coloca uma sequência liberada sob o Regulamento endógena de um gene substituído e, consequentemente, facilita a expressão de transctivator exclusivamente em padrões spatiotemporal gene-específico.

Abstract

Sistemas de transcrição binário são poderosas ferramentas de genéticas, amplamente utilizadas para visualizar e manipular a célula destino e gene expression em grupos específicos de células ou tecidos em organismos-modelo. Estes sistemas contêm duas componentes linhas transgénicas. Uma linha de motorista expressa um ativador transcricional sob o controle de promotores/potenciadores de tecido-específica e uma linha de repórter/efetoras portos um gene alvo colocado a jusante para o sítio de ligação do ativador da transcrição. Animais, abrigando os dois componentes induzem transactivation tecido-específica de uma expressão de gene alvo. Preciso spatiotemporal expressão do gene nos tecidos alvo é crítica para interpretação imparcial da atividade celular/gene. Portanto, é essencial desenvolver um método para gerar linhas de motorista exclusivo de célula/tecido-específica. Aqui nós apresentamos um método para gerar o sistema altamente específicos do tecido-alvo expressão empregando um “Clustered regularmente Interspaced curta palíndromo Repeat/CRISPR-associado” (CRISPR/Cas)-com base técnica de edição de genoma. Neste método, a endonuclease Cas9 é alvo de dois quimérico guia RNAs (gRNA) para locais específicos no primeiro exon codificação de um gene no genoma de Drosophila para criar quebras de dobro-Costa (DSB). Posteriormente, usando um plasmídeo exógena do doador que contém a sequência de liberada, a maquinaria de reparo celular-autónoma permite reparação homologia-dirigido (HDR) de ORL, resultando em preciso exclusão e substituição do exon com a liberada sequência. A batido em liberada é expressa exclusivamente nas células onde o cis-elementos reguladores do gene substituído são funcionais. O protocolo passo a passo detalhado apresentado aqui para gerar um binário driver transcriptional expressado em Drosophila fgf/branchless-produção de células epiteliais/neuronal pode ser adotado para qualquer expressão de gene – ou tecido-específica.

Introduction

A caixa de ferramentas genética para a expressão do gene alvo bem desenvolveu-se em Drosophila, tornando-o um dos melhores sistemas de modelo para investigar a função de genes envolvidos em uma ampla variedade de processos celulares. Sistemas de expressão binário, como fermento Gal4/UAS (sequência de ativação upstream), foi adotado inicialmente por misexpression de trapping e gene potenciador de tecido-específica na drosófila genética modelo1 (Figura 1). Este sistema facilitou o desenvolvimento de um grande número de técnicas como spatiotemporal regulamento da superexpressão do gene, misexpression, nocaute em grupos selecionados de células, bem como em ablação de célula, marcação de célula, ao rastreamento de celular e molecular processos em embriões e tecidos, rastreamento de linhagem e análises de mosaico durante o desenvolvimento. Um número do sistema binário de transcrição, tais como o bacteriana LexA/ sistemaLexAop (Figura 1) e Q-sistema de Neurospora , são poderosas ferramentas genéticas que são amplamente utilizadas em Drosophila, além de o sistema original de Gal4/UAS para expressão de gene alvo a1,2,3.

Aqui, apresentamos um método para gerar o sistema altamente confiável tecido-específica de expressão binário empregando uma técnica de edição de genoma. Aos recentes avanços na tecnologia de edição CRISPR/Cas9 genoma permitiu oportunidades sem precedentes para fazer mudanças de direção do genoma em uma ampla gama de organismos. Em comparação com outras técnicas de edição disponíveis do genoma, o sistema CRISPR/Cas9 é barato, eficiente e confiável. Esta tecnologia utiliza componentes do sistema imune adaptativo bacteriano: uma endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes que cria uma ruptura da dobro-Costa (DSB) e um RNA guia Quimérico (gRNA), que orienta a Cas9 para um site específico do genoma para alvo de ORL4. As células contêm a maquinaria para reparar o ORL usando diferentes caminhos. Não-homóloga final juntando (NHEJ) leva a pequenas inserções ou exclusões para perturbar a função dos genes, enquanto reparo homologia-dirigido (HDR) introduz um definido dirigido/desejável genômica em/TOC-nocaute usando um doador HDR exógeno como um modelo. A estratégia de substituição baseada em HDR com eficiência pode ser utilizada para gerar um sistema altamente confiável expressão binário de tecido-específica, que pode superar todas as limitações dos métodos tradicionais potenciador armadilha. Descrevemos um procedimento passo a passo para a utilização do reparo HDR CRISPR/Cas9-baseado na geração de uma linha de driver binário da transcrição que se expressa sob o controle de endógena regulação transcricional e pós-transcricional de um da drosófila gene. Neste protocolo, demonstramos a geração de uma linha de motorista específica para branchless (bnl) gene que codifica uma proteína de família FGF que regula a morfogênese de ramificação da via aérea traqueal epitélio5. Neste exemplo, o primeiro exon codificação do gene da bnl foi substituído pela sequência de uma sequência de liberada bacteriana LexA sem alterar qualquer endógena cis-sequências reguladoras do gene do bnl . Mostramos que a estratégia gerou uma linha de motorista bnl-LexA que spatiotemporally controla a expressão de um gene repórter, colocado a jusante do LexAoperator (LexAop ou seguir) exclusivamente na bnl- expressando as células epiteliais/mesenquimais/neuronal.

Protocol

1. projetar e construir a gRNA vetor de expressão Para precisamente substituir uma região tempo definida de um exon, use uma gRNA dupla abordagem6, em que cada gRNA pode alvejar especificamente duas extremidades da região selecionada de interesse. Para obter uma expressão spatiotemporal precisa de gene-específico do driver, selecione dois sites de destino gRNA dentro o primeiro exon codificação do gene. Drosophila melanogaster, selecione os sites de des…

Representative Results

Este protocolo foi utilizado com sucesso para gerar um alvo expressão binário repórter sistema específico para bnl expressando células5. O cis-elementos reguladores (CREs) que controlam a expressão complexa spatiotemporal bnl não são caracterizados. Portanto, para alcançar expressão spatiotemporal sob o controlo da sequência reguladora endógena bnl , somente o primeiro exon codificação do bnl foi projetado …

Discussion

Tradicionalmente, as armadilhas potenciador de Drosophila foram geradas por dois métodos diferentes. Uma das maneiras inclui inserção aleatória de um driver (eg., Gal4) sequência no genoma por transposição (EG., transposição de P-elemento)1 . Alternativamente, as sequências de motorista podem ser colocadas sob o controle transcricional de uma região de putativo realçador/promotor em uma construção do plasmídeo, que iria então ser integrada em um site de g…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Dr. F. Porto, Dr. K. o ‘ Connor-Giles e Dr. S. Feng para discussões sobre estratégia CRISPR; Dr. T.B. Kornberg e o centro de estoque de Bloomington para reagentes; Instalação de núcleo de imagens de UMD; e financiamento do NIH: R00HL114867 e R35GM124878 ao Sr.

Materials

X-Gal/IPTG Gentrox (Genesee Scientific) 18-218 cloning
LB-Agar BD Difco BD 244520 cloning
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253 Molecular Biology
EDTA Sigma Aldrich E1161 Molecular Biology
NaCl Sigma Aldrich S7653 Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water ThermoFisher Scientific 10977-023 Molecular Biology
10%SDS Sigma Aldrich 71736 Molecular Biology
KOAc Fisher-Scientific P1190 Molecular Biology
EtOH Fisher-Scientific 04-355-451 Molecular Biology
GeneJET Miniprep ThermoFisher Scientific K0503 Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits ThermoFisher Scientific K210006 Maxiprep
BbsI NEB R0539S Restriction enzyme
Primers IDT-DNA PCR
pCFD4 Kornberg Lab DNA template and vector for gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) Kapa biosystems KK2601 PCR
Q5-high fidelity Taq NEB NEB #M0491 PCR
Gibson Assembly Master Mix NEB NEB #E2611 DNA assembly
pBPnlsLexA:p65Uw Addgene DNA template for LexA amplification
Proteinase K ThermoFisher Scientific 25530049 Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red) Sydlab MB067-EQ2R Molecular Biology
Gel elution kit Zymo Research (Genesee Scientific) 11-300 Molecular Biology
TRI reagent Sigma-Aldrich Molecular Biology
Direct-zol RNA purification kits Zymo Research (Genesee Scientific) 11-330 Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR Kit NEB E5315S Molecular Biology
lexO-CherryCAAX Kornberg Lab Fly line
UAS-CD8:GFP Kornberg lab Fly line
btl-Gal4 Kornberg lab Fly line
MKRS/TB6B Kornberg lab Fly line
Confocal Microscope SP5X Leica Imaging expression pattern
CO2 station Genesee Scientific 59-122WCU fly pushing
Stereo microscope Olympus SZ-61 fly pushing
Microtube homogenizing pestles Fisher-Scientific 03-421-217 genomic DNA isolation
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-1000 DNA quantification

References

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Cite This Article
Du, L., Zhou, A., Sohr, A., Roy, S. An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing. J. Vis. Exp. (139), e58268, doi:10.3791/58268 (2018).

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