Summary

Eine wirksame Strategie zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila von Genom-Bearbeitung

Published: September 19, 2018
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Summary

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila der erste kodierende Exon Gene durch Transkription Treiber ersetzen. CRISPR/Cas9-basierte Methode stellt eine transaktivator Sequenz der endogenen Verordnung eines Gens ersetzt und somit erleichtert Transctivator Ausdruck ausschließlich im Gen-spezifischen räumlich-zeitliche Muster.

Abstract

Binäre Transkription Systeme sind genetische Werkzeuge zur Visualisierung und Manipulation Zelle Schicksal und Gen-Ausdruck in spezifischen Gruppen von Zellen oder Geweben in Modellorganismen weit verbreitet. Diese Systeme enthalten zwei Komponenten als separate transgene Linien. Eine Treiber-Linie drückt eine transcriptional Aktivator unter der Kontrolle der gewebespezifische Promotoren/Enhancer und ein Reporter/Effektor Linie Häfen ein Zielgen flussabwärts die Bindungsstelle des Aktivators Transkription platziert. Tiere beherbergen beide Komponenten induzieren gewebespezifischen werden von einem Ziel-Genexpression. Präzisen raumzeitlichen Expression des Gens in gezielte Geweben ist entscheidend für unvoreingenommene Auslegung der Zelle/Genaktivität. Daher ist es wichtig, ein Verfahren zur Erzeugung von exklusiven Zelle/Gewebe-spezifische Treiber Linien zu entwickeln. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, um Gewebe hochspezifische gezielte Expressionssystems erzeugen durch den Einsatz einer “gruppierten regelmäßig Interspaced kurze palindromische Repeat/CRISPR-assoziierte” (CRISPR/Cas)-Genom Bearbeitung Technik basiert. Bei dieser Methode die Endonuklease, die Cas9 durch zwei Chimären ausgerichtet ist guide RNAs (gRNA) auf bestimmte Websites im ersten kodierenden Exon eines Gens im Genom Drosophila Doppel-strangbrüchen (DSB) zu erstellen. Anschließend ermöglicht die Verwendung eine exogene Spender Plasmid mit dem transaktivator-Sequenz, die Zelle-autonome Reparatur-Mechanismus unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) des DSB, was präzise löschen und durch die transaktivator zu ersetzen das exon Sequenz. Klopfte in transaktivator äußert sich ausschließlich in den Zellen wo der Cis-regulatorische Elemente des Gens ersetzt sind funktionsfähig. Das detaillierte Schritt für Schritt Protokoll hier vorgestellten zur Erzeugung von binären transkriptionelle Fahrer ausgedrückt in Drosophila Fgf/astlosen-produzierenden epithelialen/neuronalen Zellen für jedes Gen oder gewebespezifische Ausdruck angenommen werden kann.

Introduction

Die genetische Toolbox für gezielte Genexpression wurde gut in Drosophila, so dass es eines der besten Modellsysteme, die Funktion von Genen, die in einer Vielzahl zellulärer Prozesse zu untersuchen. Binäre Expressionssysteme wie Hefe Gal4/UAS (upstream Aktivierung Sequenz), wurde zuerst angenommen, für gewebespezifischen Enhancer Trapping und gen Misexpression in Drosophila genetischen Modell1 (Abbildung 1). Dieses System erleichtert die Entwicklung einer Vielzahl von Techniken wie räumlich-zeitliche Regelung der Überexpression des Gens, Misexpression, ko in ausgewählten Gruppen von Zellen als auch in Zelle Ablation, Zelle markieren, live Verfolgung der zellulären und molekularen Prozesse im Embryo und Gewebe, Linie nachzeichnen und Mosaik Analysen während der Entwicklung. Eine Reihe von binären Transkription System, z. B. bakterielle LexA/LexAOp -System (Abbildung 1) und Neurospora Q-System, sind genetische Werkzeuge, die jetzt häufig in Drosophila, zusätzlich zu das ursprüngliche Gal4/UAS-System für gezielte Gen Ausdruck1,2,3.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode um hochzuverlässige gewebespezifischen binäre Expressionssystems zu erzeugen, durch den Einsatz einer Genom-Bearbeitung Technik. Die jüngsten Fortschritte in der CRISPR/Cas9 Genom Bearbeitung Technologie konnten nie da gewesene Möglichkeiten gerichtete Genom Änderungen in einer Vielzahl von Organismen. Im Vergleich zu den anderen verfügbaren Genom Schnitttechniken, ist das CRISPR/Cas9-System Kostengünstig, effizient und zuverlässig. Diese Technologie nutzt Komponenten des adaptiven Immunsystems bakterielle: ein Cas9 Endonuklease Streptococcus Pyogenes , die eine Doppel-Strang-Pause (DSB) erstellt und eine Chimäre Reiseführer RNA (gRNA), der die Cas9 führt zu einer bestimmten Genom-Website für gezielte DSB4. Die Zellen enthalten die Maschinen um die DSB über verschiedene Wege zu reparieren. Nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) führt zu kleinen Einfügungen oder Löschungen Genfunktion, zu stören, während unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) einen definierten gerichtet/wünschenswert genomischen Knock-in/Knock-out führt durch eine exogene HDR-Spender als Vorlage verwenden. Die HDR-basierte Strategie kann effizient genutzt werden, um eine äußerst zuverlässige gewebespezifischen binärer Ausdruck System zu erzeugen, die die Grenzen der traditionellen Enhancer-Trap-Methoden überwinden können. Wir beschreiben eine schrittweise Anleitung zur Nutzung der CRISPR/Cas9-basierte HDR Reparatur bei der Erzeugung einer binären Transkription Treiber-Linie, die unter der Kontrolle der endogenen transkriptionellen und posttranskriptionelle Verordnung von einem Drosophila ausgedrückt wird gen. In diesem Protokoll zeigen wir die Generation einer Fahrer-Linie speziell für astlosen (Bnl) Gen Kodierung eine Familie FGF-Protein, das verzweigte Morphogenese von trachealen Atemwege Epithel5regelt. In diesem Beispiel das erste kodierende Exon des Gens Bnl wurde ersetzt durch die Folge einer bakteriellen LexA transaktivator Sequenz unbeschadet einer endogenen Cis-regulatorischen Sequenzen des Bnl -Gens. Wir zeigen, dass die Strategie eine Bnl-LexA Fahrer Linie erzeugt, die raumzeitlich den Ausdruck ein Reportergen platziert hinter der LexAoperator (LexAop oder LexO) ausschließlich in Bnl steuert- mit dem Ausdruck epitheliale/Mesenchymale/neuronalen Zellen.

Protocol

1. entwerfen und konstruieren gRNA Expressionsvektor Um genau eine lange definierte Region ein Exon ersetzen, verwenden Sie eine doppelte gRNA Ansatz6, in denen jeder gRNA zwei Enden des ausgewählten Bereichs von Interesse gezielt kann. Um eine genaue Gen-spezifischen räumlich-zeitliche Ausdruck des Fahrers zu erhalten, wählen Sie zwei gRNA Ziel-Sites innerhalb der ersten kodierenden Exon des Gens. Wählen Sie für Drosophila Melanogasterdie gRNA Ziel-Sites…

Representative Results

Dieses Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, um eine gezielte binärer Ausdruck Reporter System speziell für Bnl Ausdruck Zellen5zu generieren. Der Cis-regulatorische Elementen (CREs), die komplexe raumzeitlichen Bnl Ausdruck Steuern sind nicht gekennzeichnet. Daher wurde um raumzeitlichen Ausdruck unter der Kontrolle der endogenen Bnl regulatorische Sequenz zu erreichen, nur die ersten kodierende Exon des Bnl entwick…

Discussion

Traditionell wurden Drosophila Enhancer fallen durch zwei unterschiedliche Methoden erzeugt. Eine der Möglichkeiten umfasst zufällige Einfügung eines Treibers (zB., Gal4) Sequenz des Genoms durch Umsetzung (zB., P-Element Umsetzung)1 . Alternativ können die Fahrer Sequenzen transkriptionelle einer vermeintlichen Enhancer/Promotor-Region in ein Plasmid-Konstrukt, unterstellt werden, die dann in eine ektopische Website des Genoms3,<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. F. Port, Dr. K. O’Connor-Giles und Dr. S. Feng für Diskussionen über CRISPR-Strategie; Dr. T.B. Kornberg und Bloomington Stock Center für Reagenzien; UMD bildgebenden zentrale Einrichtung; und die Finanzierung von NIH: R00HL114867 und R35GM124878, SR.

Materials

X-Gal/IPTG Gentrox (Genesee Scientific) 18-218 cloning
LB-Agar BD Difco BD 244520 cloning
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253 Molecular Biology
EDTA Sigma Aldrich E1161 Molecular Biology
NaCl Sigma Aldrich S7653 Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water ThermoFisher Scientific 10977-023 Molecular Biology
10%SDS Sigma Aldrich 71736 Molecular Biology
KOAc Fisher-Scientific P1190 Molecular Biology
EtOH Fisher-Scientific 04-355-451 Molecular Biology
GeneJET Miniprep ThermoFisher Scientific K0503 Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits ThermoFisher Scientific K210006 Maxiprep
BbsI NEB R0539S Restriction enzyme
Primers IDT-DNA PCR
pCFD4 Kornberg Lab DNA template and vector for gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) Kapa biosystems KK2601 PCR
Q5-high fidelity Taq NEB NEB #M0491 PCR
Gibson Assembly Master Mix NEB NEB #E2611 DNA assembly
pBPnlsLexA:p65Uw Addgene DNA template for LexA amplification
Proteinase K ThermoFisher Scientific 25530049 Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red) Sydlab MB067-EQ2R Molecular Biology
Gel elution kit Zymo Research (Genesee Scientific) 11-300 Molecular Biology
TRI reagent Sigma-Aldrich Molecular Biology
Direct-zol RNA purification kits Zymo Research (Genesee Scientific) 11-330 Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR Kit NEB E5315S Molecular Biology
lexO-CherryCAAX Kornberg Lab Fly line
UAS-CD8:GFP Kornberg lab Fly line
btl-Gal4 Kornberg lab Fly line
MKRS/TB6B Kornberg lab Fly line
Confocal Microscope SP5X Leica Imaging expression pattern
CO2 station Genesee Scientific 59-122WCU fly pushing
Stereo microscope Olympus SZ-61 fly pushing
Microtube homogenizing pestles Fisher-Scientific 03-421-217 genomic DNA isolation
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-1000 DNA quantification

References

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Cite This Article
Du, L., Zhou, A., Sohr, A., Roy, S. An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing. J. Vis. Exp. (139), e58268, doi:10.3791/58268 (2018).

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