En effektiv strategi til at generere væv-specifikke binære transskription systemer i Drosophila af genom-redigering
Summary
Vi præsenterer her, en metode til at generere væv-specifikke binære transskription systemer i Drosophila ved at erstatte den første kodning exon af gener med transskription drivere. CRISPR/Cas9-baseret metode placerer en transaktivatoren sekvens under den endogene regulering af et afløste gen, og derfor letter transctivator udtryk udelukkende i gen-specifikke spatiotemporelle mønstre.
Abstract
Binære transskription systemer er stærke genetiske værktøjer bruges til visualisering og manipulere celle skæbne og gen udtryk i bestemte grupper af celler eller væv i modelorganismer. Disse systemer indeholder to komponenter som separate transgene linjer. En driver linje udtrykker en transcriptional aktivator under kontrol af væv-specifikke initiativtagerne/smagsforstærkere, og en reporter-effektor linje havne et target gen placeret nedstrøms til bindingssted af transkription aktivere. Dyr husly begge komponenter fremkalde væv-specifikke transactivation for en target genekspression. Præcise spatiotemporelle udtryk af genet i målrettet væv er kritisk for objektiv fortolkning af celle-genet aktivitet. Derfor er udvikle en metode til at generere eksklusive celler/væv-specifik driver linjer afgørende. Her præsenterer vi en metode til at generere meget væv-specifikke målrettede udtryk systemet ved at ansætte en “grupperet regelmæssigt Interspaced korte palindromiske Repeat/CRISPR-forbundet” (CRISPR/Cas)-baseret genom-redigering teknik. I denne metode guide liv1975 Cas9 er målrettet to kimære RNA’er (gRNA) til bestemte websteder i den første kodning exon af et gen i Drosophila genom oprette dobbelt-strenget pauser (DSB). Efterfølgende, kan ved hjælp af en udefrakommende donor plasmid som indeholder transaktivatoren sekvens, celle-selvstændig reparation maskiner homologi-instrueret reparation (HDR) af DSB, hvilket resulterer i præcise fjernelse og udskiftning af exon med transaktivatoren sekvens. Bankede i transaktivatoren er udtrykt udelukkende i celler hvor cis-regulerende elementer af udskiftede genet er funktionelle. Detaljerede trinvise protokollen præsenteres her til at generere en binær transcriptional driver udtrykt i Drosophila fgf/forgreningsløse-producerer epitelial/neuronale celler kan vedtages for enhver gen – eller væv-specifikke udtryk.
Introduction
Den genetiske værktøjskasse til målrettede genekspression har været veludviklet i Drosophila, hvilket gør det en af de bedste model til at undersøge funktionen af gener involveret i en bred vifte af cellulære processer. Binært udtryk systemer, såsom gær Gal4/UAS (opstrøms aktivering sekvens), blev først vedtaget for væv-specifikke enhancer diffusering og gene misexpression i Drosophila genetiske model1 (figur 1). Dette system fremmet udviklingen af en lang række teknikker som spatiotemporelle regulering af genet overekspression, misexpression, knockout i udvalgte grupper af celler samt som celle ablation, celle mærkning, live sporing af cellulære og molekylære processer i embryo og væv, afstamning sporingen og mosaik analyser under udvikling. En række binære transskription system, såsom den bakterielle LexA/LexAop system (figur 1) og Neurospora Q-system, er stærke genetiske værktøjer, der er nu udbredt i Drosophila, ud over den oprindelige Gal4/UAS system for målrettede gen expression1,2,3.
Vi præsenterer her, en metode til at generere meget pålidelige væv-specifikke binære udtryk systemet ved at ansætte en genom-redigering teknik. De seneste fremskridt i CRISPR/Cas9 genom redigering teknologi har tilladt hidtil usete muligheder for at gøre styret genom ændringer i en bred vifte af organismer. I forhold til de andre tilgængelige genom redigering teknikker, er CRISPR/Cas9-systemet billig, effektiv og pålidelig. Denne teknologi anvender komponenter af den bakterielle adaptive immunsystem: en Cas9 liv1975 af Streptococcus pyogenes , der skaber en dobbelt-strenget pause (DSB) og en kimære guide-RNA (gRNA), som guider Cas9 for et websted til et bestemt genom målrettet DSB4. Cellerne indeholder maskineri for at reparere DSB ved hjælp af forskellige veje. Ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) fører til små indrykninger eller sletninger at forstyrre genfunktion, mens homologi-instrueret reparation (HDR) indfører en defineret instrueret/ønskeligt genomisk knock-i/knock-out ved hjælp af en udefrakommende HDR donor som en skabelon. Den HDR-baserede udskiftning strategi udnyttes effektivt for at generere en yderst pålidelig væv-specifikke binære udtryk system, som kan overvinde begrænsningerne af traditionel forstærker fælde metoder. Vi beskriver en trinvis fremgangsmåde for udnyttelse af CRISPR/Cas9-baserede HDR reparation til at generere en binær transskription driver linje, der kommer til udtryk under kontrol af endogene transcriptional og post-transcriptional regulering af en Drosophila gen. I denne protokol, vi vise generation af en specifik for driveren forgreningsløse (bnl) gen kodning en FGF familie protein, der regulerer forgrening morfogenese af luftrør luftvejene epitel5. I dette eksempel, den første kodning exon af bnl genet blev erstattet af rækkefølgen af en bakteriel LexA transaktivatoren sekvens uden at ændre nogen endogene cis-regulerende sekvenser af bnl genet. Vi viser, at strategien genereret en bnl-LexA driver linje, der spatiotemporally styrer udtryk af en reporter gen placeret neden for LexAoperator (LexAop eller LexO) udelukkende i bnl- at udtrykke epitelial/mesenchymale/neuronale celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Traditionelt, blev Drosophila enhancer fælder genereret af to forskellige metoder. En af måder omfatter tilfældige indsættelse af en driver (fx., Gal4) sekvens i genomet af gennemførelse (fx., P-element gennemførelse)1 . Alternativt, driver sekvenser kan placeres under transcriptional kontrol af en formodede forstærker/promotor-regionen i en plasmid konstruktion, som ville derefter integreres i en ektopisk site af genom3,<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takke Dr. F. Port, Dr. K. O’Connor-Giles og Dr. S. Feng for drøftelser om CRISPR strategi; Dr. T.B. Kornberg og Bloomington Stock Center for reagenser; UMD imaging core facilitet; og midler fra NIH: R00HL114867 og R35GM124878 til SR.
Materials
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| 10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Molecular Biology |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Molecular Biology |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Molecular Biology |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Molecular Biology |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Molecular Biology | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Molecular Biology |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Molecular Biology |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lai, S. -. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).
- Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O’Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).
- Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
- Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), 657-664 (2013).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Lin, C. -. C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).
- Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).
