En effektiv strategi för att generera vävnadsspecifika binära transkription system i Drosophila genom gen editering
Summary
Här presenterar vi en metod för att generera vävnadsspecifika binära transkription system i Drosophila genom att ersätta den första kodning exon gener med transkription drivrutiner. Metoden CRISPR/Cas9-baserade förlägger en transactivator sekvens under endogena regleringen av en ersatte gen, och följaktligen underlättar transctivator uttrycket uteslutande i gen-specifika spatiotemporal mönster.
Abstract
Binärt transkription system är kraftfulla genetiska verktyg som ofta används för att visualisera och manipulera cell öde och gen uttryck i specifika grupper av celler eller vävnader i modellorganismer. Dessa system innehåller två komponenter som separata transgena linjerna. En drivrutin linje uttrycker en transkriptionell aktivator under kontroll av vävnadsspecifika initiativtagare/smakförstärkare och en reporter/effektor linjen hamnar en målgenen placeras nedströms till bindningsstället för transkription aktivator. Djur som härbärgerat båda komponenterna inducera vävnadsspecifika transkription av en target genuttryck. Exakt spatiotemporal uttryck av genen i riktade vävnader är kritisk för förutsättningslös tolkning av cell/gen aktivitet. Därför är det viktigt att utveckla en metod för radgenerering exklusiva cell/vävnad-specifik drivrutin. Här presenterar vi en metod för att generera mycket vävnadsspecifika riktade uttryck systemet genom att anställa en ”klustrade regelbundet Interspaced kort Palindromic Repeat/CRISPR-associerade” (CRISPR/Cas)-baserat genomet redigering teknik. I denna metod guida den Amiiiiin Cas9 riktas av två chimära RNAs (gärna) till specifika platser i den första kodning exon av en gen i Drosophila genomet att skapa dubbel-strand raster (DSB). Därefter kan med en exogen givare plasmiden som innehåller sekvensen transactivator, cell-autonoma reparera maskinen homologi-regisserad reparation (HDR) av Tvistlösningsorganet, vilket resulterar i exakta borttagning och byte av exon med transactivator sekvens. De knackade-i transactivator uttrycks enbart i celler där cis-reglerande element av utbytta genen är funktionella. Detaljerade stegvisa protokollet presenteras här för att skapa en binär transkriptionell drivrutin uttryckt i Drosophila fgf/Grenlös-epitelial/neuronala celler kan antas för alla gen – eller vävnad-specifika uttryck.
Introduction
Genetiska verktygslådan för riktade genuttryck har utvecklats väl i Drosophila, gör den till en av de bästa modell att undersöka funktionen av gener involverade i en mängd olika cellulära processer. Binärt uttryck system, såsom jäst Gal4/UAS (uppströms aktiveringen sekvens), antogs först för vävnadsspecifika enhancer svällning och gene misexpression i Drosophila genetisk modell1 (figur 1). Detta system underlättat utvecklingen av ett stort antal tekniker såsom spatiotemporal reglering av genen överuttryck, misexpression, knockout i utvalda grupper av celler samt som i cell ablation, cell märkning, levande spårning av cellulära och molekylära processer i embryot och vävnader, lineage tracing och mosaik analyser under utveckling. Ett antal binära transkription systemet, såsom den bakteriella LexA/LexAop system (figur 1) och Neurospora Q-system, är kraftfulla genetiska verktyg som används nu allmänt i Drosophila, utöver det ursprungliga Gal4/UAS systemet för riktade gene expression1,2,3.
Här presenterar vi en metod för att generera mycket tillförlitlig vävnadsspecifika binärt uttryck systemet genom att anställa en editering teknik. De senaste framstegen inom CRISPR/Cas9 genomet redigering teknik gett helt nya möjligheter att göra riktade genomet ändringar i ett brett spektrum av organismer. Systemets CRISPR/Cas9 jämfört med andra tillgängliga genomet redigering tekniker, och är billig, effektiv och pålitlig. Denna teknik använder tredjeparts beståndsdelar i det bakteriella adaptiva immunsystemet: en Cas9 Amiiiiin Streptococcus pyogenes som skapar en dubbel-strand paus (DSB) och en chimär guide RNA (gärna), som vägleder Cas9 till en viss arvsmassa webbplats för riktade DSB4. Cellerna innehåller maskiner för att reparera DSB använder olika vägar. Icke-homolog slutet att gå (NHEJ) leder till små infogningar och borttagningar att störa geners funktion, medan homologi-regisserad reparation (HDR) introducerar en definierad regi/önskvärt genomisk knock-knock-utcheckning med hjälp av en exogen HDR-givare som en mall. HDR-baserat utbyte strategin kan effektivt utnyttjas för att generera en mycket tillförlitlig vävnadsspecifika binärt uttryck systemet, som kan övervinna alla begränsningar av traditionella enhancer fälla metoder. Vi beskriver ett stegvis förfarande för utnyttjande av CRISPR/Cas9-baserade HDR reparation i genererar en linje av binära transkription-drivrutin som uttrycks under kontroll av endogena transkriptionell och post-transcriptional reglering av en Drosophila gen. I detta protokoll, visar vi generationen av en drivrutin linje specifik för Grenlös (bnl) gen som kodar en SARAHS familj protein som reglerar förgrenade morfogenes av luftrör luftvägarna epitel5. I det här exemplet den första kodning exon av bnl genen ersattes av en sekvens av en bakteriell LexA transactivator sekvens utan att ändra några endogena cis-reglerande sekvenser av bnl genen. Vi visar att strategin genererat en bnl-LexA driver linje som spatiotemporally styr uttrycket av en reporter gen placeras nedströms LexAoperator (LexAop eller LexO) uteslutande i bnl- att uttrycka epitelial/mesenkymala/neuronala celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Traditionellt, genererades Drosophila enhancer fällor av två olika metoder. Ett sätt omfattar slumpmässig införande av en drivrutin (t.ex., Gal4) sekvens i genomet av införlivande (t.ex., P-elementet införlivande)1 . Alternativt kan föraren sekvenser placeras under transkriptionell kontroll av en förmodad förstärkare/arrangören region i en plasmid konstruktion, som sedan skulle integreras i en ektopisk webbplats av genomet3,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. F. Port, Dr. K. Olsson-Giles och Dr. S. Feng för diskussioner om CRISPR strategi; Dr. T.B. Kornberg och Bloomington lager Center för reagenser. UMD imaging core facilitet; och finansiering från NIH: R00HL114867 och R35GM124878 till SR.
Materials
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| 10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Molecular Biology |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Molecular Biology |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Molecular Biology |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Molecular Biology |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Molecular Biology | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Molecular Biology |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Molecular Biology |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lai, S. -. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).
- Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O’Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).
- Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
- Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), 657-664 (2013).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Lin, C. -. C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).
- Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).
