基于蛋白质的水凝胶的力钳 Rheometry
Summary
采用一种新的力钳 rheometry 技术, 研究了声线圈电机与力传感器之间的低体积蛋白质基水凝胶样品的力学性能。模拟比例积分-导数 (PID) 系统允许 “夹紧” 的力量体验到所需的协议。
Abstract
在这里, 我们描述了一种力钳 rheometry 方法来表征蛋白质基水凝胶的生物力学特性。该方法采用模拟比例积分-导数 (PID) 系统, 在圆柱蛋白基水凝胶样品上应用受控力协议, 并将其与线性音圈电机和力传感器拴在一起。在操作过程中, PID 系统调整水凝胶样品的延伸以遵循预定义的力协议, 通过最小化测量和设定点力之间的差异。这种独特的蛋白质基水凝胶方法能够使极低体积的水凝胶样品 (< 5 µL) 与不同的蛋白质浓度结合在一起。在力-匝道协议中, 当应用应力随时间线性增加和减小时, 系统能够研究与蛋白质 (un) 折叠相关的弹性和滞后行为, 以及标准弹性的测量和粘弹性参数。在恒定力的情况下, 力脉冲具有一步状形状, 由于力的变化, 弹性响应与粘弹性响应是分离的, 这是由蛋白质领域展开和复用而来的。由于其体积小, 在应用各种机械扰动时具有通用性, 因此, 采用大体积法对力钳 rheometry 进行了优化, 以研究蛋白质在受力下的力学响应。
Introduction
除了具有独特的物理特性外, 基于蛋白质的水凝胶具有革命性的力量光谱学的希望, 能够在一个 ‘ 拉力 ‘ 中测量数亿的分子, 从而使在拥挤的环境中对蛋白质进行研究,与皮肤和其他组织中遇到的类似。蛋白质领域仍然折叠在水凝胶内, 允许研究其生物力学反应的力量, 结合合作伙伴, 和化学条件。此外, 水凝胶内蛋白质领域的生物力学反应类似于单分子力谱技术所看到的反应。例如, 化学变性剂和氧化剂降低了折叠状态的稳定性, 无论是在单蛋白领域1,2,3和在宏观水平4,5,6,7. 同样, 渗透调节物质增加了单蛋白8、9的稳定性, 导致水凝胶的粘弹性反应减少, 同一力条件为7、10。
通过使用物理相互作用11、12或共价键交联4、13, 已经实施了几种合成蛋白质基水凝胶的方法。共价反应允许固定的交联位置和这些水凝胶可以恢复初始状态后的机械或化学扰动的去除。一种成功的共价交联方法依赖于用过硫酸铵 (APS) 作为氧化剂和钌 (II) 盐作为引发剂 (图 1)14, 在暴露的酪氨酸氨基酸之间形成共价键碳碳键。当接触到白光时, 浓缩蛋白质的溶液可以转化为水凝胶。通过控制反应开始时, 蛋白质 APS 组合可以注入任何铸件形式, 如聚四氟乙烯 (PFTE) 管 (图 1B和1C), 允许使用一个非常小的解决方案体积15。此外, 利用白光触发交联反应导致荧光蛋白的有限漂白, 并允许用荧光标记来配制复合水凝胶 (图 1)。其他基于蛋白质的水凝胶形成方法采用基于 SpyTag-SpyCatcher 共价相互作用的交联16、胺交联通过戊二醛13或生物素-链亲和素相互作用17。
动态力学分析 (DMA) 是目前广泛用于研究聚合物基水凝胶13,18的技术。虽然 DMA 可以将恒定的力量协议应用于生物材料, 它需要年轻的模数超过10帕, 和大样本量超过200µL19。由于这些局限性, 蛋白质水凝胶一般太软, 不能用这种方法来研究。由于工程 polyproteins 比聚合物更难合成, 因为它们需要一个活的系统来生产, 这样的高容量是低效的, 充其量是4,15。此外, 大多数生物组织的软比10帕。为生物样品开发了几种方法, 特别是研究肌肉弹性20、21。这些技术也可以在反馈作用下运行恒定力, 但为小直径 (在微米范围内) 暴露在非常短的时间 (通常少于1秒) 的样品优化。
采用改进的 rheometry 技术, 成功地研究了蛋白质基水凝胶。例如, 在环形形状中浇铸水凝胶, 可以利用伸展 rheometry 来测量有经验的力的变化, 作为扩展4,22的函数。其他研究蛋白质基水凝胶流变特性的方法是采用受控剪切应力 rheometry。这些技术也可以达到低样本量和容忍软材料。然而, 这些方法缺乏模仿导致蛋白质在体内展开的拉动力的能力, 并且根据需要各种假设和修正23的复杂理论计算杨氏模量。
我们最近报告了一种新的方法, 利用了小体积的蛋白质, 聚合管内与直径 < 1 毫米。我们的第一个实施这一技术是在长度钳模式, 其中凝胶是延长后, 预期的协议15。在这种方法中, 当域展开时, 蛋白质在扩展和力方面都经历了不断的变化, 使得数据解释变得繁琐。最近, 我们报告了一种新的力钳 rheometry 技术, 其中反馈回路可以揭露低容量的蛋白质水凝胶到预定义的力量协议7 (图 2)。模拟 PID 系统将力传感器测量的力与计算机发送的设定点进行比较, 并通过移动语音线圈来调整凝胶的扩展, 以最小化两个输入之间的差异。这种 “夹紧” 的力量现在允许新的实验, 以测量蛋白质水凝胶的生物力学。
在力-坡道模式下, 栓蛋白水凝胶的受力随时间的推移不断增加和减少。根据蛋白质和水凝胶配方的变化, 采用非线性的方法, 对任何粘弹性变形进行补偿。力坡道的主要优点是, 由于蛋白质领域的展开和复用, 它允许量化标准参数, 如杨氏模量和能量耗散。
在恒力模式下, 应用力的变化是一种类似于步进的方式。在这种模式下, 当力增加或减小时, 胶凝体扩展和收缩弹性, 其次是时变变形。这种粘弹性变形发生在凝胶经历恒定力的情况下, 与域展开/复用直接相关。在简化的方法中, 这种扩展可以被看作是相当于几个亿个单一分子的痕迹平均在一起, 并测量所有一次。恒力协议可以用来研究蛋白质水凝胶的蠕变和松弛, 作为一种力和时间的函数。作为一种力的功能, 对 BSA 为基础的蛋白质水凝胶, 我们最近表明, 有一个线性依赖性之间的弹性和粘弹性延长和反冲与应用应变7。
在这里, 我们详细介绍了一种使用由蛋白质 l (8 域24, 描述为 L8) 和蛋白质 l-eGFP 构造 (l-eGFP) 组成的复合凝胶的力钳流变仪的操作, 这使得整个水凝胶荧光和易于证明。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文描述了一种力钳 rheometry 技术来研究低体积蛋白质基水凝胶的生物力学响应。此外, 还提供了一种合成均匀柱状低体积蛋白质水凝胶样品的协议。文中还介绍了如何将不同类型的蛋白质基水凝胶与各种弹性材料结合在一起, 而不会对蛋白质基水凝胶样品或钩上的凝胶的滑移造成任何机械变形或损伤。模拟 PID 系统, 连同线性的声音线圈和力传感器, 使应用的控制力的协议, 如力坡道和恒定的力量?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们承认研究增长倡议 (101X340)、国家科学基金会、主要研究仪器项目 (批准号:) 提供的财政支持。PHY-1626450), 大密尔沃基基金会 (肖奖) 和威斯康星大学系统 (应用研究补助金)。
Materials
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
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