단백질 기반 Hydrogels 대상이 힘-클램프 Rheometry

Summary

새로운 힘-클램프 rheometry 기술은 낮은 볼륨 단백질 기반의 히드로 샘플 음성 코일 모터와 힘 센서 사이의 곁의 기계적 성질을 조사 하는 데 사용 됩니다. 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템 강제로 원하는 프로토콜을 경험된의 ‘죄’에 대 한 수 있습니다.

Abstract

여기, 우리는 단백질 기반 hydrogels의 biomechanical 속성 특성 힘-클램프 rheometry 메서드를 설명 합니다. 이 메서드는 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템을 사용 하 여 원통형 단백질 기반의 히드로 샘플, 선형 음성 코일 모터와 힘 변환기 사이 곁에 힘 제어 프로토콜을 적용. 작업 중 PID 시스템 측정 및 설정 포인트 세력 간의 차이 최소화 하 여 힘을 미리 정의 된 프로토콜에 따라 하이드로 겔 샘플의 확장을 조정 합니다. 단백질 기반 hydrogels이 독특한 접근 방식 다른 단백질 농도와 매우 낮은 볼륨 하이드로 겔 샘플 (< 5 µ L)의 밧줄 수 있습니다. 힘 램프 프로토콜, 어디 적용된 스트레스 증가 하 고 선형 시간 감소, 아래 시스템 표준 탄성의 측정 및 단백질의 폴딩 (유엔)와 관련 된 탄성과 히스테리시스 동작의 연구 활성화 및 점 탄성 매개 변수입니다. 상수-힘, 힘 펄스는 단계 같은 모양, 탄성 응답 인해 힘에 있는 변화에 아래에서 점 탄성, 전개 및 refolding 단백질 도메인에서 분리 된입니다. 낮은 볼륨 샘플 및 다양 한 기계적 섭 적용에 다양성, 힘-클램프 rheometry 대량 접근을 사용 하 여에서 단백질의 기계적 응답을 조사 하기 위해 최적화 됩니다.

Introduction

독특한 물리적 특성 떨어져, 단백질 기반 hydrogels 붐비는 환경에 있는 단백질의 연구를 활성화 한 ‘당겨’에 몇 십억 분자의 측정 함으로써 힘 분광학을 혁명의 약속을 잡으십시오 피부와 다른 조직에 있어서 그 비슷한. 단백질 도메인 유지 hydrogels, 강제로, biomechanical 반응의 연구를 수 있도록 내부 접힌 파트너 및 화학 조건 바인딩. 또한, biomechanical 응답 hydrogels 내부 단백질 도메인의 단일 분자 힘 분광학 기법으로 본 응답을 유사 합니다. 예를 들어 화학 denaturants 및 산화 제 접힌된 상태, 단일 단백질 도메인 수준^1,2,3 와 거시적인 레벨^4,5 에서 안정성을 감소 ^{, 6 , 7}. osmolytes 단일 단백질^8,9, 동일한 힘 조건^7,10대 hydrogels의 점 탄성 응답 감소로 이어지는의 안정성을 증가 하는 유사 하 게.

중 합성 단백질 기반 hydrogels 구현 되었습니다 몇 가지 방법을 사용 하 여 물리적 상호 작용^11,12 또는 공유 상호^4,13. 화학식 반응 고정된 가교 위치에 대 한 허용 하 고 이러한 hydrogels 기계적 또는 화학적 섭의 제거에 따라 초기 상태를 복구할 수 있습니다. 화학식 cross-linking를 위한 성공적인 접근 초기자 (그림 1)¹⁴는 산화 제와 루 테 늄 (II) 소금으로 암모늄 persulfate (AP)를 사용 하 여 노출 된 티로신 아미노산 사이 화학식 탄소-탄소 유대 형성에 의존 합니다. 하얀 빛에 노출 되 면 집중된 단백질의 해결책은 하이드로 겔으로 설정할 수 있습니다. 제어 하 여 반응을 시작, 단백질-APS 믹스 어떤 주조 형태, 투입 될 수 있는 때 소계 (PFTE) 등 튜브 (그림 1B 및 1 C), 수 있도록 매우 작은 솔루션 볼륨¹⁵를 사용 하 여. 또한, 가교 반응을 방 아 쇠를 흰색 빛으로의 사용 제한 표백 형광 단백질의 결과 하며 복합 hydrogels의 정립 형광 마커 (그림 1) 다른 단백질 기반 하이드로 겔 형성 방법 SpyTag SpyCatcher 공유 상호 작용¹⁶, 아민 가교 를 통해 도¹³또는 biotin streptavidin 상호 작용¹⁷에 따라 교차 연결을 사용 합니다.

동적 기계적인 분석 (DMA)는 현재 광범위 하 게 폴리머 기반 hydrogels^13,18를 공부 하는 기술입니다. DMA 생체 재료에 일정 힘 프로토콜을 적용할 수 있습니다, 하는 동안 10 kPa, 및 이상의 200 µ L¹⁹의 큰 샘플 볼륨 영의 계수를 요구 한다. 이러한 제한으로 인해 단백질 hydrogels는 일반적으로이 기술에 의해 조사를 너무 부드러운. 설계 된 polyproteins 때문에 살아있는 시스템 생산에 필요한 고분자, 보다 합성 하 더로 같은 높은 볼륨 효율적, 최고의^4,15되지 않습니다. 또한, 대부분의 생물 학적 조직 10 kPa 보다 부드럽고 있다. 몇 가지 방법은 생물 학적 샘플, 근육 탄력^20,21연구에서 특히 개발 되었다. 이러한 기술은 또한 지속적인 힘을 피드백에서 동작할 수 있습니다 하지만 아주 짧은 시간 동안 강제로 노출 (미크론 범위)에서 작은 직경을 가진 샘플에 대 한 최적화 (일반적으로 1 s).

단백질 기반 hydrogels 수정된 rheometry 기술로 성공적으로 공부 했다. 예를 들어 반지 모양에는 히드로 주조 확장^4,22의 기능으로 경험 있는 힘에 있는 변화를 측정 하기 위해 extensional rheometry 사용 하 여 수 있습니다. 단백질 기반 hydrogels의 유 변 학적 특성을 공부에 대 한 다른 접근 제어 전단 응력 rheometry를 사용 합니다. 이 기술은 또한 낮은 샘플 볼륨을 달성 하 고 부드러운 소재를 용납 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 부족을 당기기 모방 능력 그 원인 단백질 펼쳐진 vivo에서, 고 탄성 계수 다양 한 가정 및²³필요로 하는 복잡 한 이론에 따라 계산 됩니다.

우리는 최근 단백질, 직경 튜브 내부 생산의 작은 볼륨을 이용 하는 새로운 접근 방식을 보고 < 1 m m. 이 기술은의 우리의 첫 번째 구현 젤 원하는 프로토콜¹⁵다음 확장 했다 길이 클램프 모드에서 운영 했다. 이 방법에서는, 단백질 경험 확장에 힘 연속 변경 도메인 전개 하는 동안 데이터 해석 복잡 하. 최근에, 우리는 새로운 힘-클램프 rheometry 기술, 피드백 루프는 사전 정의 된 힘 프로토콜⁷ (그림 2) 낮은 볼륨 단백질 hydrogels을 노출할 수 있습니다 보고 있다. 아날로그 PID 시스템 컴퓨터에서 보낸 세트 포인트와 힘 센서에 의해 측정 하는 힘을 비교 하 고 두 입력 간의 차이 최소화 하기 위해 음성 코일을 이동 하 여 젤 확장을 조정 합니다. 힘의이 ‘죄’ 지금 허용 한다 실험의 새로운 유형에 대 한 단백질 hydrogels의 역학을 측정 하기 위하여.

힘-램프 모드에서 속박 되 단백질 히드로 지속적인 증가 시간 강제의 감소를 경험 한다. PID는 단백질 및 하이드로 겔 제제의 종류에 따라 비-선형 방법에 있는 확장명을 변경 하 여 점 탄성 변형에 대 한 보상. 힘 램프의 주요 장점은 그것은 영의 계수는 전개 및 refolding 단백질 도메인의 에너지 소비 등의 표준 매개 변수의 정량화를 허용 한다.

상수-포스 모드에서 적용 된 힘 단계 처럼에서 변경 됩니다. 이 모드에서 젤 확장 계약 탄력적 때 힘 증가 또는 감소, 각각, 시간에 따른 변형에 의해 따라. 이 점 탄성 변형, 젤 지속적인 힘을 경험 하는 동안 일어나는 도메인 전개 refolding와 직접 관련 됩니다. 단순화 된 방법으로,이 확장 몇 십억 단일 분자 추적 함께 평균 하 고 한 번에 측정의 동급으로 볼 수 있습니다. 상수-포스 프로토콜 크 리프 힘 및 시간의 기능으로 단백질 hydrogels의 휴식을 공부 하 고 사용할 수 있습니다. BSA-기반 단백질 hydrogels 위한 힘의 기능으로 우리 최근 나타났습니다 탄성 및 점 탄성 확장 및 적용 된 스트레인⁷반동 사이 선형 종속성입니다.

여기 우리 힘 클램프 고분자 형광 고 쉽게 전반적인 하이드로 겔을 만드는 단백질 L의 혼합물 (8 도메인²⁴, L₈로 묘사) 및 단백질 L eGFP 구문 (L-eGFP)에서 만든 복합 젤을 사용 하 여 작업 세부 사항 보여 줍니다.

Protocol

1. 시 약 솔루션 준비 [20 m m tris (hydroxymethyl) aminomethane 및 150 mM NaCl, pH 7.4] Tris 버퍼를 사용 하 여 원하는 농도에 관심사의 단백질을 용 해/diluting 하 여 시작 단백질 솔루션을 준비 합니다.참고: hydrogels로는 상호 연결에 대 한 작은 단백질 농도 단백질 사용에 따라 달라 집니다 및 일반적으로 > 1 m m 이다. Tris(bipyridine)ruthenium(II) 염화 암모늄 persulfate (APS) (1 M)의 주식을 준비 ([Ru(bpy)3<…

Representative Results

그림 1A 는 L-£/ L8 하이드로 겔을 합성 하는 데 사용 하는 광 반응의 체계를 보여 줍니다. 그림 1B 는 photoactivation 전후 PTFE 튜브 히드로 혼합물을 보여줍니다. 그림 1C 트리 스 솔루션 내부 돌출된 L eGFP L8 하이드로 겔을 선물 한다. 하이드로 겔 샘플 노치 등 없는 구조적 결함이 있다. 명확 하 ?…

Discussion

여기, 우리는 낮은 볼륨 단백질 기반 hydrogels의 biomechanical 응답을 조사 하는 힘-클램프 rheometry 기법을 설명 합니다. 또한, 균일 한 원통형 낮은 볼륨 단백질 하이드로 겔 샘플을 합성 하는 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜도는 걸이에 어떤 기계적 변형 또는 단백질 기반 하이드로 겔 샘플 또는 젤의 미끄럼에 손상을 유발 하지 않고 다른 유형의 다양 한 신축성으로 단백질 기반 hydrogels 넥타이 하는 ?…

Materials

SI-KG4A force transducer	World Precision Instruments (WPI)	SI-KG4A
Linear Voice Coil Motor	Equipement Solutions	LFA2010
Bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)	BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	248614-100G
Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride	Sigma-Aldrich	544981-1G
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK	Fisher Scientific	NC0395626
1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip	BD	309628
Silane, Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll	Cole-Parmer	EW-06417-21
Hypodermic Needle, 23 Gauge	Healthcare Supply Pros	305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge	KIMCO	JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp	ALB	USH-103D USHIO
Medical Tweezers
Medical scissors
Olympus
The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.