Reometria forza-morsetto per la caratterizzazione di idrogel a base di proteine
Summary
Una nuova tecnica di reometria forza-morsetto è utilizzata per studiare le proprietà meccaniche di campioni di idrogel a base di proteine a basso volume legati tra un motore bobina di voce e un sensore di forza. Un sistema (PID) di proporzionale-integrale-derivato analogico consente il bloccaggio della forza con esperienza per il protocollo desiderato.
Abstract
Qui, descriviamo un metodo di reometria forza-morsetto per caratterizzare le proprietà biomeccaniche di idrogel a base di proteine. Questo metodo utilizza un sistema di (PID) proporzionale-integrale-derivato analogico di applicare protocolli di forza controllata su campioni cilindrici idrogel a base di proteine, che sono legati tra un motore lineare voice-coil e un trasduttore di forza. Durante il funzionamento, il sistema PID regola l’estensione del campione idrogel di seguire un protocollo di forza predefinita riducendo al minimo la differenza tra le forze misurate e set-point. Questo approccio unico a idrogel a base di proteine consente il tethering di idrogel estremamente basso volume campioni (< 5 µ l) con concentrazioni differenti della proteina. In protocolli di forza-rampa, dove la sollecitazione applicata aumenta e diminuisce in modo lineare con il tempo, il sistema consente lo studio dei comportamenti elasticità e isteresi connesso con la piegatura (ONU) di proteine e la misura dell'elastico standard e parametri viscoelastici. Sotto costante-forza, dove l'impulso di forza ha una forma a gradini, la risposta elastica, dovuto al cambio in vigore, è disaccoppiato dalla risposta viscoelastico, che deriva dal dominio della proteina dispiegamento e ripiegamento. Grazie al basso volume campione e versatilità nell'applicazione varie perturbazioni meccaniche, forza-morsetto reometria è ottimizzato per studiare la risposta meccanica delle proteine sotto forza utilizzando un approccio di massa.
Introduction
Oltre ad avere proprietà fisiche uniche, idrogel a base di proteine con la promessa di rivoluzionare la spettroscopia della forza, consentendo la misurazione di diverse miliardi molecole in una ‘tirare’, consentendo in tal modo lo studio delle proteine in ambienti affollati, simili a quelle incontrate in pelle ed altri tessuti. Domini proteici rimangano piegati all’interno di idrogeli, permettendo lo studio della loro risposta biomeccanica a forza, associazione partner e condizioni chimiche. Inoltre, la risposta biomeccanica di domini proteici all’interno di idrogeli è simile la risposta vista con tecniche di spettroscopia di forza di singola molecola. Ad esempio, denaturanti chimici e agenti ossidanti diminuiscono la stabilità dello stato piegato, a livello macroscopico4,5 sia la singola proteina dominio livello1,2,3 , 6 , 7. allo stesso modo, osmoliti aumentano la stabilità di singole proteine8,9, che conduce ad una diminuzione nella risposta viscoelastico di idrogeli, per la stessa forza condizioni7,10.
Diversi approcci sono stati implementati per sintetizzare idrogel a base di proteine, mediante utilizzo di interazioni fisiche11,12 o a4,cross-linking covalente13. Covalente reazioni permettono per postazioni fisse di cross-linking e questi idrogeli possono ripristinare lo stato iniziale su una rimozione delle perturbazioni meccaniche o chimiche. Un approccio di successo per cross-linking covalente si basa sulla formazione di legami covalenti carbonio-carbonio tra gli aminoacidi tirosina esposti utilizzando ammonio persolfato (APS) come un ossidante e un sale di rutenio (II) come un iniziatore (Figura 1)14. Sull’esposizione a luce bianca, una soluzione di proteine concentrate può essere trasformata in un idrogel. Controllando quando la reazione si avvia, il mix di proteine-APS può essere iniettata in qualsiasi forma di colata, come il politetrafluoroetilene (PTFE) tubi (Figura 1B e 1C), consentendo l’utilizzo di una soluzione estremamente piccolo volume15. Inoltre, l’uso della luce bianca per innescare la reazione di reticolazione si traduce in una decolorazione limitato di proteine fluorescenti e permette la formulazione di idrogeli compositi con marcatori fluorescenti (Figura 1). Altri metodi di formazione di idrogel a base di proteine utilizzano cross-linking basato sul SpyTag-SpyCatcher interazione covalente16, ammina reticolazione tramite glutaraldeide13o biotina-streptavidina interazioni17.
Analisi dinamico-meccanica (DMA) è attualmente una tecnica ampiamente utilizzata per studiare gli idrogel a base di polimeri13,18. Mentre DMA possa applicare protocolli di forza costante a biomateriali, richiede moduli di Young sopra 10 kPa e campioni di grandi volumi di più di 200 µ l19. A causa di queste limitazioni, proteina idrogeli sono generalmente troppo morbidi per essere studiati da questa tecnica. Come derivati dal poliproteine sono più difficili da sintetizzare di polimeri, in quanto richiedono un sistema vivente per produrre, tali volumi elevati sono inefficienti, alle migliori4,15. Inoltre, la maggior parte dei tessuti biologica sono più morbida di 10 kPa. Diversi approcci sono stati sviluppati per campioni biologici, soprattutto nello studio dell’elasticità muscolare20,21. Queste tecniche funzionano anche sotto feedback per applicare la forza costante ma sono ottimizzate per campioni di piccolo diametro (nella gamma micron) esposti per forzare per tempi molto brevi (in genere meno di 1 s).
Idrogel a base di proteine con successo sono stati studiati con tecniche modificate reometria. Ad esempio, l’idrogel di colata a forma di anello consente l’utilizzo di reometria estensionale per misurare il cambiamento nella forza di esperti come una funzione di estensione4,22. Altri approcci per studiare le proprietà reologiche di idrogel a base di proteine utilizzano sollecitazione di taglio controllata reometria. Queste tecniche possono anche raggiungere campione basso volume e tollerare materiali morbidi. Tuttavia, questi metodi mancanza la capacità di imitare il tirando le forze che causa proteina dispiegarsi in vivo, e modulo di Young viene calcolato sulla base delle teorie complesse che richiedono varie ipotesi e correzioni23.
Recentemente abbiamo segnalato un nuovo approccio che utilizza una piccola quantità di proteine, polimerizzato all’interno di tubi con diametri < 1 mm. Nostra prima implementazione di questa tecnica era operativo in modalità di lunghezza-morsetto, dove il gel è stato esteso in seguito il protocollo desiderato15. In questo metodo, le proteine sperimentare un cambiamento continuo in vigore ed estensione mentre i domini si dispiegano, rendendo complicato l’interpretazione dei dati. Recentemente, abbiamo segnalato una nuova tecnica di reometria forza-morsetto, dove un ciclo di feedback può esporre idrogeli di proteine a basso volume ad una forza predefinita protocollo7 (Figura 2). Un sistema analogico di PID confronta la forza misurata dal sensore di forza con il set point inviati dal computer e regola l’estensione gel spostando la bobina per ridurre al minimo la differenza tra i due ingressi. Questo bloccaggio della forza consente ora di nuovi tipi di esperimenti per misurare la biomeccanica di idrogeli di proteina.
In modalità di forza-rampa, un idrogel di proteina tethered sperimenta un costante aumento e la diminuzione della forza con il tempo. Il PID compensa eventuali deformazioni viscoelastiche cambiando l’estensione in modo non lineare, a seconda del tipo di formulazione della proteina e idrogel. Il vantaggio principale della rampa di forza è che permette la quantificazione dei parametri standard, come modulo di Young e dissipazione di energia, a causa di un dispiegamento e ripiegamento di domini proteici.
In modalità a forza costante, la forza applicata cambia in una passaggio-come la moda. In questa modalità, il gel si estende e contratti elasticamente quando la forza è aumentata o diminuita, rispettivamente, seguita da una deformazione dipendente dal tempo. Questa deformazione viscoelastica, che si svolgono mentre il gel sperimenta una forza costante, è direttamente correlata al dominio dispiegarsi/ripiegamento. In modo semplificato, questa estensione può essere visto come l’equivalente di numerose tracce di singola molecola miliardi in media insieme e misurato tutto in una volta. Forza costante protocolli utilizzabili per studiare lo scorrimento e il relax di idrogeli di proteine in funzione della forza e tempo. In funzione della forza, per proteina basata su BSA idrogeli, noi abbiamo recentemente dimostrato che esiste una relazione lineare tra l’elastico e viscoelastico estensione e ritrazione con la sforzo applicato7.
Qui abbiamo dettagliatamente il funzionamento di un reometro di forza-morsetto utilizzando gel composito composto da una miscela di proteine L (8 domini24, raffigurato come L8) e un costrutto di proteina L-eGFP (L-eGFP), che rende l’idrogel complessiva fluorescente e facile da dimostrare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo una tecnica di reometria forza-morsetto per studiare la risposta biomeccanica di idrogeli di base di proteine di basso volume. Inoltre, è disponibile un protocollo di sintetizzare un campione di idrogel di proteina di basso volume cilindrico uniforme. Un protocollo è anche presentato che descrive come legare diversi tipi di idrogel a base di proteine con varie elasticità senza causare qualsiasi deformazione meccanica o danni ai campioni di idrogel a base di proteine o slittamento del gel sui ganci. Il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il sostegno finanziario dall’iniziativa di crescita di ricerca (premio No. 101 X 340), National Science Foundation, programma per la strumentazione di ricerca principali (Grant No. PHY-1626450), Greater Milwaukee Foundation (Premio Shaw) e sistema di Università del Wisconsin (Grant di ricerca applicata).
Materials
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
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