Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

المشبك قوة رهيوميتري لوصف الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين

Published: August 21, 2018 doi: 10.3791/58280
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physics, University of Wisconsin-Milwaukee

Summary

يتم استخدام تقنية رهيوميتري المشبك قوة جديدة للتحقيق في الخواص الميكانيكية لعينات صغيرة الحجم على أساس البروتين المائية المربوطة بين لفائف صوت محرك، وجهاز استشعار قوة. نظام (PID) نسبي-متكاملة-مشتقات تناظرية يسمح 'لقط' قوة ذوي الخبرة إلى البروتوكول المطلوب.

Abstract

هنا، يمكننا وصف أسلوب رهيوميتري قوة-المشبك لتوصيف خصائص النشاط الحيوي القائم على البروتين الهلاميات المائية. هذا الأسلوب يستخدم نظام (PID) نسبي-متكاملة-مشتقات تناظرية إلى تطبيق بروتوكولات القوة التي تسيطر على عينات أسطوانية المائية المستندة إلى البروتين، التي هي المربوطة بين السيارات لفائف صوت خطي ومحول قوة. خلال العملية، يضبط النظام PID تمديد العينة المائية لمتابعة بروتوكول قوة المعرفة مسبقاً بتقليل الفرق بين قوي محسوبة وتعيين نقطة. هذا النهج الفريد القائم على البروتين الهلاميات المائية يتيح الربط العينات المائية الحجم المنخفض جداً (< 5 ميليلتر) بتركيزات مختلفة من البروتين. تحت بروتوكولات منحنى القوة، حيث أن الإجهاد تطبق الزيادة والنقصان خطيا مع مرور الوقت، تمكن النظام الدراسة من مرونة والتباطؤ السلوكيات المرتبطة بالطي (الأمم المتحدة) من البروتينات، وقياس مرونة القياسية و معلمات لزج مطاطي. إطار ثابت-القوة، حيث نبض القوة قد شكل خطوة تشبه، الاستجابة المرنة، ويرجع إلى التغير في القوة، هو decoupled من الاستجابة لزج مطاطي، الذي يأتي من المجال البروتين تتكشف وريفولدينج. نظراً لانخفاض حجم العينة وبراعة في تطبيق مختلف الاضطرابات الميكانيكية، رهيوميتري القوة-المشبك هو الأمثل للتحقيق في الاستجابة الميكانيكية من البروتينات تحت القوة باستخدام نهج مجمع.

Introduction

وبصرف النظر عن وجود الخصائص الفيزيائية الفريدة، القائم على البروتين الهلاميات المائية تبشر ثورة قوة التحليل الطيفي بتمكين قياس العديد من الجزيئات مليار في أحد 'سحب'، مما مكن دراسة البروتينات في البيئات المزدحمة، مماثلة لتلك التي ووجهت في الجلد والأنسجة الأخرى. نطاقات البروتين تظل مطوية داخل الهلاميات المائية، مما يتيح دراسة استجابتها النشاط الحيوي للقوة، والشركاء، والكيميائية الشروط الملزمة. بالإضافة إلى ذلك، يشبه الاستجابة النشاط الحيوي للبروتين المجالات داخل الهلاميات المائية استجابة ينظر مع تقنيات التحليل الطيفي قوة جزيء واحد. على سبيل المثال، ديناتورانتس الكيميائية والعوامل المؤكسدة نقصان استقرار الدولة مطوية، سواء في البروتين وحيد المجال المستوى1،،من23 والعيانية المستوى4،5 , 6 , 7-وبالمثل، أوسموليتيس زيادة استقرار البروتينات وحيدة8،9، مما يؤدي إلى انخفاض في استجابة لزج مطاطي الهلاميات المائية، لنفس قوة الظروف7،10.

ونفذت عدة نهج توليف القائم على البروتين الهلاميات المائية، أما عن طريق استخدام التفاعلات الفيزيائية11،12 أو التساهمية العابرة للربط4،13. التساهمية ردود فعل السماح لمواقع ثابتة العابرة للربط ويمكن استرداد هذه الهلاميات المائية الحالة الأولية عند إزالة الاضطرابات الميكانيكية أو الكيميائية. وتعتمد نهجاً ناجحاً العابرة للربط التساهمي على تشكيل روابط الكربون-كربون التساهمية بين الأحماض الأمينية تيروزين المكشوفة باستخدام فوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) كعنصر مؤكسد وملح الروثينيوم (II) كبادئ (الشكل 1)14. عند التعرض للضوء الأبيض، حلاً بروتينات المركزة يمكن تحويله المائية. عن طريق التحكم عندما يمكن حقنها يبدأ رد الفعل، مزيج البروتين-وكالة الأنباء الجزائرية في أي شكل من أشكال صب، مثل تترافلوروايثيلين (بفتي) أنابيب (الشكل 1 باء و جيم 1)، يسمح باستخدام حجم صغير للغاية حل15. وعلاوة على ذلك، استخدام الضوء الأبيض لإحداث رد فعل cross-linking يؤدي إلى ابيضاض محدودة من البروتينات الفلورية، ويسمح بوضع مركب الهلاميات المائية مع علامات نيون (الشكل 1). استخدام أساليب تشكيل القائم على البروتين المائية الأخرى العابرة للربط على أساس والغارديان سبيتاج التفاعل التساهمية16، أمين العابرة للربط عن طريق glutaraldehyde13، أو البيوتين-streptavidin التفاعلات17.

تحليل الميكانيكية الحيوية (DMA) حاليا تقنية تستخدم على نطاق واسع لدراسة الهلاميات المائية المستندة إلى البوليمر13،18. بينما DMA يمكن تطبيق بروتوكولات النفاذ المستمر إلى الحيوية، فإنه يتطلب بواقي للشباب أكثر من 10 من الجيش الشعبي الكوري، وحجم عينة كبيرة من أكثر من 200 ميليلتر19. بسبب هذه القيود، الهلاميات المائية البروتين عادة ما تكون لينة جداً التحقيق في هذا الأسلوب. كما بوليبروتينس المهندسة يصعب توليفها من البوليمرات، نظراً لأنها تتطلب نظام معيشة لإنتاج، مثل كميات كبيرة غير فعالة، في أفضل4،15. وعلاوة على ذلك، معظم الأنسجة البيولوجية أكثر ليونة من 10 كيلو باسكال. ووضعت عدة نهج للعينات البيولوجية، لا سيما في دراسة العضلات مرونة20،21. هذه التقنيات يمكن أن تعمل أيضا تحت التغذية المرتدة لتطبيق القوة ثابتة بل هي الأمثل للعينات مع أقطار صغيرة (في نطاق ميكرون) يتعرض لقوة لأوقات قصيرة جداً (عادة أقل من 1 ثانية).

ودرست الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين بنجاح مع تقنيات رهيوميتري المعدلة. على سبيل المثال، صب في المائية في شكل الدائري يسمح باستخدام رهيوميتري اكستينسيونال لقياس التغير في القوة ذوي الخبرة كدالة لملحق4،22. استخدم نهج أخرى لدراسة خصائص انسيابية الهلاميات المائية على أساس البروتين رهيوميتري إجهاد القص التي تسيطر عليها. هذه التقنيات يمكن أيضا تحقيق حجم العينة منخفضا وتتسامح مع المواد اللينة. بيد أن هذه الأساليب عدم القدرة على تقليد سحب القوات هذا السبب البروتين التي تتكشف في فيفوويحسب معامل يونغ استناداً إلى النظريات المعقدة التي تتطلب مختلف الافتراضات والتصويبات23.

ونحن قد أبلغت مؤخرا بنهج جديد يستخدم كمية صغيرة من البروتينات، بلمرة داخل أنابيب ذات أقطار < 1 مم. كانت تعمل لدينا أول تنفيذ هذا الأسلوب في وضع المشبك الطول، حيث تم تمديد الجل بعد البروتوكول المطلوب15. في هذا الأسلوب، البروتينات تجربة تغيير مستمر في الإرشاد والقوة حين تتكشف المجالات، مما يجعل تفسير البيانات مرهقة. مؤخرا، وقد أبلغنا تقنية رهيوميتري المشبك قوة جديدة، حيث يمكن أن يعرض حلقة مفرغة الهلاميات المائية البروتين منخفضة الحجم إلى قوة المعرفة مسبقاً بروتوكول7 (الشكل 2). نظام PID تناظرية يقارن القوة تقاس باستشعار القوة مع تعيين نقطة المرسلة من الكمبيوتر ويضبط الملحق هلام بتحريك الملف الصوتي لتقليل الفرق بين اثنين من المدخلات. هذا 'لقط' القوة يسمح الآن لأنواع جديدة من تجارب لقياس الميكانيكا الحيوية من البروتين الهلاميات المائية.

في وضع قوة المنحدر، والتجارب المائية بروتين المربوطة الزيادة المستمرة، وانخفاض القوة مع مرور الوقت. معرف المنتج يعوض عن أي تشوه لزج مطاطي بتغيير الملحق بطريقة غير خطية، اعتماداً على النوع من البروتين والمائية صياغة. والميزة الرئيسية لمنحنى القوة أنه يسمح للتحديد الكمي لمعلمات قياسية، مثل معامل يونغ وتبديد الطاقة، نظراً تتكشف وريفولدينج نطاقات البروتين.

في وضع ثابت-القوة، التغييرات تطبق القوة بطريقة شبيهة بالخطوة. في هذا الوضع، يمتد الجل وعقود الاستيكالي عندما تزيد القوة أو انخفضت، على التوالي، تليها تشوه تعتمد على الوقت. هذا التشوه لزج مطاطي، تجري بينما الجل تجارب قوة ثابتة، ارتباطاً مباشرا بالمجال تتكشف/ريفولدينج. بطريقة مبسطة، يمكن اعتبار هذا التمديد ما يعادل عدة آثار مليار جزيء واحد متوسط معا وقياسها في كل مرة. يمكن استخدام بروتوكولات ثابت-القوة لدراسة زحف والاسترخاء من البروتين الهلاميات المائية كدالة للزمن وقوة. كدالة للقوة، لجيش صرب البوسنة على أساس البروتين الهلاميات المائية، وقد أظهرنا مؤخرا أن هناك تبعية خطي بين التمديد مطاطا ولزج مطاطي والارتداد مع سلالة التطبيقية7.

هنا نحن بالتفصيل عملية رهيوميتير القوة-المشبك استخدام المواد الهلامية المركبة المصنوعة من خليط بروتين L (المجالات 824، وصفت ل8) وبنية بروتين L-اجفب (L-اجفب)، مما يجعل المائية الإجمالية الفلورسنت وسهلة إظهار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-الكواشف إعداد الحل

  1. إعداد حل بروتين بدءاً بتذويب إضعاف بروتين اهتمام لتركيز المطلوب، باستخدام مخزن مؤقت تريس] أمينوميثاني تريس (هيدروكسيميثيل) 20 مم و 150 مم كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 7.4.
    ملاحظة: تركيز البروتين أصغر مما يؤدي كروسلينكينج إلى الهلاميات المائية يعتمد على البروتين المستخدمة وهو عادة > 1 مم.
  2. إعداد مخزون من فوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) (1 م) وكلوريد tris(bipyridine)ruthenium(II) ([Ru(bpy)]3[2 +) الحلول (6.67 ملم) بتذويب APS و [Ru(bpy)3]2 + مساحيق في المخزن المؤقت تريس.

2-القائم على البروتين التوليف المائية

  1. إصلاح إبرة ز 23 على حقنه 1 مل مع الضغط على المكبس.
  2. قطع أنبوب تترافلوروايثيلين (PTFE) 10 سم (مع قطر داخلي من 0.022 في وقطر خارجي ل 0.044 في) باستخدام شفرة حلاقة. إرفاق الإبر والمحاقن لواحدة من نهاية الأنبوب PTFE.
  3. إدراج نهاية الأنبوب الثاني إلى حل سيلاني وملء الأنبوب بسحب المكبس المحاقن. اترك الأنبوب ل ~ 30 دقيقة.
  4. إزالة الحل سيلاني والجاف للأنبوب بالهواء المضغوط.
    ملاحظة: تأكد من أن كل حل سيلاني هو المجففة وأن يترك لا بقايا في الأنبوب.
  5. مزيج بروتين الحل مع وكالة الأنباء الجزائرية و [رو (ببي) 3]2 + في أنبوب 1.5 مل باستخدام نسبة حجم ثابت [مثلاً، 15:1:1 أو 15:0.5:0.5 (الخامس: الخامس: الخامس)].
  6. دوامة الحل فوتواكتيفي حتى يخلط تماما.
  7. الطرد المركزي في مزيج بأقصى سرعة ممكنة (مثلاً، 14,000 س ز) لإزالة أي فقاعات من الحل.
  8. إدراج نهاية فتح الأنبوب PTFE المعالجة في الخليط فوتواكتيفي ورسم الحل في الأنبوب بسحب المكبس المحاقن.
  9. ضع الأنبوب تحميل ~ 10 سم بعيداً عن 100 W مصباح الزئبق لمنع التدفئة عليه ويبقيه هناك لمدة تصل إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1B).
    ملاحظة: في بعض الحالات، يمكن أن يكون زمن التعرض للضوء منخفضة كما تستخدم س. 30 جيليشن أقصر هنا للهلام الفلورسنت، للحد من فوتوبليتشينج.
  10. إزالة الأنبوب من الإبرة وقطع حواف الأنبوب قرب نهايات المائية مع شفرة حلاقة.
  11. استخدام إبرة ز 24 يتثلم لقذف المائية إلى الحل تريس (الشكل 1).
    ملاحظة: يتم استخدام الإبر يتثلم تجنب أي من الشقوق أو الضرر الذي يلحق بالعينة المائية.
  12. فحص المواد الهلامية لأي عيوب قد تشكل خلال قذف أو بسبب فقاعات وتجاهل المواد الهلامية بعيوب بصريا.

3-المرفق القائم على البروتين المائية والقوة-المشبك رهيوميتير الإعداد

  1. بدء تشغيل البرنامج أداة التحكم. قم بتشغيل المحرك الصوت اللولب. تعيين موضع اللولب بقيمة نحو نهاية النطاق (مثلاً، 7.5 مم).
    ملاحظة: موضع الملف الصوتي يوصي بأن تكون نهاية نطاق الحركة الحد الأقصى، إلى أقصى حد ممكن في إمكانية تمديد المائية.
  2. يزيح هوكس في z-الاتجاه ومواءمتها في منعطف في العاشر--الاتجاه (والذي هو تنسيق سحب؛ انظر الشكل 2). تسجيل قيم مسامير ميكرومتر ل العاشر--الاتجاه.
  3. قطع خيوط عقيمة 2 إلى خيوط متساوية الطول (2-3 سم؛ انظر الشكل 3 ألف وباء).
  4. قرانهما فضفاضة مزدوجة تراكم في كل من الفروع وأسجل الحلقات 2 هوك متصلاً بجهاز استشعار القوة (الشكل 3 و 3D).
  5. ملء قاعة تجريبية مع تريس المخزن المؤقت ونقل العينات المائية في قاعة مليئة باستخدام الملقط الطبي.
  6. ضع الملف الصوتي وقوة هوكس استشعار قريبة من السطح الحل ومحاذاة هوكس في جميع الاتجاهات باستخدام x/y/z-تحديد المواقع المتلاعبين.
  7. استخدام الملقط الطبي، تعليق كلا الجانبين من العينة المائية البروتين في خطافات متصلة بالصوت لفائف وقوة الاستشعار (الشكل 3).
  8. تشديد 1 خياطة حلقة حول العينة المائية على ربط الملف الصوتي بعقد كل من طرفي الحلقة خياطة مع ملاقط طبية وسحبهم في وقت واحد (3D الشكل).
  9. كرر الخطوة 3، 8 للحلقة متصلة باستشعار القوة (3D الشكل).
    ملاحظة: تجنب تشديد المتطرفة من خيوط لمنع أي أضرار هيكلية وقطع مستعرضة من العينة المائية.
  10. تشديد الحلقات خياطة على الانحناءات لكل ربط للحيلولة دون أي تأخير؛ استخدام هذه الانحناءات كمرجع يشير إلى العثور على فصل الصفر بين هوكس في الخطوة 3، 2. قص الزائد أطوال خياطة الجروح باستخدام مقص الطبية (3D الشكل).
  11. نقل المائية المرفقة باستخدام z-المتلاعبين على طول z-محور نحو قاعة التجريبية أن تزج المائية في حل تجريبي.
  12. قم بمحاذاة العينة المائية في y-z استخدام المتلاعبين أن الجل لا يخضع لأي ضغوط.
  13. صفر استشعار القوة وفصل الخطافات اثنين باستخدام علامة x-ميكرومتر المراحل حتى يبدأ الهلام لتجربة قوة. وعندما يحدث هذا، قليلاً العودة إلى الوراء المسمار ميكرومتر في العاشر--الاتجاه.
  14. تسجيل موقف كل المتلاعبين للمحرك الملف الصوتي وأجهزة الاستشعار واستخدام الفرق بين هذه القيم وتلك التي تقاس في الخطوة 3، 2 لحساب الفصل الدقيق بين هوكس الربط في بداية التجربة.
  15. تعيين نطاق للمنحنى الركود إلى ~1.5-2 ملم وقياس فترة السماح هلام (الشكل 4 أ).
    ملاحظة: لكل قياس فترة السماح، محاولة لإبقاء بدء نظام سماح قرب الموقف لفائف صوت الأولية، مما يسمح لعدد أمثل من نقاط البيانات لتناسب النظم 2 (الشكل 4 أ). ويمكن تحديد طول هلام مع دقة ميكرون الفصل بين خطاف والتقاطع بين النظم 2 في فترة السماح باستخدام منحنى (انظر أيضا خطوة 5.1). قد ينجرف استشعار القوة مع الوقت بسبب الاختلافات في ظروف تجريبية، الجزء من المنحنى الركود التي لا يكون فيها الجل تحت قوة تقارير بشأن هذا الانحراف ممكن. برنامج التحكم في الصك يعوض تلقائياً لهذا الاختلاف عند إرسال الأمر تعيين نقطة إلى حلقة PID (4A الرقم الداخلي).

4-البروتين على أساس "توصيف المائية" استخدام "الخاضعة لسيطرة" القوة-المنحدر وقياسات ثابتة-القوة

  1. تجارب القوة-منحدر
    1. لأداء دورة منحنى قوة بزيادة القوة بمعدل التحميل المطلوبة (مثلاً، 0.01 mN/s)، إدخال قوات البداية والنهائية ومدة البروتوكول انقلبت "V". بعد ذلك، عقد الجل في مينيسوتا 0 (أو قوة منخفضة) ل s > 200 للسماح لنطاقات البروتين ريفولد ومرونة جل لاسترداد.
    2. حفظ التتبع.
  2. ثابت--قوة التجارب
    1. تنفيذ بروتوكول ثابت-القوة عن طريق تطبيق قوة منخفضة (مثلاً، مينيسوتا 0.1) 30 ثانية وثم زيادة القوة إلى قوة ثابتة (مثلاً، 1 بالمليون) لفترة محددة من الزمن (مثلاً، 120 s)، متبوعاً بتبريد القوة مرة أخرى إلى نفس منخفضة القيمة (مثلاً، مينيسوتا 0.1) ل s > 300 للسماح لنطاقات البروتين ريفولد ومرونة جل لاسترداد.
    2. نبض الأولى، بعد ضبط إعدادات PID إلى أقصى حد الوقت استجابة لردود الفعل حلقة (انظر الشكل 2D).
      ملاحظة: للمواد الهلامية قاسية وتغييرات صغيرة في القوة، زمن الاستجابة للحلقة محدودة من إلكترونيات استشعار القوة وزمن الاستجابة للملف، ويمكن أن تكون منخفضة تصل إلى 5 مللي ثانية7. المواد الهلامية أكثر ليونة والتغييرات الكبيرة في القوة، تمليه وقت استجابة مرونة الهلاميات المائية (الشكل 2D).
    3. حفظ التتبع.

5-بيانات التحليل

  1. استخدام قياس الفصل بين خطاف والموقف لفائف المحسوبة، عندما يبدأ الهلام لتجربة قوة (Δx في إدراج الشكل 4A )، حساب طول جل ل استخدام المعادلة:
    L = L0 + ∆x
    وهنا ل0 هو فصل بين هوكس، يقاس من موقف مسامير ميكرومتر قبل التجربة (الخطوة 3.14).
    ملاحظة: للهلام مع تركيزات منخفضة البروتين التي لا تؤدي العابرة للربط الكامل، سيتم تغيير طول يقاس من التتبع للتتبع. أيضا، على مدى فترات طويلة من الزمن، البروتينات داخل الهلاميات المائية قد تواجه آثار الشيخوخة25، مما يؤدي إطالة عموما من الجل.
  2. تطبيع تمديد يقاس طول جل الحصول على السلالة.
  3. تطبيع القوة المقاسة إلى المساحة السطحية مستعرضة باستخدام القطر الداخلي لأنبوب يستخدم البلمرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1A مخطط رد فعل فوتواكتيفي المستخدمة لتوليف المائية8 لتر-جنيه/لتر. ويبين الشكل 1B الخليط المائية في أنبوب PTFE قبل وبعد فوتواكتيفيشن. ويعرض الشكل 1 مقذوف ل--اجفب--ل8 المائية داخل حلاً تريس. وقد عينة المائية لا عيوب هيكلية مثل الشقوق. يجب أن يتم تجاهل الهلاميات المائية مع الضرر مرئية بوضوح.

ويعرض تقديم تجميعها وانفجرت وجهات النظر من رهيوميتير القوة-المشبك في الشكل 2 ألف و 2 باء. يبين الشكل 2 مخطط رهيوميتير القوة-المشبك، حيث يتم المربوطة العينة المائية بين خطافات متصلة بالصوت-اللولب الخطي واستشعار القوة ومغمورة في محلول المخزن مؤقت. يضبط النظام PID التناظرية تمديد المائية بالسيطرة على الموقف لفائف الخطي-صوت لمتابعة هذه النقطة مجموعة القوة. ويبين الشكل 2D ضبط المعرف الشخصي استخدام العلاوات المختلفة لتحقيق مكاسب لا يتجزأ.

ويبين الشكل 3 عملية مرفق نموذجي من عينة المائية. بعد الربط المائية بين هوكس تمت محاذاته، شددت الحلقات خياطة حول المائية القرب من الانحناءات للحيلولة دون انزلاق العينة، والسماح للتحديد الدقيق لطول المائية.

قياس قوة المنحدر والتحليل القائم على البروتين الهلاميات المائية:
قياسات تمثيلية البروتوكول القوة-منحدر مبينة في الشكل 4A - 4 ج. سحب كل جديد يبدأ مع قياس الترهل، كما هو مبين في الشكل 4A. ثم، منحنى القوة يتم الحصول عليها بتطبيق بروتوكولا "V" مقلوب حسب الحمولة الزيادة والنقصان خطيا مع مرور الوقت. بعد ذلك، المائية يقام في قوة 0 mN ل 200 s، السماح لنطاقات البروتين داخل العينة المائية ريفولد (الشكل 4 باء). أثناء الإجهاد، ويعدل نظام PID تمديد المائية ممثلة بالموقف لفائف لمتابعة قوة المعرفة مسبقاً تعيين نقطة. لكل منحنى الركود، نحن تناسب خطوط 2 (الشكل 4). يتم استخدام الخط الأزرق صالح النظام الأول عندما يستخدم نمحوه المائية والخط البرتقالي لتناسب النظام عندما يصبح المائية فترة سماح. نقطة التقاطع بين الخطين يستخدم لحساب طول جل الحقيقية مع قرار ميكرومتر (الشكل 4 أ). بعد ذلك، يتم حساب تمديد العينة المائية عن طريق طرح الموقف لفائف الأولية من تتبع موقف لفائف (الشكل 4). ويعرض الشكل 4F منحنى الإجهاد-الانفعال. الإجهاد يحسب بقسمة القوة التطبيقية بمنطقة المقطع العرضي للعينة المائية والسلالة يحسب بقسمة التمديد (الرقم 4E) بالطول الحقيقي جل محسوبة من المنحنى سماح كما عرضت في الشكل 4A .

ثابت--قوة القياس والتحليل القائم على البروتين الهلاميات المائية:
تظهر قياسات تمثيلية بروتوكول ثابت-القوة في الشكل 5A - 5 د. قوة ثابتة من مينيسوتا 0.1 يتم تطبيقه على العينة المائية لمدة 30 ثانية، القوة ثم تغير إلى mN 1 120 s، وأخيراً، القوة هي تطفئ العودة إلى مينيسوتا 0.1 ل 300 s للسماح لنطاقات البروتين ريفولد (الشكل 5A). خلال 30 أول s في قوة منخفضة، هناك أي تغيير ملحوظ في بسط هلام. عند زيادة القوة إلى mN 1، المائية يظهر ملحق سريعة مرنة. بعد هذا التمديد الأولى، يبقى توسيع المائية مع مرور الوقت، مع الحفاظ على ثابت القوة (بالمليون 1). بعد ذلك، هو مروي القوة مرة أخرى إلى القيمة الأولية منخفضة (0.1 مينيسوتا) والمائية يسترد إلى طوله الأولية (الشكل 5 (ب)). توسيع العينة المائية (الشكل 5)، والقوة المستخدمة لحساب الضغط (أعلى) والإجهاد (أسفل) بطريقة مماثلة كما هو الحال في القياسات منحنى القوة (الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1: L-eGFP/(L)8-أساس التوليف هيدروجيل. (أ) هذا الفريق يظهر الخطط L-eGFP/(L)8 المائية تخليق البروتين باستخدام فعل فوتواكتيفاتيد. البروتين هو مختلطة مع وكالة الأنباء الجزائرية و [Ru(bpy)3]2 + وعرضه للضوء الأبيض، الذي يعزز تكوين روابط تساهمية بين الأحماض الأمينية تيروزين المتاخمة (داخلي). (ب) يظهر هذا الفريق L-eGFP/(L)8-, [Ru(bpy)3]2 +-، وتحميلها APS-الخليط في أنبوب PTFE استخدام إبرة ز 23 قبل التعرض للضوء الأبيض (أعلى)، وبعد (أسفل). (ج) يظهر هذا الفريق L-eGFP/(L) مقذوف8-أساس المائية في حل تريس. اقحم يظهر صورة مكبرة من L-eGFP/(L)8-أساس المائية. توزيع القطر 552 ± 8 ميكرومتر، باﻻتفاق مع القطر الداخلية من أنبوب بفتي المستخدمة خلال البلمرة (558 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: القوة-المشبك رهيوميتير التصميم والإنشاء- (أ) تقديم رهيوميتير المائية المشبك القوة المجمعة. لفائف يظهر اقحم عينة المائية على أساس البروتين يعلق على الصوت وقوة هوكس استشعار داخل دائرة الحل. (ب) تقديم رأي انفجرت رهيوميتير المائية القوة-المشبك: (أ-ج) المتلاعبينz x-y-لضبط الصوت اللولب ربط الموقف، موتور (د) الملف الصوتي الخطي، محول (ه) القوة، (و) القوة حامل محول الطاقة، والدائرة (ز) الحل، و (ح-أنا) x-y المتلاعبين لضبط موضع محول طاقة القوة. (ج) خطة لإنشاء رهيوميتير المائية القوة-المشبك. المخطط يبين عينة المائية على أساس البروتين يعلق على جهاز استشعار قوة وخطاطيف الملف الصوتي باستخدام خيوط طبية. يتغير نظام PID التناظرية طول المائية بضبط موضع الملف الصوتي لمتابعة هذه النقطة مجموعة القوة. (د) PID استجابة النظام باستخدام قيم متكاملة المكسب مختلفة (أنا) للوصول إلى القوة تعيين نقطة (خط متقطع). آثار ملونة تمثل القوة المقاسة (أسفل) وسلالة (أعلى) المستمدة من استجابة النظام PID. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: L-eGFP/(L)8-على أساس عملية مرفق هيدروجيل. (أ) عن قرب عرض حلقة خياطة، مرتبطة بعقدة تراكم مزدوجة فضفاض يستخدم لإرفاق العينة المائية خطاف. (ب) وهما خياطة الحلقات توضع على هوك استشعار القوة المستخدمة في مرفق المائية على أساس البروتين. (ج) L-eGFP/(L)8-المائية استناداً إلى عينة معلقة بين هوكس (المشار إليها بواسطة الأسهم). (د) حلقات الخياطة إلى جانب الملف الصوتي (يسار) ويتم تشديد هوك استشعار القوة (يمين) حول العينة المائية عند منعطف كل هوك للحيلولة دون الانزلاق خلال القياسات العينة. بعد ذلك، يتم قطع خيوط الزائدة باستخدام مقص الطبية (المشار إليها بالأسهم الحمراء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: منحنى القوة التمثيلية القياس والبيانات تحليل المنحنيات ل L-eGFP/(L)8-على أساس العينة المائية- (أ) قياس سماح نموذجية منحنى (أحمر) المستخدمة في تحديد القوة صفر لاستشعار القوة وطول صحيح المائية. منحنيين الخطي (الأزرق وخطوط أورانج) تستخدم لتناسب كلا النظامين: أولاً، عندما الجل تحت القوة (الخط الأزرق)، والثانية، وعندما يصبح الجل فترة سماح (الهضبة-أورانج الخط). نقطة التقاطع بين الخطين يستخدم لحساب طول المائية الحقيقية في قوة صفر. يظهر السهم الاتجاه الحركة. ويبين اقحم موقع القوة صفر وتصحيح طول المائية. (ب) منحنى منحدر القوة التمثيلية تطبيقها على العينة المائية. (ج) تتبع تمثل حركة موقف لفائف كدالة للزمن. لفائف يبدأ من الموضع الأولية المحددة في البروتوكول في الخطوة 3.1 (7.5 ملم). (د) المنحنى الممثل لتمديد العينة المائية كدالة للزمن. التمديد يحسب كالتشرد بين الموقف لفائف المقاسة وموقفها المبدئي. (ه) ممثل السلالة-مقابل-منحنى الوقت. السلالة يحسب بقسمة التمديد طول جل الحقيقي المحسوب من قياس فترة سماح. منحنى الإجهاد-الانفعال الممثل (F) عينة المائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تحليل البيانات وقياس ثابت القوة- (أ) تتبع الممثل بروتوكول ثابت-القوة المطبقة على المائية. المائية تتعرض للمنغنيز 0.1 ل 30 s، ثم القوة تزداد إلى mN 1 120 s، وأخيراً، القوة هو مروي مرة أخرى إلى مينيسوتا 0.1 لموقف 300 يظهر (ب) هذا الفريق س. لفائف تتبع مقابل الوقت الذي يمثل التغير في طول ح يدروجيل العينة بعد البروتوكول القوة. (ج) يظهر هذا الفريق تمديد جل يقاس من تشريد الصوت اللولب. (د) الرقم الممثل للإجهاد (أسفل) وآثار الإجهاد (أعلى) وبعد تحليل البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، يمكننا وصف تقنية المشبك قوة رهيوميتري للتحقيق في رد النشاط الحيوي صغيرة الحجم على أساس البروتين الهلاميات المائية. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفيرها على بروتوكول لتجميع عينة المائية موحدة بروتين منخفضة الحجم أسطواني. بروتوكول يرد أيضا الذي يصف كيفية ربط أنواع مختلفة من الهلاميات المائية على أساس البروتين مع المرونات المختلفة دون أحداث أي تشوه الميكانيكية أو ضرر على العينات المائية على أساس البروتين أو انزلاق الجل على خطاف. تمكين النظام PID التناظرية، جنبا إلى جنب مع الملف الصوتي الخطي واستشعار القوة، تطبيق البروتوكولات الخاضعة لسيطرة القوة مثل منحنى القوة وقوة ثابتة. في الآونة الأخيرة، استخدمت هذه التقنية لدراسة النشاط الحيوي استجابة تركيزات cross-linked مختلفة من الهلاميات المائية المستندة إلى جيش صرب البوسنة في الحلول التجريبية المختلفة7.

جانبا مهما عند صياغة والعمل مع البروتين الهلاميات المائية هو إمكانية تكرار نتائج القياسات. إذا كانت المواد الهلامية تصاغ مع تركيز البروتين منخفض جداً أو العابرة للربط غير مكتملة، سوف تظهر التشوهات الدائمة البلاستيك خلال ملحق7. هذه التشوهات البلاستيك سيحد جذريا تفسير البيانات، كما آثار لزج مطاطي ستأتي من تتكشف المجال وإعادة ترتيب الجزيئات داخل الجل. اختبار سهل لمعرفة ما إذا كان هناك إنجاز العابرة للربط أن تزج المائية في ديناتورانتس الكيميائية، مثل كلوريد جوانيدينيوم م 61. وفي هذه الحالة، ينبغي أن لا يكون هناك أي آثار لزج مطاطي في الإجهاد-مقابل-سلالة المنحنيات، كما كافة المجالات التي تكشفت كيميائيا، والجزيئات تتصرف الآن البوليمرات بسيطة4،،من726. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تسترد الهلام مرونته الأولى عندما منغمسين في المخزن المؤقت الأولى7.

إذا كان هناك اختلافات في الاستجابة يقاس بين آثار الحصول عليها مع مختلف المواد الهلامية، ينبغي النظر في جوانب عدة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها: تجميع البروتين في الحل، خلط غير متجانسة من البروتين مع العابرة للربط المواد الكيميائية، ووجود فقاعات، وربط المائية على أساس البروتين إلى أنبوب بفتي بسبب سيلانيزيشن غير صحيحة. بقايا سيلاني على جدران الأنبوبة قد تلوث المائية وتؤدي إلى عيوب هيكلية. لتجنب هذا الخطأ، يلزم المزيد من الهواء المضغوط لضمان إزالة مجموع سيلاني من الأنبوب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تشكل فقاعات أثناء الشفط من هذا المزيج فوتواكتيفي المائية في أنبوب PTFE. يمكن أن تؤدي هذه الفقاعات أخذ عينة من الضرر ويؤثر على النشاط الحيوي استجابة المائية. لمنع أي تكوين فقاعة، يجب أن تكون نهاية الأنبوب PTFE داخل المزيج الحل أثناء عملية التحميل ويجب سحبه المكبس حقنه ببطء. خطأ نموذجي آخر هو تشديد الإفراط الحلقات خياطة حول العينات المائية خلال عملية الحجز، مما قد يؤدي إلى تشكيل الشق وقطع المائية. حدود نطاق نقل الملف الصوتي تمديد الحد الأقصى للعينة المائية المرفقة. هذا القيد يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند قياس المواد الهلامية التي تمتد عدة مئات النسبة المئوية لمدة أولية. على سبيل المثال، لتوسيع المائية لأكثر من 200%، على طول أولية من أقل من 4 مم مطلوب.

الهلاميات المائية على أساس البروتين هي فئة فريدة من نوعها الحيوية نظراً لتوافق مع الحياة والشلل العالية المستمدة من البروتينات ووحداتهم المبنى الرئيسي، والانتقال للطي الكامنة التي من سمات للبروتينات. بالإضافة إلى ذلك، أن هذه الهلاميات المائية بإمكانيات ممتازة لهندسة الأنسجة، ونظم إيصال المخدرات والحبر البيولوجية (بيوينك) ل الطباعة 3D27. يمكن استخدام رهيوميتير المائية القوة-المشبك للتحقيق في مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات. وعلاوة على ذلك، تمكن رهيوميتير القوة-المشبك تطبيق البروتوكولات ثابت-القوة على العينات المائية صغيرة الحجم. السماح بفصل سلوك مطاطا ولزج مطاطي هذه التجارب ودراسة الميكانيكا قابلة للطي (الأمم المتحدة) في نهج مجمع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نحن نعترف بالدعم المالي من "البحوث مبادرة النمو" (جائزة رقم 101 X 340)، المؤسسة الوطنية للعلوم، برنامج الأجهزة البحثية الرئيسية (رقم المنحة PHY-1626450)، أكبر مؤسسة ميلووكي (جائزة شو) ونظام جامعة ويسكونسن (منح البحوث التطبيقية).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SI-KG4A force transducer World Precision Instruments (WPI) SI-KG4A
Linear Voice Coil Motor Equipement Solutions LFA2010
Bovine serum albumin Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma Sigma-Aldrich T1503-1KG
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653-1KG
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 248614-100G
Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride Sigma-Aldrich 544981-1G
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK Fisher Scientific NC0395626
1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip BD 309628
Silane, Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21
Hypodermic Needle, 23 Gauge Healthcare Supply Pros 305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge KIMCO JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp ALB USH-103D USHIO
Medical Tweezers
Medical scissors
Olympus
The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins? Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
  2. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  3. Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
  4. Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
  5. Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
  6. Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
  7. Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
  8. Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
  9. Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
  10. Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
  11. Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
  12. Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface? Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
  13. Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
  14. Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
  15. Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
  16. Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
  17. Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).
  18. Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
  19. Desai, M. S., et al. Elastin-Based Rubber-Like Hydrogels. Biomacromolecules. 17 (7), 2409-2416 (2016).
  20. Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
  21. McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
  22. Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
  23. Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
  24. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
  25. Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
  26. Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
  27. Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).

Tags

الهندسة والعدد 138، رهيوميتري القوة-المشبك، الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين، والبروتين تتكشف تحت القوة، قوة التحليل الطيفي، مرونة الحيوية، المواد الذكية
المشبك قوة رهيوميتري لوصف الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Khoury, L. R., Nowitzke, J., Dahal,… More

Khoury, L. R., Nowitzke, J., Dahal, N., Shmilovich, K., Eis, A., Popa, I. Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels. J. Vis. Exp. (138), e58280, doi:10.3791/58280 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter