Kraft-klemme Rheometry til karakterisering af Protein-baseret Hydrogels
Summary
En ny kraft-klemme rheometry teknik bruges til at undersøge de mekaniske egenskaber af små mængder protein-baserede hydrogel prøver tøjret mellem en voice-coil motor og en force sensor. En analog proportional-integral-derivat (PID) system tillader ‘klemmemekanismen’ Force opleves at den ønskede protokol.
Abstract
Her, beskriver vi en kraft-klemme rheometry metode til at karakterisere de biomekaniske egenskaber af protein-baseret hydrogels. Denne metode bruger en analog proportional-integral-derivat (PID) system til at anvende kontrollerede gældende protokoller på cylindrisk proteinbaseret hydrogel prøver, som er bundet mellem en lineær voice-coil motor og en krafttransducer. Under drift justerer PID system udvidelse af hydrogel prøve at følge en foruddefineret force protokol ved at minimere forskellen mellem de målte og sætpunkt styrker. Denne unikke tilgang til protein-baserede hydrogels gør det muligt tøjring af ekstremt lav-volumen hydrogel prøver (< 5 µL) med forskellige protein koncentrationer. Under force-rampe protokoller, hvor den anvendte stress stiger og falder lineært med tid, systemet muliggør undersøgelse af elasticitet og hysterese adfærd forbundet med den (FN) foldning af proteiner og måling af standard elastisk og viskoelastiske parametre. Under konstant-kraft, hvor kraft puls har en trin-lignende figur, elastisk svaret grund til ændringen i kraft, er afkoblet fra viskoelastiske svar, der kommer fra protein domæne udfoldning og hvorved man genfolder. På grund af sin lav-volumen prøve og alsidighed ved at anvende forskellige mekaniske perturbationer, er kraft-klemme rheometry optimeret til at undersøge den mekaniske respons af proteiner under kraft ved hjælp af en bulk tilgang.
Introduction
Bortset fra at have unikke fysiske egenskaber, holde protein-baserede hydrogels løftet om revolutionerer kraft spektroskopi ved at aktivere måling af flere milliarder molekyler i en “pull”, således at studiet af proteiner i overfyldte miljøer, svarende til dem fundet i huden og andre væv. Protein domæner forblive foldede inde i hydrogels, giver mulighed for undersøgelse af deres biomekaniske svar at tvinge, bindende partnere, og kemiske forhold. Derudover ligner den biomekaniske svar af protein domæner inde hydrogels den reaktion, set med enkelt-molekyle kraft spektroskopi teknikker. For eksempel, falde kemiske denatureringsmidler og oxidationsmidler stabilitet af den foldede stats både enkelt protein domæne niveau1,2,3 og på det makroskopiske niveau4,5 , 6 , 7. på samme måde, osmolytes øge stabiliteten i enkelt proteiner8,9, fører til et fald i viskoelastiske svar af hydrogels, for det samme gældende betingelser7,10.
Flere metoder er blevet gennemført for at syntetisere protein-baseret hydrogels, enten ved hjælp af fysiske vekselvirkninger11,12 eller kovalent tværbindingsmidler4,13. Kovalente reaktioner giver mulighed for fast tværbindingsmidler steder og disse hydrogels kan gendanne den oprindelige tilstand ved en fjernelse af de mekaniske eller kemiske perturbationer. En vellykket strategi for kovalente cross-linking afhængig danner kovalente carbon-carbon-bindinger mellem udsatte tyrosin aminosyrer ved hjælp af ammonium persulfat (APS) som en oxidant og en ruthenium (II) salt som en initiativtager (figur 1)14. Ved udsættelse for hvidt lys, kan en løsning af koncentreret proteiner omdannes til en hydrogel. Ved at styre når reaktion starter, protein-APS-mix kan injiceres i enhver form, støbning, såsom polytetrafluorethylen (PFTE) rør (figur 1B og 1 C), der tillader anvendelse af en ekstremt lille løsning bind15. Desuden brug af hvidt lys til at udløse den tværbindingsmidler reaktion resulterer i en begrænset blegning af fluorescerende proteiner og gør det muligt for formuleringen af komposit hydrogels med fluorescerende markører (figur 1). Andre proteinbaseret hydrogel dannelse metoder bruger cross-linking baseret på SpyTag-SpyCatcher kovalente interaktion16, Amin tværbindingsmidler via glutaraldehyd13eller biotin-streptavidin interaktioner17.
Dynamisk mekanisk analyse (DMA) er i øjeblikket en teknik flittigt brugt til at studere polymer-baserede hydrogels13,18. Mens DMA kan gælde biomaterialer konstant kraft protokoller, kræver det Youngs moduli over 10 kPa, og stor stikprøve mængder af mere end 200 µL19. På grund af disse begrænsninger er protein hydrogels generelt alt for blød til at blive undersøgt af denne teknik. Som manipuleret polyproteins er sværere at syntetisere end polymerer, da de kræver en levende system til at producere, er sådanne store mængder ineffektive på bedste4,15. Endvidere, de fleste biologiske væv er blødere end 10 kPa. Flere metoder blev udviklet for biologiske prøver, navnlig i studiet af muskel elasticitet20,21. Disse teknikker kan også operere under feedback til at anvende konstant kraft, men er optimeret til prøver med små diametre (i rækken micron) udsat for at tvinge for meget kort tid (typisk mindre end 1 s).
Protein-baserede hydrogels blev med succes undersøgt med modificerede rheometry teknikker. For eksempel, tillader støbning hydrogel i en ring form brug af ekstensionelle rheometry at måle ændringen i den erfarne kraft som en funktion af udvidelse4,22. Andre metoder til at studere de rheologiske egenskaber af protein-baserede hydrogels bruge kontrolleret shear-stress rheometry. Disse teknikker kan også opnå lav sample volumen og tolerere bløde materialer. Men disse metoder manglende evne til at efterligne den trække styrker denne årsag protein udfoldelsen i vivo, og Young’s modulus er beregnet på grundlag af komplekse teorier, der kræver forskellige antagelser og korrektioner23.
Vi har for nylig rapporteret en ny tilgang, der bruger en lille mængde proteiner, polymeriserede indeni rør med diametre < 1 mm. Vores første gennemførelse af denne teknik, der opererer i længde-clamp tilstand, hvor gelen blev forlænget efter den ønskede protokol15. I denne metode opleve proteiner en kontinuerlig ændring i både udvidelsen og kraft mens domænerne udfolde sig, gør data fortolkning besværlige. Vi har for nylig rapporteret en ny kraft-klemme rheometry teknik, hvor en feedback-sløjfe kan udsætte små mængder protein hydrogels til en foruddefineret force protokol7 (figur 2). En analog PID system sammenligner styrken målt af force sensor med sætpunktet sendes fra computeren og justerer gel udvidelse ved at flytte voice coil at minimere forskellen mellem de to indgange. Denne ‘fastspænding’ Force giver nu mulighed for nye typer af eksperimenter til at måle biomekanik af protein hydrogels.
I tilstanden force-rampe oplever en tøjret protein hydrogel en konstant stigning og fald af force med tiden. PID kompenserer for eventuelle viskoelastiske deformation af skiftende forlængelsen i en ikke-lineær måde, afhængigt af protein og hydrogel formulering. Den største fordel ved kraft rampe er at det giver mulighed for kvantificering af standardparametre, som Young’s modulus og energi varmeafledning, på grund af en udfoldning og hvorved man genfolder af protein domæner.
I konstant-kraft-tilstand skifter den kraft i en trin-lignende måde. I denne tilstand, gel udvider og kontrakter gravitoner, når kraften er steget eller faldet, henholdsvis, efterfulgt af en tidsafhængig deformation. Denne viskoelastiske deformation, finder sted, mens gelen oplever en konstant kraft, er direkte relateret til domæne udfoldning/hvorved man genfolder. På en forenklet måde, kan denne udvidelse ses som svarer til adskillige milliarder enkelt molekyle spor sammen i gennemsnit og målt på én gang. Konstant-kraft protokoller kan bruges til at studere krybe og lempelse af protein hydrogels som en funktion af kraft og tid. Som en funktion af kraft, for BSA-baseret protein hydrogels, har vi for nylig vist, at der er en lineær afhængighed mellem elastisk og viskoelastiske udvidelse og rekyl med anvendt stamme7.
Her detalje vi driften af en kraft-klemme rheometer bruge composite gels fremstillet af en blanding af protein L (8 domæner24, afbildet som L8) og en protein L-eGFP konstruktion (L-eGFP), hvilket gør den samlede hydrogel fluorescerende og let at demonstrere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri, beskriver vi en kraft-klemme rheometry teknik til at undersøge den biomekaniske svar af små mængder protein-baseret hydrogels. Derudover tilbydes en protokol til at syntetisere en ensartet cylindrisk små mængder protein hydrogel prøve. En protokol er også præsenteret som beskriver hvordan man kan binde forskellige typer af protein-baseret hydrogels med forskellige elasticiteter uden at forårsage nogen mekanisk deformation eller beskadigelse af protein-baserede hydrogel prøver eller forsinkelse af gel på …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender finansiel støtte fra forskning vækst Initiative (Award No. 101 X 340), National Science Foundation, store forskning Instrumentation Program (Grant nr. PHY-1626450), større Milwaukee Foundation (Shaw Award) og University of Wisconsin System (anvendt forskning tilskud).
Materials
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins?. Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
- Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
- Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
- Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
- Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
- Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
- Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
- Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
- Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
- Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface?. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
- Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
- Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
- Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
- Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).
- Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
- Desai, M. S., et al. Elastin-Based Rubber-Like Hydrogels. Biomacromolecules. 17 (7), 2409-2416 (2016).
- Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
- McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
- Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
- Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
- Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
- Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
- Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).
