Kraft-Clamp Rheometrie zur Charakterisierung von Protein-basierten Hydrogele

Summary

Eine neue Kraft-Clamp Rheometrie-Technik wird verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von geringem Volumen Protein-basierten Hydrogel Proben zwischen ein Voice-Coil-Motor und einen Kraftsensor angebunden zu untersuchen. Ein analoges Proportional-Integral-Derivat (PID) System ermöglicht das Spannen der Kraft erfahren, um das gewünschte Protokoll.

Abstract

Hier beschreiben wir eine Kraft-Clamp Rheometrie Methode um die biomechanischen Eigenschaften des Protein-basierte Hydrogele zu charakterisieren. Diese Methode verwendet ein analoges Proportional-Integral-Derivat (PID)-System, kontrollierte Kraft Protokolle auf zylindrischen Protein-basierten Hydrogel Proben anwenden, die zwischen einem linearen Schwingspulen-Motor und ein Kraftaufnehmer angebunden sind. Während des Betriebs passt das PID System die Erweiterung der Hydrogel-Probe, eine vordefinierte Kraft-Protokoll zu folgen, durch die Minimierung des Unterschied zwischen der gemessenen und Sollwert. Dieser einzigartige Ansatz zur Protein-basierte Hydrogele ermöglicht das Anbinden der extrem leise Hydrogel Proben (< 5 µL) mit unterschiedlichen proteinkonzentrationen. Unter Kraft-Rampe Protokolle, wo die angelegten Spannung steigt und sinkt linear mit der Zeit, das System ermöglicht die Untersuchung von der Elastizität und Hysterese Verhaltensweisen im Zusammenhang mit der (un) Faltung von Proteinen und die Messung der standard elastisch und viskoelastische Parameter. Unter konstanter Kraft, wo Kraft Puls eine Schritt-ähnliche Form, die elastische Reaktion aufgrund der Änderung in Kraft, hat ist von der Viskoelastische Antwort, stammt aus Protein-Domäne Entfaltung und umfaltung entkoppelt. Aufgrund seiner geringen Stückzahlen Probe und Vielseitigkeit bei der Anwendung der verschiedenen mechanischen Störungen ist Kraft-Clamp Rheometrie optimiert, um das mechanische Verhalten von Proteinen unter Kraft mit einem Masse-Ansatz zu untersuchen.

Introduction

Abgesehen von einzigartigen physikalischen Eigenschaften Versprechen Protein-basierte Hydrogele revolutioniert Kraft-Spektroskopie von ermöglichen mehrere Milliarden Moleküle in einem “pull”, so dass die Untersuchung von Proteinen in überfüllten Umgebungen zu messen, ähnlich denen in Haut und anderen Geweben begegnet. Protein-Domains bleiben gefaltet innen Hydrogele, so dass die Studie ihrer biomechanischen Reaktion zu zwingen, Partner und chemischen Bedingungen verbindlich. Darüber hinaus gleicht die biomechanische Reaktion des Protein-Domänen innerhalb Hydrogele die Antwort mit der Kraft der Einzelmolekül-Spektroskopie Techniken gesehen. Z. B. verringern chemische Denaturierungsmittel und Oxidationsmitteln die Stabilität des zusammengeklappten Zustand, sowohl auf die einzelnen Proteins Domäne Ebene^1,2,3 makroskopischen Ebene^{4,5 , 6 , 7}. ebenso osmolyten erhöhen die Stabilität der einzelnen Proteine^8,9, führt zu einem Rückgang der Viskoelastische Antwort der Hydrogele, für das gleiche Bedingungen^7,10zwingen.

Mehrere Ansätze umgesetzt um synthetisieren Protein-basierte Hydrogele, entweder durch Verwendung von physikalischen Wechselwirkungen^11,12 oder kovalente Vernetzung^4,13. Kovalente Reaktionen ermöglichen festen Vernetzung Standorten und diese Hydrogele kann den ursprünglichen Zustand auf eine Entfernung von der mechanischen oder chemischen Störungen erholen. Ein erfolgreicher Ansatz für kovalente Vernetzung setzt auf bilden kovalente Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen zwischen exponierten Tyrosin Aminosäuren mit Ammonium Bleichen (APS) als Oxidationsmittel und Ruthenium (II) Salz als ein Initiator (Abbildung 1)¹⁴. Bei Kontakt mit weißem Licht kann eine Lösung der konzentrierten Proteine in einem Hydrogel verwandelt werden. Durch die Kontrolle bei der Reaktion beginnt, den Protein-APS-Mix in irgendeiner Form Gießen injiziert werden können erlaubt wie Polytetrafluorethylen (CF) Rohre (Abbildung 1 b und 1 C), die Verwendung von eine extrem kleine Lösung Band¹⁵. Darüber hinaus die Verwendung von weißem Licht die Vernetzungsreaktion auslösen führt zu einer begrenzten Bleichen von fluoreszierenden Proteinen und erlaubt die Formulierung von zusammengesetzten Hydrogele mit fluoreszierenden Marker (Abbildung 1). Andere Protein-basierten Hydrogel-Bildung-Methoden verwenden Vernetzung basierend auf dem SpyTag-SpyCatcher kovalenten Wechselwirkungen¹⁶, Amin Vernetzung über Glutaraldehyd¹³oder Biotin-Streptavidin Interaktionen¹⁷.

Dynamische mechanische Analyse (DMA) ist derzeit eine Technik intensiv genutzt, um Polymer-basierte Hydrogele^13,18zu studieren. Während DMA Konstante Kraft Protokolle auf Biomaterialien anwenden kann, bedarf es Youngs Moduli über 10 kPa und große Probenvolumina von mehr als 200 µL¹⁹. Aufgrund dieser Einschränkungen sind in der Regel Protein Hydrogele zu weich, um durch diese Technik untersucht werden. Veränderter Polyproteins sind schwerer als Polymere zu synthetisieren, da sie ein lebendes System zu produzieren erfordern, sind solche hohen Volumina ineffizient, am besten^4,15. Darüber hinaus sind die meisten biologischen Gewebe weicher als 10 kPa. Verschiedene Ansätze wurden für biologische Proben, vor allem in der Studie von Muskel Elastizität^20,21entwickelt. Diese Techniken können auch arbeiten unter Feedback, um konstante Kraft anwenden, sondern sind optimiert für Proben mit kleinen Durchmessern (im Mikrometerbereich) erzwingen für sehr kurze Zeit ausgesetzt (in der Regel weniger als 1 s).

Protein-basierte Hydrogele wurden erfolgreich mit modifizierten Rheometrie Techniken untersucht. Das Hydrogel Gießen, in eine Ringform ermöglicht zum Beispiel die Verwendung von extensionalen Rheometrie, den Wandel in der erfahrene Kraft als Funktion der Erweiterung^4,22messen. Andere Ansätze zur Untersuchung der rheologischen Eigenschaften der Protein-basierte Hydrogele verwenden kontrollierte Schubspannung Rheometrie. Diese Techniken können auch erreichen geringen Probenvolumen und weiche Materialien zu tolerieren. Allerdings zwingt diese Methoden fehlt die Fähigkeit, das ziehen zu imitieren, dass Ursache Protein entfaltet in Vivound Elastizitätsmodul errechnet sich anhand von komplexen Theorien, die verschiedene Annahmen und Korrekturen²³erfordern.

Wir haben vor kurzem berichtet, einen neuen Ansatz, der eine kleine Menge von Proteinen, die im Inneren der Rohre mit Durchmessern polymerisiert nutzt < 1 mm. Unsere erste Umsetzung dieser Technik war im Dauer-Clamp-Modus Betrieb wo das Gel nach der gewünschten Protokoll¹⁵erweitert wurde. Bei dieser Methode erleben die Proteine eine kontinuierliche Veränderung im Erweiterung und Kraft, während die Domains entfalten, macht die Interpretation der Daten umständlich. Vor kurzem haben wir eine neue Kraft-Clamp Rheometrie Technik, berichtet, wo eine Feedback-Schleife Low-Volume Protein Hydrogele, eine vordefinierte Kraft Protokoll Nr.⁷ (Abbildung 2) verfügbar gemacht werden können. Ein analoges PID-System vergleicht die Kraft gemessen an dem Kraftsensor mit den Sollwert vom Computer gesendet und passt die Gel-Erweiterung durch die Bewegung der Schwingspule, den Unterschied zwischen den beiden Eingängen zu minimieren. Diese “spannen” der Kraft ermöglicht nun neue Arten von Experimenten, die Biomechanik des Proteins Hydrogele zu messen.

Eine gefesselte Protein Hydrogel Erfahrungen in der Kraft-Rampen-Modus eine Konstante Zunahme und Abnahme der Kraft mit der Zeit. Die PID kompensiert Viskoelastische Verformung durch die Erweiterung auf nichtlineare Weise, je nach Art des Proteins und Hydrogel Formulierung ändern. Der Hauptvorteil der Kraft Rampe ist, dass es erlaubt die Quantifizierung der Standardparameter wie des Elastizitätsmoduls und Energiedissipation durch eine Entfaltung und umfaltung von Protein-Domains.

In konstanter Kraft-Modus ändert die einwirkende Kraft in einem Schritt-wie Mode. In diesem Modus erstreckt sich das Gel und elastisch zusammenzieht, wenn die Kraft erhöht oder, beziehungsweise verringert, gefolgt von einer zeitabhängigen Verformung. Diese Viskoelastische Verformung, statt, während das Gel eine konstante Kraft Erfahrungen bezieht sich direkt auf Domäne Entfaltung/umfaltung. Diese Erweiterung ist auf vereinfachte Weise als das Äquivalent von mehreren Milliarden Einzelmolekül Spuren im Durchschnitt zusammen und auf einmal gemessen zu sehen. Konstanter Kraft Protokolle können verwendet werden, die kriechen und Entspannung des Proteins Hydrogele als Funktion der Zeit und Kraft zu studieren. Als Funktion der Kraft, für BSA-basierte Protein Hydrogele haben wir vor kurzem gezeigt, dass es eine lineare Abhängigkeit zwischen den elastischen und Viskoelastische Ausdehnung und Rückstoß mit dem angewandten Druck⁷.

Hier zeigen wir den Betrieb einer Kraft-Clamp-Rheometer mit zusammengesetzten Gele, hergestellt aus einer Mischung von Protein L (8 Domänen²⁴, dargestellt als L-₈) und ein Protein L-eGFP-Konstrukt (L-eGFP), wodurch die gesamte Hydrogel fluoreszierende und leicht zu zu demonstrieren.

Protocol

(1) Reagenzien Vorbereitung der Lösung Bereiten Sie ein Ausgangspunkt Proteinlösung durch Auflösen/verdünnen das Protein des Interesses auf die gewünschte Konzentration, mit einem Tris-Puffer [Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane 20 mM und 150 mM NaCl, pH 7.4].Hinweis: Die kleinste Proteinkonzentration für die Vernetzung führt Hydrogele hängt das Protein verwendet und ist in der Regel > 1 mM. Bereiten Sie Vorräte an Ammonium Bleichen (APS) (1 M) und tris(bipyridine)ruthenium(II)-chlorid ([Ru…

Representative Results

Abbildung 1A zeigt das Schema der photoaktiven Reaktion verwendet, um die L-EGP/L8 Hydrogel zu synthetisieren. Abbildung 1 b zeigt die Hydrogel-Mischung in das PTFE-Rohr vor und nach der photoaktivierungen. Abbildung 1 zeigt die extrudierten L-eGFP-L8 Hydrogel innerhalb einer Tris-Lösung. Die Hydrogel-Probe ist keine strukturelle Mängel wie Kerben. Hydrogele mit deutlich sicht…

Discussion

Hier beschreiben wir eine Kraft-Clamp Rheometrie-Technik um die biomechanischen Antwort von geringem Volumen Protein-basierte Hydrogele zu untersuchen. Darüber hinaus ist ein Protokoll zur Verfügung gestellt, um eine einheitliche zylindrische Low-Volume-Protein Hydrogel Probe zu synthetisieren. Ein Protokoll wird ebenfalls dargestellt, die beschreibt, wie man verschiedene Arten von Protein-basierten Hydrogele mit unterschiedlichen Elastizitäten zu binden, ohne dass mechanische Verformung oder Beschädigung des Protein…

Materials

SI-KG4A force transducer	World Precision Instruments (WPI)	SI-KG4A
Linear Voice Coil Motor	Equipement Solutions	LFA2010
Bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)	BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	248614-100G
Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride	Sigma-Aldrich	544981-1G
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK	Fisher Scientific	NC0395626
1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip	BD	309628
Silane, Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll	Cole-Parmer	EW-06417-21
Hypodermic Needle, 23 Gauge	Healthcare Supply Pros	305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge	KIMCO	JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp	ALB	USH-103D USHIO
Medical Tweezers
Medical scissors
Olympus
The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.