Rheometrie força-braçadeira para caracterizar hidrogel à base de proteínas
Summary
Uma nova técnica de rheometrie de força-pinça é usada para investigar as propriedades mecânicas das amostras de hidrogel à base de proteínas de baixo volume, amarradas entre um motor de bobina de voz e um sensor de força. Um sistema analógico de proporcional-integral-Derivativo (PID) permite a fixação da força experiente para o protocolo desejado.
Abstract
Aqui, descrevemos um método de rheometrie força-braçadeira para caracterizar as propriedades biomecânicas de hidrogel à base de proteínas. Esse método usa um sistema analógico de proporcional-integral-Derivativo (PID) para aplicar a força controlada-protocolos em amostras cilíndricas de hidrogel à base de proteínas, que são amarradas entre um motor de bobina de voz linear e um transdutor de força. Durante a operação, o sistema PID ajusta a extensão da amostra hidrogel para seguir um protocolo predefinido de força, reduzindo a diferença entre as forças medidas e set point. Esta abordagem única de hidrogel à base de proteínas habilita o tethering de hidrogel extremamente baixo volume de amostras (< 5 µ l) com concentrações diferentes da proteína. Em protocolos de força-rampa, onde a tensão aplicada aumenta e diminui linearmente com o tempo, o sistema permite o estudo dos comportamentos associados com a dobradura (un) de proteínas e a medição do padrão elástico elasticidade e histerese e parâmetros de viscoelástico. Sob constante-força, onde o pulso de força tem uma passo-como a forma, a resposta elástica, devido à mudança de força, é dissociado da resposta viscoelástica, que vem do domínio da proteína desdobramento e dobrar. Devido ao seu baixo volume de amostra e versatilidade na aplicação de várias perturbações mecânicas, rheometrie força-braçadeira é otimizado para investigar a resposta mecânica das proteínas sob força usando uma abordagem em massa.
Introduction
Além de ter propriedades físicas originais, baseados em proteína hidrogel segura a promessa de revolucionar a espectroscopia de força, permitindo a medição de vários bilhões de moléculas em um ‘puxar’, possibilitando assim o estudo de proteínas em ambientes aglomerados, semelhantes às encontradas na pele e outros tecidos. Domínios da proteína permanecem dobrados dentro de hidrogel, permitindo o estudo da sua resposta biomecânica para forçar, ligação parceiros e condições químicas. Além disso, a resposta biomecânica de domínios da proteína dentro de hidrogel assemelha-se a resposta vista com técnicas de espectroscopia de força único-molécula. Por exemplo, químicas desnaturantes e agentes oxidantes diminuem a estabilidade do estado dobrado, tanto a proteína único domínio nível1,2,3 e o macroscópico nível4,5 , 6 , 7. da mesma forma, osmólitos aumentam a estabilidade das proteínas único8,9, levando a uma diminuição na resposta de viscoelástico de hidrogel, para a mesma força condições7,10.
Várias abordagens têm sido implementadas para sintetizar hidrogel à base de proteínas, por qualquer um usando interações físicas11,12 ou covalente do cross-linking4,13. Reações covalentes permitam locais fixos do cross-linking e estes hidrogel pode recuperar o estado inicial após a remoção das perturbações mecânicas ou químicas. Depende de uma abordagem bem-sucedida para cross-linking ligações covalentes formando ligações covalentes carbono-carbono entre aminoácidos tirosina expostas, usando persulfato de amónio (APS) como um oxidante e um sal de rutênio (II) como um iniciador (Figura 1)14. Após a exposição à luz branca, uma solução de proteínas concentradas pode ser transformada em um hidrogel. Por meio do controle quando o começa a reação, a mistura de proteína-APS pode ser injetado em qualquer forma de fundição, tais como politetrafluoretileno (PTFE) tubos (figura 1B e 1C), permitindo o uso de uma solução extremamente pequeno volume15. Além disso, o uso de luz branca para desencadear a reação do cross-linking resulta em um branqueamento limitado de proteínas fluorescentes e permite a formulação de hidrogel composto com marcadores fluorescentes (Figura 1). Outros métodos de formação de hidrogel à base de proteínas usam cross-linking baseado na SpyTag-SpyCatcher interação covalente16, amina do cross-linking através do glutaraldeído13ou estreptavidina-biotina interações17.
Análise mecânica dinâmica (DMA) é atualmente uma técnica amplamente utilizada para o estudo baseados em polímeros de hidrogel13,18. Enquanto o DMA pode aplicar força constante protocolos de biomateriais, requer o módulo de Young sobre 10 kPa e amostra de grandes volumes de mais de 200 µ l19. Devido a essas limitações, hidrogel de proteína é geralmente muito mole ser investigado por esta técnica. Como polyproteins engenharia são mais difíceis de sintetizar do que os polímeros, desde que eles exigem um sistema vivo para produzir, tão elevados volumes são ineficientes, as melhores4,15. Além disso, a maioria dos tecidos biológicos são mais macios do que a 10 kPa. Várias abordagens foram desenvolvidas para amostras biológicas, especialmente no estudo do músculo elasticidade20,21. Essas técnicas também pode operar sob o gabarito para aplicar a força constante mas são otimizadas para amostras com pequenos diâmetros (na faixa de mícron) expostos para forçar para muito curto vezes (normalmente menos de 1 s).
Hidrogel à base de proteínas com êxito foram estudadas com técnicas rheometrie modificados. Por exemplo, lançar o hidrogel em forma de anel permite o uso de extensional rheometrie para medir a mudança na força experiente em função da extensão4,22. Outras abordagens para estudar as propriedades reológicas de hidrogel à base de proteínas usam rheometrie de tensão de cisalhamento controlado. Essas técnicas também podem atingir o volume de amostra baixa e tolerar materiais macios. No entanto, estes métodos falta a capacidade de imitar a puxar força que causa proteína desdobramento na vivo, e módulo de Young é calculado com base em teorias complexas que requerem várias suposições e correções23.
Recentemente informamos uma nova abordagem que utiliza um pequeno volume de proteínas, polimerizado dentro de tubos com diâmetros < 1 mm. Nossa primeira aplicação desta técnica estava operando no modo de comprimento-braçadeira, onde o gel foi prorrogado seguindo o protocolo desejado15. Neste método, as proteínas experimentam uma mudança contínua na extensão e força enquanto domínios de desdobram, fazendo a interpretação de dados complicado. Recentemente, informamos uma nova técnica de rheometrie força-braçadeira, onde um laço de realimentação pode expor hidrogel de baixo volume de proteína para um protocolo predefinido força7 (Figura 2). Um sistema PID analógico compara a força medida pelo sensor de força com o set point enviado do computador e ajusta a extensão do gel, movendo a bobina de voz para minimizar a diferença entre as duas entradas. Este ‘aperto’ da força agora permite novos tipos de experimentos para medir a biomecânica de hidrogel de proteína.
No modo de força-rampa, um proteína ancorada hidrogel experiências um constante aumento e diminuição de força com o tempo. O PID que compensa qualquer deformação viscoelástico alterando a extensão de uma forma não-linear, dependendo do tipo de formulação proteína e hidrogel. A principal vantagem da rampa de força é o que permite a quantificação dos parâmetros padrão, tais como o módulo de Young e dissipação de energia, devido a um desdobramento e dobrar de domínios da proteína.
No modo constante de força, a força aplicada muda de forma passo-como. Neste modo, o gel se estende e contratos elasticamente quando a força é aumentada ou diminuída, respectivamente, seguido por uma deformação dependente do tempo. Esta deformação de viscoelástico, ocorrendo enquanto o gel experimenta uma força constante, está diretamente relacionada ao domínio desdobramento/dobrar. De forma simplificada, esta extensão pode ser vista como o equivalente a vários milhares de milhões de vestígios de única molécula média juntos e medido de uma só vez. Constante-força protocolos podem ser usados para estudar a fluência e relaxamento de hidrogel de proteína em função da força e tempo. Em função da força, para proteína baseada em BSA hidrogel, recentemente mostramos que há uma dependência linear entre o elástico e viscoelástico extensão e recolhimento com a tensão aplicada7.
Aqui detalhamos a operação de um rheometer força-braçadeira usando géis compostos feitos de uma mistura de proteína L (8 domínios24, retratado como L8) e uma construção de proteína L-eGFP (L-eGFP), que torna o hidrogel global fluorescente e fácil demonstre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos uma técnica de rheometrie de força-braçadeira para investigar a resposta biomecânica de hidrogel à base de proteínas de baixo volume. Além disso, um protocolo é fornecido para sintetizar uma amostra de hidrogel uniforme proteína cilíndrica de baixo volume. Um protocolo também é apresentado o que descreve como amarrar tipos diferentes de hidrogel à base de proteínas com diferentes elasticidades sem causar qualquer deformação mecânica ou dano às amostras de hidrogel à base de proteínas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o apoio financeiro da iniciativa de pesquisa crescimento (prêmio n º 101 X 340), National Science Foundation, programa de instrumentação de pesquisa principais (Grant no. PHY-1626450), maior fundação de Milwaukee (prêmio Shaw) e o sistema de Universidade de Wisconsin (bolsa de pesquisa aplicada).
Materials
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
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