ליפוזומים antigenic לדור של נוגדנים מחלות ספציפיות
Summary
המתואר הוא הכנת חלקיקים liposomal antigenic והשימוש שלהם עירור תאי B הפעלה במבחנה וב -vivo. תגובות נוגדנים חזקים ועקביים הוביל את הפיתוח של מודל חדש של אלרגיה לבוטנים. הפרוטוקול עבור יצירת ליפוזומים antigenic ניתן להרחיב אנטיגנים שונים ומודלים חיסונים.
Abstract
תגובות נוגדנים לחסינות קריטי מגן מגוון רחב של פתוגנים. יש עדיין עניין גבוהה על מנת לייצר נוגדנים חזקים לקבלת חיסון כמו גם להבין נוגדנים פתוגניים איך לפתח תגובות אלרגיות ומחלות אוטואימוניות. יצירת תגובות חזקות נוגדן אנטיגן ספציפי אינה טריוויאלית תמיד. במודלים של העכבר, זה דורש לעיתים קרובות מספר סיבובים של החיסונים עם אדג’וונט שמוביל כמות גדולה של השתנות רמות נוגדנים המושרה. דוגמה אחת היא במודלים של העכבר של אלרגיות בוטנים שם יותר חזקים לשחזור דגמים למזער מספרים העכבר ושימוש אדג’וונט יהיה מועיל. המוצג כאן הוא מודל העכבר מאוד לשחזור של אלרגיה לבוטנים אנפילקסיס. זה הדגם החדש מתבסס על שני גורמים מרכזיים: splenocytes (1) אנטיגן ספציפי הם adoptively מ רגיש-בוטן העכבר לתוך עכבר תמים הנמען, נרמול המספר של אנטיגן ספציפי זיכרון ו- T-לימפוציטים על פני מספר רב של עכברים; עכברים הנמען (2) הן לאחר מכן שיפרה עם immunogen multivalent חזק בצורה של חלקיקים liposomal הצגת האלרגן בוטנים הגדולות (Ara h 2). היתרון העיקרי של מודל זה הוא הפארמצבטית שלה, אשר בסופו של דבר מפחיתה את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים במחקר כל, תוך צמצום מספר החיות מקבלים זריקות מרובות של אדג’וונט. מכלול מודולרי של אלה ליפוזומים immunogenic מספק הסתגלות יחסית נתיישב דגמים אחרים אלרגי או אוטואימוניות המערבות נוגדנים פתוגניים.
Introduction
אלרגיה למזון משפיע על 8% של ילדים בארצות הברית, עלה בשכיחות במהלך העשור1. אלרגיה בוטנים משפיע על 1% של ילדים ואינו בדרך כלל גדולים מדי.2. למרות מספר ניסויים קליניים מבטיח נערכים לטיפול של אלרגיה למזון, כולל אוראלי חיסוני (אוקיאנה), sublingual חיסוני (חריץ) חיסוני epicutaneous (EPIT), יש כיום אין טיפול שאושרו על-ידי ה-FDA אסטרטגיות עבור הרגישות יחידים בוטנים-אלרגית3,4,5,6,7,8. לכן, אנשים אלרגית אך ורק עליך להימנע אלרגנים להתחמק אנפילקסיס. שאלות רבות נותרו לגבי מסלולים של רגישות עולה, שבבסיס מנגנוני התפתחות אלרגיה למזון.
העכבר הן כלי רב ערך עבור הלומדים את המנגנונים של אלרגיה, כמו גם פיתוח חדש tolerogenic הקהיה טיפולים9,10,11,12. זה נכון במיוחד כי האלרגן בוטנים הגדולות (Ara h 2; Ah2) אצל בני אדם הוא גם האלרגן דומיננטי בכמה תיאר העכבר מודלים13,14. בעוד העכבר מודלים של אלרגיה לבוטנים בפז בלימוד מנגנונים של רגישות עולה וסובלנות, חיסרון הוא כי הם יכולים להיות משתנה, דורשים שימוש adjuvants. Immunogens יותר חזק תהיה דרך אחת כדי למזער את ההשתנות מהותי של מודל שכזה. מאז B-תאים מופעלים בחוזקה על ידי אנטיגנים multivalent, ליפוזומים antigenic הצגת האלרגן הם אפשרות טובה בשל יכולתם להפעלת פוטנציאל תאי-B באמצעות הקולטן B-cell (BCR), בעוד גם יש את המאפיין של יעילות הטרמה תא T-cell דרך נלקח הלא ספציפית על ידי אנטיגן תאים.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור conjugating חלבונים אנטיגניים כדי liposomal חלקיקים באמצעות אסטרטגיה נתיישב ומודולרית. שימוש של הפונדקאית אנטיגן, מקטע Fab אנטי-IgM, נדגים כיצד חזק ליפוזומים antigenic כזה יכול להיות מגרה הפעלה B-cell. ליפוזומים antigenic הצגת אנטיגן Ah2 שימשו כדי לפתח מודל חדש עכבר שהוענקו רגישות. במודל זה, splenocytes מן מאומת עכברים אלרגית בוטנים, המכיל בוטנים ספציפיות זיכרון ו- T-לימפוציטים, מועברים לתוך תמים congenic עכברים. תגובות נוגדנים זיכרון הם המושרה על ידי הזרקה של ליפוזומים מצומדת עם Ah2 לתוך העכברים הנמען, לשם הפקת נוגדנים נגד Ah2. ואחריו דחיפה אחת בלבד עם Ah2 מסיסים, נוגדנים ספציפיים Ah2 להצמיח אנפילקטי תגובה חזקה כאשר אלו עכברים מאותגרים לאחר מכן עם Ah2. עכברים שעברו התגובה האלרגית מגיבים בצורה מאוד אחידה, לא קיבלו את אדג’וונט, גישה זו הוא מודל רצוי אלרגיה לבוטנים, התוצאות מציע כי זה יכול להיות כלי במודלים אחרים של העכבר מונע על ידי אנטיגנים מכוונת אלרגנים ואולי גם autoantigens.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות המתוארות כאן הם עבור הבניין של חלבון כדי ליפופרוטאין אשר מאפשר את התצוגה של החלבון על חלקיקים liposomal פרוטוקול כללי. חלבונים יחידה משנית ריבוי גדול מאוד, פרוטוקול זה תהיה מוגבלת השירות. השיטה האידיאלי יהיה המבוא של תג בייעודי לאתר המאפשר אסטרטגיה כימי biorthogonal קישור לשמש. אם המבטאת את ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים משרד ההגנה (W81XWH-16-1-0302 ו- W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
- Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
- Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
- Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
- Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
- Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
- Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
- Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
- Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
- Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
- Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
- Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
- Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
- Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
- Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
- Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
- Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
- Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
- Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
- LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
- Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
- Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
- Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
- Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
- Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
- Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).
