Antijenik lipozomlar hastalığa özgü antikorların üretimi için
Summary
Açıklanan antijenik liposomal nano tanecikleri ve kullanımları uyarıcı B-hücre harekete geçirmek vitro ve in vivohazırlıktır. Tutarlı ve güçlü antikor yanıt-e doğru yeni bir fıstık alerjisi model gelişmesine yol açtı. Antijenik lipozomlar oluşturmak için protokol farklı antijenleri ve bağışıklama modeller için genişletilebilir.
Abstract
Antikor yanıt patojenlerin geniş bir dizi kritik koruyucu bağışıklık sağlar. Aşılama nasıl patojen antikor yanıt-e doğru geliştirmek alerjileri ve otoimmün hastalığı anlamak yanı sıra güçlü antikor üreten bir yüksek ilgi kalır. Sağlam antijen spesifik antikor yanıt üreten her zaman önemsiz değildir. Fare modellerinde bu kez Aşı indüklenen antikor düzeyleri değişkenlik büyük bir yol açar adjuvan ile birden fazla mermi gerektirir. Fıstık alerjisi nerede fare numaraları ve adjuvan kullanımını en aza indirmek daha sağlam ve tekrarlanabilir modelleri faydalı olacağını fare modellerinde bir örnektir. Burada sunulan bir çok tekrarlanabilir fare fıstık alerjisi anafilaksi modeldir. Bu yeni model iki önemli faktöre dayanıyor: (1) antijen spesifik splenocytes adoptively aktarılır bir fıstık hassas fare fareler; büyük bir takım karşısında antijen spesifik bellek B ve T hücrelerinin sayısı normale saf alıcı fare içine ve (2) alıcı fareler daha sonra büyük fıstık allerjen (Ara h 2) görüntüleme liposomal nano tanecikleri şeklinde güçlü multivalent immunogen ile artırdı. Bu model büyük avantajı sonuçta birden çok adjuvan enjeksiyonlari alma hayvan sayısını en aza indirirken her çalışmada kullanılan hayvan sayısını düşürür, tekrarlanabilirlik olmasıdır. İmmunojenik Bu lipozomlar modüler montaj patojenik antikorlar içeren diğer alerjik ya da otoimmün modelleri için nispeten facile uyum sağlar.
Introduction
Besin allerjisi ABD çocuklarda % 8’i etkiler ve yaygınlığı son artmıştır on yıl1. Fıstık alerjisi çocuk % 1’i etkiler ve genellikle geçmek2değil. Birkaç umut verici klinik çalışmalarda oral immünoterapi (OIT), sublingual immünoterapi (yırtık) ve epicutaneous immünoterapi (EPIT), dahil olmak üzere gıda alerji tedavisi için devam etmektedir rağmen orada şu anda yok FDA onaylı tedavi stratejileri Fıstık alerjisi bireyler3,4,5,6,7,8desensitizing için. Bu nedenle, Alerjik kişiler kesinlikle alerjenler anafilaksi önlemek için kaçınmak gerekir. Çok soru Sensitizasyonu yolları ile ilgili olarak ve mekanizmaları gıda Anti gelişiminin temel kalır.
Fare modelleri Anti mekanizmaları eğitim hem de yeni tolerogenic ve duyarsızlaştırma terapiler9,10,11,12geliştirmek için değerli bir araç vardır. Bu özellikle doğrudur çünkü büyük fıstık allerjen (Ara h 2; Ah2) insanlarda olduğunu da birkaç baskın alerjen açıklanan fare modelleri13,14. Fıstık alerjisi fare modelleri mekanizmaları Sensitizasyonu ve hoşgörü eğitim çok değerli olmakla birlikte, bir onlar değişken olabilir ve adjuvan kullanımını gerektiren dezavantajıdır. Daha güçlü immunogens modelleri gibi içsel değişkenliği en aza indirmek için bir yol olurdu. B-hücreleri şiddetle multivalent antijenleri tarafından etkinleştirilir beri antijenik lipozomlar alerjen görüntüleme yeteneklerini nedeniyle potansiyel olarak B-hücreleri de mülkiyeti verimli bir şekilde sahip iken B hücre reseptörü (BCR) etkinleştirmek için iyi bir seçenek vardır Özellikle antijen-sunarak alınan ile T-hücre bölmesi priming hücreleri.
Burada, protein antijenleri için facile ve modüler bir strateji kullanarak liposomal nano tanecikleri conjugating için detaylı bir protokol açıklayın. Kullanarak bir vekil antijen, anti-IgM Fab parçası, biz göstermek nasıl güçlü antijenik böyle lipozomlar uyarıcı B-hücre harekete geçirmek içinde olabilir. Antijenik lipozomlar toplam sayı Ah2 antijen bir yeni doğan duyarlılık fare modeli geliştirmek için kullanıldı. Bu modelde, splenocytes fıstık özel bellek B ve T hücreleri, içeren doğrulanmadı fıstık alerjisi fareler gelen saf congenic fareler aktarılır. Bellek antikor yanıt Ah2 karşı antikor ikna etmek için alıcı fareler Ah2 ile Birleşik lipozomlar enjeksiyon tarafından indüklenir. Ne zaman bu fareler daha sonra Ah2 ile meydan çözünür Ah2 ile tek bir artırmak ardından, Ah2 özel antikorlar neden bir güçlü anafilaktik yanıt-e doğru olmaktadır. Alerjik reaksiyon geçiren fareler son derece düzgün bir şekilde yanıt ve bir adjuvan almadım, bu yaklaşım bir arzu fıstık alerjisi modeldir ve sonuçları bu yardımcı programı diğer fare modelleri yönelik antijenleri ile tahrik olabilir öneririz alerjenler ve muhtemelen autoantigens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada özetlenen bir protein için protein liposomal nano tanecikleri üzerinde görüntülenmesini sağlayan bir lipid konjugasyon için genel bir iletişim kuralı yöntemlerdir. Çok büyük çok alt birim proteinler için bu protokolü yardımcı programını sınırlı olabilir. İdeal Yöntem bir biorthogonal kimyasal bağlanma strateji kullanılmak üzere sağlayan bir siteye özgü etiket getirilmesi olacaktır. Protein recombinantly ifade, bu mevcut siteye özgü stratejileri17ve fonksiy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma hibe (W81XWH-16-1-0302 ve W81XWH-16-1-0303) Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
- Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
- Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
- Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
- Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
- Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
- Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
- Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
- Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
- Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
- Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
- Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
- Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
- Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
- Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
- Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
- Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
- Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
- Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
- LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
- Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
- Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
- Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
- Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
- Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
- Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).
