疾患特異的抗体の生成のための抗原性リポソーム
Summary
説明は、抗原のリポソーム化ナノ粒子と刺激的な B 細胞活性化の in vitroとin vivoでの使用の準備です。一貫性と堅牢な抗体は、ピーナッツ アレルギーの新しいモデルの開発につながった。抗原性リポソームの生成のためのプロトコルは、異なる抗原と免疫モデルに拡張できます。
Abstract
抗体は病原体の広い配列に重要な防御免疫を提供します。ワクチン接種と同様どの病原性抗体反応をアレルギーと自己免疫疾患の開発の理解のための堅牢な抗体の生成に対する関心の高さが残っています。堅牢な抗原特異的抗体を生成する常に簡単ではありません。マウス モデルで多くの場合予防接種による抗体のレベルの変動の大きなにつながるアジュバントの複数のラウンドが必要です。一例は、マウス番号と補助の使用を最小限に抑えるより堅牢かつ再現性のあるモデルが有益であろうピーナッツ アレルギーのマウス ・ モデルであります。ここで紹介はピーナッツ アレルギーのアナフィラキシーの再現性の高いマウス モデルです。この新しいモデルは、2 つのキーファクターに依存している: (1) 抗原特異的脾細胞が素朴な受信者マウス、マウスを用いての多数にわたって抗原特異的メモリー B および T 細胞数の正規化にピーナッツ感作マウスから転送に対して(2) の受信者のマウスはその後 (Ara h 2) 主要なピーナッツ アレルゲンを表示するリポソームの粒子の形で強力な多価免疫で昇圧され.このモデルの主な利点はその再現性、最終的にアジュバントの複数の注射を受けた動物の数を最小限に抑えながら、それぞれの研究で使用される動物の数が減ります。これらの免疫原性リポソームのモジュラー アセンブリは、病原性の抗体を含む他のアレルギーや自己免疫モデルに比較的安易な適応性を提供します。
Introduction
食物アレルギーは、アメリカ合衆国の子供の 8% に影響を与えるし、過去の有病率の増加している 10 年1。ピーナッツ アレルギーは、子供の 1% に影響を与える、通常小さくなった2ではありません。いくつかの有望な臨床試験が進行中である経口免疫療法 (OIT)、舌下免疫療法 (スリット)、皮膚免疫療法 (EPIT) など、食物アレルギーの治療のため現在はありません FDA 承認の治療戦略ピーナッツ アレルギーの個人3,4,5,6,7,8脱感作。そのため、アレルギーの個人は厳密にアナフィラキシーを回避するためにアレルゲンを避ける必要があります。多くの質問は、感作のルート、食品アレルギー疾患発症のメカニズムを基になるまま。
マウスのモデルは、新しい免疫寛容と脱感作療法9,10、11,12の開発し同様、アレルギーのメカニズムを勉強のための貴重なツールです。これは特に、主要なピーナッツ アレルゲン (Ara h 2;Ah2) 人間にはまたいくつかの支配的なアレルゲン説明マウス モデル13,14。ピーナッツ アレルギーのマウス ・ モデル、感作性と耐性のメカニズムの研究に貴重な欠点は、ことができます変数やアジュバントの使用が必要です。強力な混合は、このようなモデルの本質的な可変性を最小限に抑える 1 つの方法でしょう。B 細胞は強く、多価抗原によって活性化、アレルゲンを表示する抗原のリポソームが良いオプションも効率的のプロパティを持つ、B 細胞の受容器 (BCR) を介して B 細胞を有効に可能性があります機能のため抗原提示によって非具体的に取り上げられているから T 細胞コンパートメントをプライミング細胞。
ここでは、安易なモジュラー方式リポソームのナノ粒子への蛋白質の抗原の結合のための詳しいプロトコルについて述べる。サロゲート抗原、抗 igm 抗体 Fab フラグメントを使用して、ことを示すこのような抗原のリポソームが刺激的な B 細胞の活性化にすることができますどのように強力な。Ah2 抗原を表示する抗原のリポソームは、授与の感度の新しいマウスモデルの開発に使用されました。このモデルでピーナッツ固有のメモリ B と T-細胞を含む検証のピーナッツ アレルギー マウスの脾細胞は素朴なコンジェニック マウスに転送されます。Ah2 に対する抗体を誘導するために受信者のマウスに共役 Ah2 とリポソームの注入によるメモリ抗体が誘導されます。水溶性 Ah2 で 1 つだけのブーストによって続かれて、Ah2 特異的抗体を生じ強いアナフィラキシー反応これらのマウスはその後 Ah2 に立ち向かっているとき。このアプローチは、望ましいピーナッツ アレルギー モデルと成果に向けられた抗原によって駆動される他のマウスモデルのユーティリティがあると示唆しているアレルギー反応を受けているマウスが均一な方法で応答、アジュバントを受け取っていません。アレルゲンになり自己抗原。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は、タンパク質脂質リポソーム型ナノ粒子上で、蛋白質の表示を可能にするための一般的なプロトコルです。非常に大きい複合体タンパク質の場合は、このプロトコルにユーティリティを制限されています。理想的な方法は、使用する直交化学リンク戦略を可能にするサイト固有タグの導入でしょう。Recombinantly 蛋白質を表現する、市販されているペグインターフェロン?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国防総省 (W81XWH-16-1-0302 と W81XWH-16-1-0303) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
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