Antigenen Liposomen für Generation krankheitsspezifische Antikörper
Summary
Beschrieben, ist die Vorbereitung von Antigenen liposomalen Nanopartikeln und ihre Verwendung in anregenden B-Zell Aktivierung in Vitro und in Vivo. Konsistente und robuste Antikörperantworten führte zur Entwicklung eines neuen Modells der Erdnuss-Allergie. Das Protokoll zur Erzeugung von Antigenen Liposomen kann auf verschiedene Antigene und Immunisierung Modelle ausgedehnt werden.
Abstract
Antikörperantworten bieten wichtige schützende Immunität auf ein breites Spektrum von Krankheitserregern. Es bleibt ein hohes Interesse bei der Schaffung von robusten Antikörper für die Impfung sowie wie pathogenen Antikörper verstehen, Antworten zu Allergien und Autoimmunkrankheiten zu entwickeln. Robuste Antigen-spezifischen Antikörper-Reaktionen zu erzeugen, ist nicht trivial. In Mausmodellen bedarf es oft mehrere Runden von Impfungen mit Adjuvans, die zu viel Variabilität in der Höhe der induzierten Antikörper führt. Ein Beispiel ist in Mausmodellen von Erdnuss-Allergien wo stabile und reproduzierbare Modelle, die Maus Zahlen und den Einsatz der adjuvanten minimieren vorteilhaft wäre. Präsentiert hier ist eine hoch reproduzierbare Mausmodell der Erdnuss-Allergie Anaphylaxie. Dieses neue Modell stützt sich auf zwei Faktoren: (1) Antigen-spezifische Splenocyten sind adoptively von einer Erdnuss sensibilisiert Maus übertragen, in eine naive Empfänger Maus, normalisieren die Anzahl von Antigen-spezifische B- und T-Zellen über eine große Anzahl von Mäusen; und (2) Empfänger Mäuse anschließend mit einem starken multivalente Immunogen in Form von liposomalen Nanopartikel, die Anzeige der wichtigsten Erdnuss Allergens (Ara h 2) gesteigert werden. Der große Vorteil dieses Modells ist die Reproduzierbarkeit, die letztlich die Anzahl der verwendeten Tiere in jeder Studie, bei gleichzeitiger Minimierung der Anzahl der Tiere erhalten mehrere Injektionen der adjuvanten senkt. Der modulare Aufbau dieser immunogenen Liposomen bietet relativ einfache Anpassungsfähigkeit zu anderen allergischen oder Autoimmun-Modelle, die pathogenen Antikörper beinhalten.
Introduction
Nahrungsmittel-Allergie betrifft 8 % der Kinder in den Vereinigten Staaten, und stieg in der Prävalenz in den vergangenen zehn Jahren1. Allergie gegen Erdnuss betrifft 1 % der Kinder und ist nicht in der Regel entwachsen2. Obwohl mehrere vielversprechende klinische Studien sind im Gange für die Behandlung von Nahrungsmittelallergien, einschließlich oraler Immuntherapie (OIT), sublinguale Immuntherapie (SLIT) und Epicutan Immuntherapie (EPIT), gibt es derzeit keine FDA-zugelassene Behandlungsstrategien für die Desensibilisierung Erdnuss-Allergiker3,4,5,6,7,8. Daher müssen allergische Personen Allergene zur Vermeidung von Anaphylaxie strikt vermeiden. Es bleiben viele Fragen in Bezug auf Routen der Sensibilisierung und zugrundeliegende Mechanismen der Lebensmittel-Allergie-Entwicklung.
Maus-Modellen sind ein wertvolles Werkzeug für die Mechanismen der Allergie zu studieren sowie die Entwicklung neuer tolerogene und Desensibilisierung Therapien9,10,11,12. Dies gilt vor allem weil die großen Erdnuss Allergen (Ara h 2; Ah2) beim Menschen ist auch das dominierende Allergen in mehreren beschrieben Maus Modelle13,14. Während Mausmodelle der Erdnuss-Allergie bei der Untersuchung der Mechanismen der Sensibilisierung und Toleranz von unschätzbarem Wert sind, ist ein Nachteil, dass sie können variabel sein und erfordern den Einsatz von Hilfsstoffen. Potentere immunogenen wäre eine Möglichkeit, die innere Variabilität solcher Modelle zu minimieren. Da B-Zellen stark durch multivalente Antigene aktiviert sind, sind Antigene Liposomen anzeigen das Allergen eine gute Wahl wegen ihrer Fähigkeit, potentiell B-Zellen durch die B-Zell-Rezeptor (BCR) aktivieren, während auch die Eigenschaft des effizient Grundieren die T-Zell-Fach durch unspezifisch durch Antigen-präsentierenden aufgegriffen wird Zellen.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für Konjugation Protein-Antigene, liposomale Nanopartikel mit einer einfache und modulare Strategie. Mit einem Ersatz-Antigen, Anti-IgM-Fab-Fragment, wir zeigen wie stark solche Antigenen Liposomen können in anregenden B-Zell-Aktivierung werden. Antigene Liposomen anzeigen Ah2 Antigen wurden verwendet, um ein neues Mausmodell der übertragenen Sensibilität zu entwickeln. In diesem Modell sind Splenocyten von verifizierten Erdnuss allergische Mäuse, mit Erdnuss-spezifische Speicher B- und T-Zellen, in naiven Congenic Mäuse übertragen. Speicher-Antikörper-Reaktionen werden durch Injektion von Liposomen in den Empfänger Mäuse, um Antikörper gegen Ah2 induzieren mit Ah2 konjugierten induziert. Gefolgt von nur einen Schub mit löslichen Ah2, geben Ah2-spezifische Antikörper Anlass zu einer starken anaphylaktischen Reaktion, wenn diese Mäuse anschließend mit Ah2 herausgefordert werden. Wie Mäuse durchläuft die allergische Reaktion sehr einheitlich reagieren und Adjuvans nicht erhalten haben, dieser Ansatz ist eine wünschenswerte Erdnuss-Allergie-Modell und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es in anderen getrieben durch Antigene gerichtet an Mausmodellen Dienstprogramm möglicherweise Allergene und möglicherweise Autoantigene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Methoden sind ein allgemeines Protokoll für die Konjugation eines Proteins, ein Lipid ermöglicht die Anzeige des Proteins auf liposomalen Nanopartikel. Für sehr große Multi-Untereinheit Proteine kann dieses Protokoll Dienstprogramm begrenzt. Die ideale Methode wäre die Einführung eines Site-spezifische Tags, mit dem ein Biorthogonal chemische Verknüpfungsstrategie verwendet werden können. Wenn das Protein rekombinant zum Ausdruck zu bringen, ist dies möglich mit verfügbaren standortspezif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (W81XWH-16-1-0302 und W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
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