Liposomas antigénicos para la generación de anticuerpos específicos de la enfermedad
Summary
Descrito es la preparación de nanopartículas liposómicos antigénicas y su uso en estimular la activación de células B en vitro e in vivo. Respuestas de anticuerpos consistente y robusto condujeron al desarrollo de un nuevo modelo de la alergia del cacahuete. El protocolo para la generación de liposomas antigénicas puede ampliarse a los diferentes antígenos y vacunas.
Abstract
Respuestas de anticuerpos proporcionan inmunidad protectora crítica a una amplia gama de patógenos. Existe un gran interés en la generación de anticuerpos robustos para la vacunación, así como entender cómo patógeno anticuerpo respuestas desarrollan alergias y enfermedades autoinmunes. Generar respuestas de anticuerpos específicos del antígeno robusta no es siempre trivial. En modelos de ratón, a menudo requiere múltiples rondas de inmunización con adyuvante que conduce a una gran cantidad de variabilidad en los niveles de anticuerpos inducidos. Un ejemplo es en modelos de ratón de alergia a los cacahuates en modelos más robustos y reproducibles que minimicen el número de ratón y el uso de adyuvante sería beneficiosos. Presentado aquí es un modelo de ratón altamente reproducible de anafilaxis alergia del cacahuete. Este nuevo modelo se basa en dos factores clave: (1) específica de antígeno esplenocitos eventualmente se transfieren de un ratón sensibilizado de maní en un ratón receptor ingenuo, normalizando la cantidad de memoria específica de antígeno las células B y T a través de un gran número de ratones; y ratones receptores (2) posteriormente se refuerzan con un fuerte inmunógeno multivalente en forma de nanopartículas liposómicos mostrando el alergénico principal del cacahuete (Ara h 2). La gran ventaja de este modelo es su reproducibilidad, que en última instancia, disminuye el número de animales utilizados en cada estudio, al tiempo que minimiza el número de animales que recibieron las inyecciones múltiples de adyuvante. El montaje modular de estos liposomas inmunogénicas proporciona relativamente fácil adaptabilidad a otros modelos alérgicas o autoinmunes que involucran anticuerpos patógenos.
Introduction
La alergia alimentaria afecta al 8% de los niños en los Estados Unidos y prevalencia se ha incrementado en los últimos decenio1. Alergia al maní afecta a 1% de los niños y no es típicamente pequeño2. Aunque varios prometedores ensayos clínicos están en marcha para el tratamiento de la alergia alimentaria, incluyendo inmunoterapia oral (OIT), la inmunoterapia sublingual (SLIT) y epicutánea inmunoterapia (EPIT), actualmente no hay estrategias de tratamiento aprobado por la FDA para individuos alérgicos a cacahuete3,4,5,6,7,8de desensibilización. Por lo tanto, personas alérgicas deben evitar estrictamente los alergenos para evitar la anafilaxia. Quedan muchos interrogantes en cuanto a vías de sensibilización y subyacente a los mecanismos de desarrollo de alergia alimentaria.
Modelos de ratón son una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos de la alergia, así como desarrollar nuevos tolerogénicas y desensibilización terapias9,10,11,12. Esto es particularmente cierto porque el alergénico principal del cacahuete (Ara h 2; Ah2) en seres humanos es también el alergeno dominante en varios descrito ratón modelos13,14. Mientras que los modelos de ratón de la alergia del cacahuete son invaluables en el estudio de los mecanismos de sensibilización y tolerancia, una desventaja es que puede ser variable y requieren el uso de adyuvantes. Inmunógenos más potente sería una forma de minimizar la variabilidad intrínseca de dichos modelos. Puesto que las células de B son fuertemente activadas por antígenos multivalentes, liposomas antigénicas mostrando el alérgeno son una buena opción debido a su capacidad para potencialmente activar células B a través de los receptores de células B (BCR) mientras que también tiene la propiedad de manera eficiente el compartimiento de las células T a través de ser tomado no específica de antígeno-presentación de cebado las células.
Aquí, describimos un protocolo detallado para antígenos de la proteína a la nanopartículas mediante una estrategia modular y fácil de conjugar. Utilizando un antígeno de suplente, fragmento Fab de anti-IgM, demostramos cómo potente estos liposomas antigénicas pueden ser en la activación de células B estimulante. Liposomas antigénicas con Ah2 antígeno fueron usados para desarrollar un nuevo modelo de ratón de confiere sensibilidad. En este modelo, los esplenocitos de ratones alérgicas cacahuetes verificadas, que contienen cacahuete específica memoria células B y T, se transfieren a ratones Congénicos de ingenuo. Inyección de liposomas conjugados con Ah2 en los ratones receptores, con el fin de inducir anticuerpos contra Ah2 induce respuestas de anticuerpos de memoria. Seguido por un único impulso con Ah2 soluble, anticuerpos específicos Ah2 dan lugar a una fuerte respuesta anafiláctica cuando estos ratones son desafiados posteriormente con Ah2. Ratones sometidos a la reacción alérgica responden de manera más uniforme y no han recibido un adyuvante, este enfoque es un modelo de alergia del cacahuete deseable y los resultados sugieren que puede tener utilidad en otros modelos de ratón impulsados por antígenos dirigidos a alérgenos y posiblemente autoantígenos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos descritos aquí son un protocolo general para la conjugación de una proteína a un lípido que permite la visualización de la proteína en nanopartículas liposómicos. Para proteínas de multi-subunidades muy grandes, este protocolo puede haber limitado utilidad. El método ideal sería la introducción de una etiqueta específica que permite una estrategia de enlace químico biorthogonal ser utilizado. Si expresan la proteína por vía recombinante, esto puede ser posible utilizando estrategias específi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por becas del Departamento de defensa (W81XWH-16-1-0302 y W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
- Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
- Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
- Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
- Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
- Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
- Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
- Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
- Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
- Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
- Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
- Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
- Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
- Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
- Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
- Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
- Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
- Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
- Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
- LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
- Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
- Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
- Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
- Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
- Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
- Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).
