Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Antineoplastic दवाओं द्वारा विरोधी एंटीबॉडी प्रभावकारिता की Potentiation: एंटीबॉडी-ड्रग सिनर्जी संयोजन सूचकांक समीकरण का उपयोग कर का पता लगाने

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58291
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, *1, *1,3, *1,3
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे चाऊ और Talalay के संयोजन सूचकांक समीकरण का उपयोग करके नैदानिक मॉडल में एक विरोधी एंटीबॉडी और antineoplastic दवाओं के बीच तालमेल का आकलन करने के लिए ।

Abstract

कीमोथेरेपी एजेंटों द्वारा शत्रुतापूर्ण मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) के Potentiation कैंसर के खिलाफ प्रभावी और सुरक्षित चिकित्सा डिजाइनिंग के लिए एक मूल्यवान रणनीति का गठन किया । यहाँ हम नैदानिक कदम पर एक तर्कसंगत संयोजन की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. सबसे पहले, हम विरोधी मॉब और साइटोटोक्सिक दवाओं के बीच तालमेल का आकलन करने के लिए एक सेल-आधारित परख का वर्णन करते हैं, जो चाऊ और Talalay1के संयोजन सूचकांक समीकरण का उपयोग करता है । यह ट्यूमर सेल दवा का मापन शामिल है-और एंटीबॉडी-एक MTT परख का उपयोग कर संवेदनशीलता, संयोजन सूचकांक (CI) मूल्यों की गणना करने के लिए एक स्वचालित कंप्यूटर विश्लेषण के बाद । < 1 के CI मूल्यों का परीक्षण mAbs और साइटोटोक्सिक एजेंटों1के बीच तालमेल से संकेत मिलता है । vivo मेंइन विट्रो निष्कर्षों को पुष्ट करने के लिए, हम आगे एक xenograft ट्यूमर मॉडल में संयोजन आहार प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन । इस मॉडल में, संयुक्त आहार काफी देरी ट्यूमर विकास, जो एकल एजेंट नियंत्रण की तुलना में एक महत्वपूर्ण विस्तारित अस्तित्व में परिणाम है । महत्वपूर्ण बात, vivo प्रयोग में पता चलता है कि संयोजन आहार अच्छी तरह से सहन किया है । इस प्रोटोकॉल नैदानिक मॉडल में विरोधी दवा संयोजन के प्रभावी मूल्यांकन और तर्कसंगत संयोजन की पहचान नैदानिक परीक्षणों में मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है ।

Introduction

कैंसर के विभिंन प्रकार की एक बड़ी संख्या के उपचार में पारंपरिक दृष्टिकोण मोनोथेरापी पर आधारित था । यहां तक कि अगर यह अभी भी कई मामलों में प्रयोग किया जाता है, इस विधि कई संयुक्त उपचार2के लिए चुनने के लिए अग्रणी बाधाओं से मुलाकात की । विशेष रूप से, कैंसर की कोशिकाओं को और अधिक प्रतिरोध जब वैकल्पिक जीवन रक्षा तंत्र3उत्प्रेरण द्वारा एक दवा के साथ इलाज के विकास के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं,4रोगियों में चिकित्सीय विफलता में जिसके परिणामस्वरूप । इसके अलावा, मोनोथेरापी में, दवाओं आमतौर पर एक उच्च खुराक पर administrated हैं । यह स्थिति अक्सर प्रबल खुराक-निर्भर दुष्प्रभावों की घटना में परिणाम है कि असहनीय हो सकता है और चिकित्सकों को उपचार2को रोकने के लिए मजबूर कर सकते हैं । इन कारणों से, विरोधी अणुओं के संघ अब मोनोथेरापी को पसंद है ।

आदर्श दवा संयोजन उन है कि ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ तालमेल में कार्य सामांय कोशिकाओं के खिलाफ वृद्धि की विषाक्तता के बिना, होगा । सिनर्जी दो या अधिक दवाओं है कि एक उपचारात्मक प्रत्येक व्यक्ति को अलग से अभिनय दवा के योग से अधिक प्रभाव पैदा की बातचीत को संदर्भित करता है । इस तरह की बातचीत बढ़ाकर नैदानिक चिकित्सीय प्रभावकारिता2में परिणाम हो सकता है । यह उपचार प्रतिरोध, बढ़ाता है प्रभावकारिता सीमा, और भी विषाक्तता को कम कर सकते हैं2. वास्तव में, प्रत्येक दवा की खुराक विभिन्न मार्ग को लक्षित करके उनके साइड इफेक्ट को कम करने के लिए कम किया जा सकता है. इसके अलावा, अणुओं में से एक भी कैंसर की कोशिकाओं के खिलाफ एक संवेदनशील एजेंट के रूप में सेवा कर सकते हैं । दूसरी दवा का प्रभाव संवेदनशील कोशिकाओं पर बढ़ाया जा सकता है और कम खुराकों5इस्तेमाल किया जा सकता है ।

संयुक्त चिकित्सा में दो या अधिक कीमोथेरेपी दवाओं और/या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के रूप में इस तरह के तर्क,6शामिल कर सकते हैं । इन mAbs विशेष रूप से लक्षित कोशिकाओं के एक सेल सतह प्रतिजन व्यक्त ब्याज की और एंटीबॉडी-निर्भर कोशिका मध्यस्थता cytotoxicity (ADCC) सहित प्रतिरक्षा रास्ते के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं को मारने में सक्षम हैं, प्रतिरक्षा प्रभाव कोशिकाओं की भागीदारी के साथ 7, और पूरक-आश्रित cytotoxicity (सीडीसी)6. वे भी एक गैर प्रतिरक्षा apoptosis8,9,10,11द्वारा मध्यस्थता तंत्र के माध्यम से कार्य कर सकते हैं. इस मामले में, क्रमादेशित सेल मौत की प्रक्रिया की प्रेरण कैंसर की कोशिकाओं को संवेदनशील हो सकता है, उनके समारोह को कमजोर, और संबद्ध कीमोथेरेपी दवा एक कम खुराक पर अधिक प्रभावी बनाते हैं । जैसे, proapoptotic मॉब antineoplastic दवाओं के साथ संयोजन परहेजों डिजाइनिंग के लिए अच्छे उम्मीदवार हैं ।

विभिन्न गणितीय मॉडलों के लिए दवा के तालमेल का आकलन करने के लिए वर्णित किया गया है; उनमें से एक संयोजन अनुक्रमणिका पद्धति1पर आधारित है । इस विधि माध्य-प्रभाव चाऊ1द्वारा विकसित सिद्धांत पर आधारित है । औसत प्रभाव समीकरण इस प्रकार के रूप में दवा खुराक और दवा प्रभाव को संबद्ध ।

Equation 1

यहां, D दवा खुराक है; डीएम औसत प्रभाव खुराक है; एफए खुराक से प्रभावित अंश है; एम एक प्रतिपादक है कि खुराक प्रभाव भूखंड1के आकार का प्रतीक है । औसत प्रभाव खुराक को रोकता है कि एक दवा की खुराक Dx की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है या कोशिकाओं के "एक्स" प्रतिशत को मारता है. CI मान फिर दवा संयोजन के additive प्रभाव का आकलन करने के लिए गणना की जाती है, निम्नानुसार1.

Equation 2

1 का ci मान एक additive प्रभाव इंगित करता है और < 1 के ci मान एक synergistic प्रभाव इंगित करता है, जबकि > 1 का ci मान विरोध1इंगित करता है । इस विधि के आवेदन आगे एक कंप्यूटर प्रोग्राम, CompuSyn की उपलब्धता द्वारा सुविधा है, कि सभी खुराक या प्रभाव स्तर पर सिनर्जी और विरोध निर्धारित करता है स्वचालित रूप से12अनुकरणीय.

हमारे समूह ने ओ-एसिटाइल-GD2 ganglioside (OAcGD2) neuroblastoma antigen13 के लिए विशिष्ट मॉब 8B6 विकसित किया है और आगे यह दर्शाया है कि यह मॉब11apoptosis के गुणों के साथ कोशिका मृत्यु को प्रेरित करने में सक्षम है । परीक्षण करने के लिए कि क्या मॉब 8B6 antineoplastic एजेंट topotecan करने के लिए neuroblastoma कोशिकाओं को संवेदनशील कर सकते हैं, हम चाऊ1द्वारा विकसित ऊपर उल्लेख किया विधि अनुकूलित. सबसे पहले, हम प्रभावी खुराक ५० (प्रवर्तन निदेशालय५०) मॉब 8B6 और topotecan के मूल्यों का निर्धारण । अगले, दो यौगिकों के equipotent अनुपात के साथ neuroblastoma कोशिकाओं५० मूल्यों पर आधारित के लिए सीआई मूल्यों उपर्युक्त सिमुलेशन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित करने के लिए उजागर कर रहे हैं । इस विधि से हम इन विट्रो मेंमॉब 8B6 और topotecan के बीच तालमेल को प्रदर्शित करने की अनुमति देता है । अगले, हम आगे शक्ति और vivo मेंइस संयोजन आहार की सुरक्षा का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल को आसानी से नैदानिक अध्ययन में शक्तिशाली और सुरक्षित विरोधी मॉब और कीमोथेरेपी एजेंट संयोजन का चयन करने के लिए लागू किया जा सकता है । इस अध्ययन के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1में प्रदान की जाती है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

पशु आवास और प्रयोगात्मक प्रक्रिया फ्रांसीसी सरकार द्वारा अनुमोदित किया गया (समझौतों #C44-२७८ और #APAFIS ०३४७९.०१) । पशु देखभाल और प्रक्रियाओं के निर्देश के तहत आयोजित किए गए यूरोपीय संघ 2010/63/यूरोपीय संघ और फ्रांसीसी कानून #2013-११८ वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जानवरों के संरक्षण पर ।

1. मॉब 8B6 और Topotecan के बीच दवा बातचीत का मूल्यांकन इन विट्रो में

  1. ९६-अच्छी तरह से नमूना तैयारी
    सावधानी: संस्था की स्वास्थ्य एवं सुरक्षा समिति से परामर्श लें और प्रयोगशाला सुरक्षा से संबंधित स्थानीय नियमन नियमों का पालन करें । किसी भी मीडिया, कक्ष रेखाओं या रिएजेंट के साथ कार्य करने से पहले सामग्री और सुरक्षा डेटा पत्रक जानकारी की समीक्षा करें । उचित बाँझ तकनीक का प्रयोग करें और एक लामिना प्रवाह हुड में काम करते हैं । सभी समाधान/उपकरण है कि कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे है बाँझ होना चाहिए ।
    नोट: निंन प्रोटोकॉल अनुयाई कक्षों के साथ उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया था । संशोधन nonadherent कोशिकाओं निलंबन में बढ़ रही करने के लिए विधि लागू करने के लिए आवश्यक हैं; यह प्रोटोकॉल प्रत्येक प्रायोगिक शर्त के लिए quadruplicate का उपयोग करता है ।
    1. एक T75 कुप्पी में IMR5 कोशिकाओं को बढे ।
    2. पहले दिन (0 दिन) पर, एक खुर्दबीन के नीचे सेल संस्कृति का पालन करने के लिए सेल को प्रभावित की जांच करें । सेल मीडियम को कुप्पी से महाप्राण, इसे फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 5 मिलीलीटर से धो लें और इसमें 3 मिलीलीटर ०.०५% ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)/PBS सॉल्यूशन डालें । 3 मिनट (३७ ° c, 5% CO2) के लिए मशीन के लिए कुप्पी लौटें ।
    3. कोशिका टुकड़ी के लिए एक माइक्रोस्कोप के तहत सेल संस्कृति की जांच करें ।
      नोट: यदि आवश्यक हो, एक अतिरिक्त 3 से 5 मिनट के लिए मशीन के लिए कुप्पी वापस, ट्यूमर कोशिका प्रकार पर निर्भर करता है ।
    4. कुप्पी के लिए पूरा सेल मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें और एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण । 5 मिनट के लिए ३०० x gपर कोशिकाओं के केंद्रापसारक किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
    5. supernatant को निकालें और छोड़ें । पूर्ण विकास मध्यम में सेल गोली resuspend । मध्यम मात्रा 1 x 105 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए समायोजित/
    6. 104 कोशिकाओं प्रत्येक, जो सेल निलंबन के १०० µ एल है के साथ एक ९६ अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के बीज ८४ कुओं । चित्रा 2में दिखाए गए प्रयोगात्मक लेआउट का पालन करें ।
    7. सेल मशीन (३७ ° c, 5% CO2) में 18 ज के लिए कोशिकाओं को मशीन ।
  2. दवा समाधान की तैयारी
    नोट: दवा/मॉब संवेदीकरण अध्ययन के लिए, समय, लंबाई, और एकाग्रता उपचार विशेष दवा के अनुरूप करने के लिए संशोधित/मॉब । ध्यान दें कि प्रारंभिक एकाग्रता 3x अंतिम एकाग्रता है ।
    1. अगली सुबह (day 1), पूर्ण विकास माध्यम का उपयोग करके निम्नलिखित औषध समाधान तैयार करें.
      1. मॉब समाधान तयारी
        1. पूरा विकास माध्यम के ५०० µ एल में मॉब पतला २४० µ g/एमएल के एक मॉब एकाग्रता के साथ एक एंटीबॉडी काम समाधान प्राप्त करने के लिए ।
        2. प्रदर्शन ५ २-गुना सीरियल कमजोर पड़ने के रूप में चित्रा 2में संकेत दिया ।
      2. Topotecan समाधान तयारी
        1. पतला, ऊपर के रूप में, पूर्ण विकास माध्यम के ५०० µ एल में दवा १२० एनएम के अंतिम एकाग्रता के साथ एक दवा काम समाधान प्राप्त करने के लिए ।
        2. प्रदर्शन ५ २-गुना सीरियल कमजोर पड़ने के रूप में चित्रा 2में संकेत दिया ।
      3. एंटीबॉडी व औषध समाधान तयारी
        1. १२० एनएम दवा और २४० µ जी/एमएल मॉब (काम समाधान) पर एक समाधान प्राप्त करने के लिए पूर्ण विकास माध्यम के ५०० µ एल में दवा और मॉब समाधान पतला ।
        2. प्रदर्शन ५ २-गुना सीरियल कमजोर पड़ने के रूप में चित्रा 2में संकेत दिया ।
    2. अंतिम एकाग्रता पर पहुंचने के लिए, प्रत्येक दवा समाधान के ५० µ एल स्थानांतरण इसी कुएं में, प्रयोगात्मक लेआउट ( चित्रा 2) में संकेत के रूप में ।
      नोट: स्थानांतरण ५० µ एल में पूर्ण विकास मध्यम के अनुपचारित सेल वेल्स, के रूप में चित्रा 2में संकेत दिया ।
    3. मशीन (३७ ° c, 5% CO2) में ७२ h के लिए कोशिकाओं को मशीन ।
  3. MTT परख
    1. एक अच्छी तरह से MTT रिएजेंट समाधान के 10 µ एल जोड़ें ।
    2. 4 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    3. lysis समाधान के १०० µ एल जोड़ें (०.०१ एम एचसीएल में 10% एसडीएस) एक अच्छी तरह से, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
    4. एक humidified चैंबर (९५% आर्द्रता) में 4 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    5. एक spectrophotometer का उपयोग कर ५७० एनएम (एक५७०) और ६२० एनएम (एक६२०) में अवशोषक पढ़ें ।
      नोट: अवशोषक पढ़ने से पहले pipetting द्वारा फिर से प्रत्येक नमूने को मिलाएं; ६२० एनएम में अवशोषित विशिष्ट पृष्ठभूमि मूल्यों के सुधार की अनुमति देता है ।
    6. सही अवशोषक गणना: सही अवशोषक = एक५७०-a६२०।
    7. सेल व्यवहार्यता की गणना निंनानुसार है: सेल व्यवहार्यता = १०० x (नमूना मतलब सही अवशोषक/
    8. भिन्न-प्रभावित मानों की गणना (एफए) निम्न समीकरण का उपयोग कर: 1-(नमूना मतलब सही अवशोषक/
  4. दवा बातचीत विश्लेषणात्मक सिमुलेशन एकल और दवा संयोजन के अध्ययन के लिए सॉफ्टवेयर
    1. प्रारंभ विंडो खोलने के लिए सिमुलेशन सॉफ़्टवेयर चलाएँ ।
    2. मुख्य विंडो खोलने के लिए नया प्रयोग बटन पर क्लिक करें ।
    3. नाम विंडो में प्रयोग का नाम लिखें ।
      नोट: दिनांक विंडो में कोई दिनांक जोड़ा जा सकता है ।
    4. नई एकल दवा बटन पर क्लिक करें ।
    5. पूरा नाम विंडो में नाम लिखें ।
    6. Abbrev विंडो में संक्षिप्त नाम लिखें ।
    7. इकाइयों विंडो में दवा एकाग्रता इकाई टाइप करें ।
    8. डेटा बिंदु 1 खुराक और एफए मानदर्ज करें, enterदबाएँ ।
    9. सभी डेटा बिंदुओं को दर्ज किए जाने तक इस चरण को दोहराएँ ।
    10. समाप्त बटन पर क्लिक करें ।
    11. मॉब डेटा बिंदुओं को दर्ज करने के लिए एक ही चरणों का पालन करें ।
      नोट: दवा द्वारा प्रयोग किया जाता है के रूप में एक ही एकाग्रता इकाई का प्रयोग करें.
    12. नई दवा कॉम्बो बटन पर क्लिक करें ।
    13. ड्रग और मॉबका चयन करें ।
    14. चुनें निरंतर अनुपात और ठीकपर क्लिक करें ।
    15. पूरा नाम विंडो में नाम लिखें ।
    16. Abbrev विंडो में संक्षिप्त नाम लिखें ।
    17. प्रकार विंडो के अनुपात में दवा/मॉब अनुपात ।
    18. डेटा पॉइंट 1 खुराक दर्ज करें और enterदबाएँ.
      नोट: कार्यक्रम स्वचालित रूप से मॉब और कॉम्बो की खुराक की गणना करेगा.
    19. डेटा बिंदु 1 एफए मान दर्ज करें और enterदबाएँ ।
    20. सभी डेटा बिंदुओं को दर्ज किए जाने तक इस चरण को दोहराएँ ।
    21. समाप्त बटन पर क्लिक करें और फिर, रिपोर्ट जनरेट करें बटन पर क्लिक करे ।
    22. ड्रग और मॉब का चयन करें और फिर, ठीकक्लिककरें ।
    23. कॉंबो चुनें और फिर, ठीकक्लिक करें ।
    24. शीर्ष लेख, CI तालिका, और सारांश तालिकाका चयन करें । उसके बाद, ठीकक्लिककरें ।
    25. विश्लेषण फ़ाइल का फ़ाइल नाम लिखें और रिपोर्ट जनरेट करने के लिए सहेजें क्लिक करें ।
      नोट: ठीकक्लिक करने के बाद, रिपोर्ट स्वचालित रूप से कंप्यूटर के डिफ़ॉल्ट वेब ब्राउज़र में खुलेगी ।
    26. रिपोर्ट मुद्रित करने के लिए, वेब ब्राउज़र के फ़ाइल मेनू से मुद्रित करें चुनें । रिपोर्ट में कोई सारांश तालिका अनुभाग जिसमें शीर्षक, दिनांक, फ़ाइल नाम, विवरण नोट, पैरामीटर्स (m, Dm, और r), एड५० या तो एजेंट के लिए मोनोथेरापी या संयोजन में उपयोग किया जाता है, और प्रत्येक संयोजन के लिए CI तालिका एड५०, एड में ७५, एड९०, और प्रवर्तन निदेशालय९५।
      नोट: < 1 के ci मान तालमेल इंगित करता है, एक ci मान की = 1 additivity इंगित करता है, और > 1 के ci मान इंगित करता है विरोध ।

2. मोटापे से ग्रस्त मधुमेह की मंजूरी Scid गामा चूहों (एनएसजी चूहों) में मानव Neuroblastoma Xenografts की पीढ़ी

नोट: कोशिका संस्कृति के किसी भी संदूषण को बहिष्कृत कर दें. चूंकि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 5 डिग्री सेल्सियस से ऊपर एक जेल रूपों, सभी cultureware या मीडिया तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स एजेंट के साथ संपर्क में आ रहा है ठंडा/ पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स रखो ।

  1. IMR5 सेल के निलंबन की तैयारी
    1. उपयोग करने से पहले एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में बर्फ में शीशी को विलय द्वारा रातोंरात तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स एजेंट गल ।
    2. 0 दिन पर, फसल के रूप में ऊपर विस्तृत IMR5 प्रसंस्कृत कोशिकाओं ।
    3. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    4. supernatant को त्यागें । बर्फ ठंडा पंजाबियों के 15 मिलीलीटर के साथ 2x कोशिकाओं धो, और एक सेल निलंबन की तैयारी 5 x 107 कोशिकाओं/
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो कक्ष निलंबन को १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब पर स्थानांतरित करें ।
    5. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स शीशी भंवर ।
      नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स एजेंट गल और फैलाया जाना चाहिए ।
    6. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स एजेंट का एक खंड जोड़ें और यह pipetting द्वारा मिश्रण २.५ x 107 कोशिकाओं के एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए/mL.
    7. बर्फ पर सेल सस्पेंशन रखें ।
  2. चूहों की तैयारी
    नोट: चूहों को छह से सात सप्ताह पुराना होना चाहिए ।
    1. एक विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त शर्त के तहत चूहों बनाए रखें ।
    2. चूहों के आ जाने के बाद तीन-पांच दिन की acclimatization अवधि की अनुमति दें ।
    3. टीका के दिन, जहां इंजेक्शन किया जाएगा (चरण 2.3.6 देखें) पार्श्व दाढ़ी ।
  3. ट्यूमर सेल इंजेक्शन की तैयारी
    नोट: प्रक्रिया के दौरान बर्फ ठंडा तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स सेल निलंबन अपूतित रखें ।
    1. कोशिकाओं को मिलाएं और ध्यान से एक 1 मिलीलीटर सिरिंज एक 21 जी सुई के साथ घुड़सवार में सेल निलंबन आकर्षित ।
    2. जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहां कोई सिरिंज में हवा के बुलबुले हैं ।
    3. एक एंटीसेप्टिक समाधान के साथ माउस के टीका क्षेत्र को संक्रमित ।
    4. धीरे इंजेक्शन साइट पर, उंगलियों के बीच पार्श्व पर माउस की त्वचा निचोड़ ।
    5. सुई बिल्कुल त्वचा गुना में डालें । एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए ऊतक में सुई गहरी जगह नहीं है ।
    6. IMR5 सेल निलंबन के १०० µ एल सुई (यानी, २.५ x 106 कोशिकाओं) चूहों के निचले सही पार्श्व में चमड़े के नीचे ।
    7. रिसाव को रोकने और सुई वापस लेने के लिए सिरिंज घुमाएँ.
  4. शरीर के वजन में परिवर्तन और ट्यूमर के विकास की निगरानी
    1. लंबाई (क) और एक कैलिपर के साथ ट्यूमर की चौड़ाई (बी) को मापने ।
    2. सूत्र (A x B2) x ०.५ का उपयोग करके ट्यूमर मात्रा परिकलित करें.
    3. चिकित्सा शुरू जब ट्यूमर के एक औसत मात्रा तक पहुंच गए है ~ ५०-६० mm3।

3. चूहों में औषधि और एंटीबॉडी प्रशासन

  1. नसों में मॉब 8B6 के प्रशासन
    1. ध्यान से एक 1 एमएल सिरिंज मॉब समाधान के साथ एक 25 जी सुई के साथ घुड़सवार भरें ।
    2. 10 मिनट के लिए एक गर्मी लैंप के तहत माउस प्लेस पूंछ नस को चौड़ा करना ।
    3. एक चूहे को कुतर छलनी में रोकना ।
    4. एक एंटीसेप्टिक समाधान के साथ माउस के टीका क्षेत्र को संक्रमित ।
    5. पूंछ नस के समानांतर सुई डालें, लुमेन में 2-4 mm मर्मज्ञ जबकि सुई चेहरे की वृद्धि (3ए) का बेवल रखते हुए ।
    6. एंटीबॉडी समाधान नसों (i.v.) के १०० µ एल सुई ।
    7. जब इंजेक्शन समाप्त हो गया है, धीरे से रक्तस्राव को रोकने के लिए इंजेक्शन साइट दबाव ।
  2. Intraperitoneal प्रशासन topotecan
    1. एक 1 एमएल सिरिंज एक 25 ग्राम सुई के साथ घुड़सवार में दवा समाधान ड्रा ।
    2. एक लापरवाह स्थिति में माउस पकड़ो, उसके पीछे थोड़ा ऊंचा अंत के साथ ।
    3. एक एंटीसेप्टिक समाधान के साथ माउस के टीका क्षेत्र को संक्रमित ।
    4. माउस के पेट midline का पता लगाने और मानसिक रूप से पेट चक्रों में विभाजित । सही या बाएँ निचले वृत्त का चक्र (चित्र बी) में इंजेक्शन साइट का पता लगाएँ.
    5. पेट में सुई डालें (5 मिमी गहरा) ~ 10 ° कोण में, सही या बाएँ निचले वृत्त का चक्र में.
    6. दवा समाधान intraperitoneally (आईएफसआई) के १०० µ एल इंजेक्षन ।
    7. टीका साइट को संक्रमित करना ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम और आंकड़े पहले से प्रकाशित काम14से अनुमति के साथ अनुकूलित कर रहे हैं ।

एंटी-OAcGD2 मॉब 8B6 Synergistically निरोधात्मक सेल लाइन के विकास पर Topotecan के Neuroblastoma प्रभाव को बढ़ाता है:

दवा और एंटीबॉडी सांद्रता स्थापित करने के लिए topotecan और मॉब 8B6 के बीच तालमेल का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए, दवा और मानव एंटीबॉडी संवेदनशीलता कोशिकाओं के IMR5 neuroblastoma पहले मापा गया, एक MTT परख का उपयोग कर. या तो मॉब 8B6 या ७२ के लिए अकेले topotecan एच के लिए जोखिम IMR5 सेल व्यवहार्यता के एक एकाग्रता पर निर्भर निषेध (चित्रा 4a) के परिणामस्वरूप । खुराक-प्रतिक्रिया curves प्रत्येक यौगिक के लिए एड५० मूल्यों की गणना की अनुमति दी । इस अंत करने के लिए, एफए मूल्यों विश्लेषण सिमुलेशन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गणना की गई । परिकलित एड५० मूल्यों के लिए 10 एनएम ± 1 topotecan के लिए पाया गया (चित्रा 4B) और 18 µ जी/एमएल ± 3 मॉब 8B6 के लिए (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।

इन एड५० मूल्यों के आधार पर, अगले, मॉब 8B6 और topotecan के छह संयोजन equipotent अनुपात की शक्ति का परीक्षण किया गया (चित्रा 2) । संयोजन खुराक की पारी-ग्राफ के प्रति संवेदनशील पक्ष की प्रतिक्रिया वक्र इंगित करता है कि संयोजन आहार प्रत्येक मोनोथेरापी (चित्रा 4a) की तुलना में अधिक शक्तिशाली है. इसी एड५० और CI मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, एफए मूल्यों की गणना की गई । topotecan के एड५० मूल्यों मॉब 8B6 (पी < ०.०५, चित्रा 4B) की उपस्थिति में काफी कम थे, यह दर्शाता है कि मॉब 8B6 topotecan को ट्यूमर कोशिका संवेदनशील । महत्वपूर्ण बात, CI मान थे काफी कम से १.० (p < ०.०५), एक synergistic सहभागिता का प्रदर्शन (चित्रा 5) । इस प्रकार, मॉब 8B6 topotecan कीमोथेरेपी के लिए एक सहायक चिकित्सकीय एजेंट के रूप में क्षमता है ।

एंटी OAcGD2 मॉब 8B6 की अर्बुदरोधी गतिविधि को बढ़ाता है Topotecan वीवो में

क्योंकि इन विट्रो मॉडल में न तो दवा आधा जीवन और न ही दवा चयापचय ले, यह आवश्यक है पुष्ट में इन विट्रो में विवोनिष्कर्षों. इसके अलावा, vivo मॉडल में बहुत संयोजन आहार सुरक्षा का आकलन करने के लिए उपयोगी होते हैं । यह पुष्टि करने के लिए कि topotecan और मॉब 8B6 के बीच तालमेल कैंसर कोशिकाओं के लिए विशिष्ट था, एक ट्यूमर xenograft मॉडल में संयोजन थेरेपी के antineuroblastoma प्रभाव का आकलन किया गया. इसके लिए गंभीर immunodeficient एनएसजी माउस तनाव का चयन किया गया । इन चूहों दोनों एक सहज और एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली15की कमी है, और इसलिए, यह शोधकर्ताओं के लिए किसी भी इम्यूनोमॉड्यूलेटरी topotecan थेरेपी कि मॉब शक्ति को प्रभावित कर सकता द्वारा प्रेरित प्रभाव को बाहर करने के लिए संभव बनाते हैं । उपचार एक बार ट्यूमर ५० ± २.५ mm3 (चित्रा 6A) का मतलब मात्रा प्रदर्शित शुरू किया गया था । उपचार या तो मॉब 8B6 (१५० µ जी i.v., दिन 7 और दिन 11), topotecan (०.३६ मिलीग्राम/किलो आईएफसआई, दिन 7-11), या मॉब 8B6 और topotecan का एक संयोजन शामिल हैं । प्रयोग के दौरान ट्यूमर की मात्रा पर नजर रखी गई । सभी चिकित्सा नियंत्रण समूहों (चित्रा 6A) के साथ तुलना में ट्यूमर विकास मंदता के लिए नेतृत्व किया । संयोजन आहार, हालांकि, मजबूत प्रभाव प्रेरित (चित्रा 6A) ।

ट्यूमर विकास आगे इलाज पर जीवित रहने की दर का अध्ययन करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है । इस अंत करने के लिए, माउस इच्छामृत्यु में जिसके परिणामस्वरूप घटना नैतिक कारणों के लिए ≥ 1 सेमी3 ट्यूमर मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया था । यह हमें एक कापलान-मेयेर अस्तित्व विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए और औसत घटना-प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए मुफ्त जीवन रक्षा समय की गणना करने की अनुमति दी । के रूप में चित्रा घमण्डमें दिखाया गया है, दोनों monotherapies घटना मुक्त अस्तित्व (efs) काफी हद तक जब नियंत्रण समूहों की तुलना में सुधार (वाहन का औसत efs-इलाज समूह 21 दिन था; नियंत्रण एंटीबॉडी समूह, 22 दिनों के topotecan समूह, 26 दिन की; ; मॉब 8B6 समूह के 29 दिन [चित्रा घमण्ड]) । फिर भी, संयुक्त थेरेपी चूहों अस्तित्व पर सबसे मजबूत प्रभाव था, एक औसत EFS के साथ ३९.५ दिनों के लिए विस्तारित (पी < ०.०५, मॉब 8B6 बनाम संयोजन; p < ०.०१, topotecan बनाम संयोजन [चित्रा घमण्ड]) ।

क्योंकि synergistic बातचीत बढ़ विषाक्तता में परिणाम कर सकते हैं, संयोजन आहार सुरक्षा के लिए मूल्यांकन की जरूरत है । जैसे, वजन घटाने सामांयतः16कुतर में स्वास्थ्य की निगरानी के लिए एक संवेदनशील मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है । इस प्रकार, वजन घटाने-प्रारंभिक वजन से प्रतिशत में गिरावट के रूप में मापा-प्रत्येक परीक्षण किया आहार के प्रणालीगत सहनशीलता का एक संकेतक के रूप में रखा गया था । शरीर के वजन का कोई नुकसान नहीं मनाया गया था, सुझाव है कि उपचार अच्छी तरह से सहन किया गया था (चित्रा 7) । इन आंकड़ों का सुझाव है कि topotecan प्लस मॉब 8B6 के संयोजन या तो अकेले एजेंट से vivo में एक और अधिक शक्तिशाली अर्बुदरोधी प्रभावकारिता का प्रतिनिधित्व करता है, detectable विषाक्तता के बिना.

Figure 1
चित्रा 1 : अध्ययन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : topotecan-to-मॉब 8B6 के अनुपात के साथ एक ९६-अच्छी प्लेट पर संयोजन प्रयोग के लेआउट, छह समाधान के रूप में तैयार किया । प्रोटोकॉल में बताए गए समाधानों को तैयार किया गया । वेल्स 1 से 4 लेबल मॉब 8B6 समाधान के रूप में सेवा, कुओं 5 से 8 लेबल topotecan समाधान के रूप में सेवा, और कुओं 9 से 12 लेबल मॉब 8B6 और topotecan (संयोजन) समाधान के रूप में सेवा करते हैं । कुओं लेबल एक और एच नियंत्रण के रूप में सेवा; कुओं लेबल बी ०.१२५ एक्स एड५० एकाग्रता दवा समाधान के रूप में सेवा; कुओं लेबल सी ०.२५ एक्स एड५० एकाग्रता दवा समाधान के रूप में सेवा; वेल्स डी लेबल ०.५ एक्स एड५० एकाग्रता दवा समाधान के रूप में सेवा; कुओं ई लेबल ED५० एकाग्रता दवा समाधान के रूप में सेवा; वेल्स 2 एक्स एड५० एकाग्रता दवा समाधान के रूप में एफ सेवा लेबल; वेल्स लेबल जी सेवा के रूप में 4 एक्स एड५० एकाग्रता दवा समाधान, के रूप में संकेत दिया । दो विभिंन इकाइयों के साथ चिकित्सकीय एजेंटों (यानी, मॉब 8B6 के लिए µ जी/एमएल, और एनएम topotecan के लिए) एक निश्चित अनुपात संयोजन (०.०७५, topotecan/8B6) में विश्लेषण कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : इंजेक्शन । (क) एक रोका माउस की पूंछ नस में नसों में इंजेक्शन, एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग 27 जी एक्स 1/2 में, 1 मिलीलीटर. (ख) माउस के पेट के निचले सही वृत्त का चक्र करने के लिए Intraperitoneal इंजेक्शन, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर एक 25 ग्राम सुई के साथ घुड़सवार. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : खुराक-प्रभाव के ७२ ज के बाद topotecan, मॉब 8B6, और IMR5 neuroblastoma कोशिकाओं के विकास व्यवहार्यता निषेध पर उनके संयोजन का असर रिश्ता । एक MTT परख के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया था । (एक) खुराक-प्रतिक्रिया घटता दिखाया तीन स्वतंत्र प्रतिकृति के प्रतिनिधि हैं, प्रत्येक quadruplicates में चलाते हैं । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं; पी < ०.००१. (ख) topotecan का५० एड एक एजेंट के रूप में या मॉब 8B6 के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । यह आंकड़ा फरज एट अल से संशोधित किया गया है । 14. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 5
चित्रा 5 : संयोजन अनुक्रमणिका मान । प्रतिशत उत्तरजीविता मान भिन्न-प्रभावित (एफए) मानों में रूपांतरित हो गए और कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए संयोजन अनुक्रमणिका (सिनर्जी, additivity, और विरोध का माप) की गणना करने के लिए उपयोग किया गया, जैसा कि पाठ में दर्शाया गया है. संयोजन सूचकांक भूखंडों में, डेटा तीन स्वतंत्र प्रतिकृति के लिए मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । परिणाम बताते है कि मॉब 8B6 topotecan (CI < 1) के साथ एक synergistic प्रभाव था । यह आंकड़ा फरज एट अल से संशोधित किया गया है । 14. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6 : मॉब 8B6 प्लस topotecan के साथ एनएसजी चूहों में IMR5 xenografts का कॉम्बिनेशन ट्रीटमेंट. (क) चूहों पर असर मानव neuroblastoma IMR5 xenografts वाहन (पंजाब, आईएफसआई), topotecan अकेले (०.३६ मिलीग्राम/किलोग्राम, आईएफसआई), नियंत्रण आईजीजी अकेले (१५० µ जी, i.v.), मॉब 8B6 अकेले (i.v.), या topotecan और मॉब 8B6 संयुक्त, के रूप में संकेत के साथ इलाज किया गया । मॉब 8B6 या नियंत्रण एंटीबॉडी उपचार के प्रशासन IMR5 सेल टीका के बाद 7 दिन पर शुरू किया और 11 दिन पर एक बार दोहराया गया था । topotecan या पंजाबियों उपचार 7 दिन पर शुरू किया गया था और लगातार पांच दिनों के लिए दिया । ट्यूमर वृद्धि पर नजर रखी थी, और ट्यूमर की मात्रा की गणना की गई । प्रत्येक उपचार समूह का मतलब ट्यूमर मात्रा ± SEM (पंजाबियों समूह, 9 चूहों, अन्य सभी समूहों, 10 चूहों) चित्रित कर रहे हैं (* p < ०.०५ के खिलाफ मॉब 8B6 के लिए मॉब 8B6 और topotecan साथ, * * पी < topotecan के खिलाफ मॉब 8B6 के लिए ०.०१ और एक साथ topotecan), के रूप में संकेत. xenograft मात्रा में एक महत्वपूर्ण कमी मॉब 8B6/topotecan संयोजन, के लिए दवा-अलोन नियंत्रण की तुलना में, संकेत के रूप में (p < ०.०५) के लिए मनाया गया था । (ख) घटना मुक्त जीवन रक्षा कापलान-अलग इलाज समूहों के मेयेर घटता दिखाया जाता है । यह आंकड़ा फरज एट अल से संशोधित किया गया है । 14. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7 : प्रत्येक उपचार समूह के लिए वजन मतलब, के रूप में संकेत दिया । 0 दिन पर चूहों का मतलब वजन १००% वजन के रूप में परिभाषित किया गया था । प्रत्येक समूह में वजन के उपचार की अवधि के लिए स्थिर रहे । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । यह आंकड़ा फरज एट अल से संशोधित किया गया है । 14. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

दवा बातचीत के प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए, तीन तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है: isobologram पद्धति17, रैखिक मिश्रण मॉडल18, और संयोजन सूचकांक1. संयोजन सूचकांक विश्लेषण सबसे अधिक इस्तेमाल किया है क्योंकि इसके आवेदन एक उपयोगकर्ता के अनुकूल कंप्यूटर प्रोग्राम की उपलब्धता से सरल है । इस प्रयोजन के लिए, हम पहले खुराक-प्रभाव प्रतिक्रिया की विशेषता प्रत्येक एजेंट अकेले या संयोजन में इस्तेमाल किया, एक MTT परख19प्रदर्शन करके. यह पद्धति व्यवहार्य कोशिकाओं की क्षमता पर निर्भर करता है एक बैंगनी रंग के formazan उत्पाद में tetrazolium नमक को कम करने के लिए एक अवशोषक अधिकतम ५७० एनएम19। मृत्यु के समय, कोशिकाओं को formazan में MTT परिवर्तित करने की क्षमता खो देते हैं । इस प्रकार, रंगीन formazan उत्पाद की मात्रा संस्कृति19में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के लिए आनुपातिक है । दरअसल, हम डीएनए में tritiated thymidine निगमन के लिए एक रेडियोधर्मी विकल्प के रूप में सेल प्रसार19को मापने के लिए इस पद्धति को चुना । जैसे, MTT परख व्यापक रूप से अपनाया गया है और अकादमिक प्रयोगशालाओं में लोकप्रिय रहने के रूप में प्रकाशित लेख के हजारों का सबूत है । जबकि formazan की मात्रा ५७० एनएम पर अवशोषक रिकॉर्डिंग द्वारा मापा जाता है एक थाली-पढ़ने spectrophotometer, ६२० एनएम का एक संदर्भ तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर रहा है, लेकिन सबसे अधिक परख शर्तों के लिए आवश्यक कभी नहीं किया है । महत्वपूर्ण कदम के विचार में यहां वर्णित है, हमने पाया है कि संस्कृति की स्थिति के लिए कोशिकाओं को विकसित MTT परख के परिणामों को प्रभावित कर सकते थे । हमने पाया है कि व्यवहार्य कोशिका संख्या, सेल चयापचय गतिविधि, संस्कृतियों की आयु, और मार्ग और विकास के माध्यम के विवरण की संख्या सभी महत्वपूर्ण कारक हो सकता है । इस प्रकार, वे ध्यान में रखा जाना चाहिए जब परख दोहरा और डेटा का विश्लेषण । इसके अलावा, सेल संस्कृति की स्थिति प्रत्येक कोशिका लाइनों के लिए अलग है । यह है, इस प्रकार, जटिल कोशिका बोने की सघनता के बारे में कोई स्पष्ट संकेत प्रदान करने के लिए । अंगूठे का एक नियम के रूप में, २,००० के बीच कोशिकाओं की एक औसत संख्या-१०,००० कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से ७२ एच के भीतर एक इष्टतम सेल घनत्व को प्राप्त करने की सिफारिश की है । महत्वपूर्ण बात, MTT कमी व्यवहार्य सेल चयापचय को दर्शाता है और नहीं, विशेष रूप से, सेल प्रसार या सेल मौत । इसलिए, MTT परख न तो सेल प्रसार को मापने के रूप में वर्णित किया जाना चाहिए और न ही सेल cytotoxicity20,11। कोशिका मृत्यु का पता लगाने के विशिष्ट सेल पर निर्भर करता है परख आधारित है । उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययन में, हम पश्चिमी दाग विश्लेषण का उपयोग करने caspase 3 सक्रियकरण और/या प्रवाह cytometry विश्लेषण का पता लगाने के लिए बाहरी प्लाज्मा झिल्ली पुस्तिका में phosphatidylserine का पता लगाने के लिए, मॉब 8B613के proapoptotic गतिविधि सबूत ।

जब संयोजन परीक्षण दवाओं, वे एक साथ दिया जा सकता है या समय में क्रमिक । कार्रवाई के तंत्र की विविधता को देखते हुए, यह प्रासंगिक प्रयोगात्मक सेटिंग के लिए सटीक दिशा निर्देश प्रदान करने के लिए मुश्किल है । फिर भी, सबसे जांचकर्ताओं दवा संयोजन के प्रत्यक्ष परीक्षण का उपयोग । इसके अलावा, सांद्रता कि एक परिभाषित एकल एजेंट प्रभाव ५०% सेल विकास निषेध का उत्पादन सामांयतः उपयोग किया जाता है । रोगियों में प्राप्त प्लाज्मा सांद्रता को प्रतिबिंबित दवा सांद्रता सामांयतः नैदानिक रूप से प्रासंगिक माना जाता है । जैसे, संयोजन खुराक-प्रभाव विश्लेषण कई खुराकों के लिए किया जाता है, (एड५०)मॉबके एक धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ संयोजन अनुपात लगातार रखते हुए (एड५०)दवा अनुपात, हालांकि यह एक निरपेक्ष आवश्यकता नहीं है 1. ध्यान दें, CI मूल्यों भी विभिंन प्रवर्तन निदेशालय (जैसे, एड५०, एड७५, और एड९०) पर गणना की जानी चाहिए, क्योंकि वे एक रैखिक तरीके से1में एफए के साथ बदल सकते हैं । CI मान का स्वचालित विश्लेषण करने के बाद, रेखीय सहसंबंध गुणांक r-मान एल्गोरिथ्म द्वारा अनुमानित 0.9 > होना चाहिए, प्रयोगात्मक डेटा के फ़िट की भलाई को प्रतिबिंबित करने के लिए । < 1 के ci मूल्यों सिनर्जी संकेत, = 1 के ci मूल्यों से संकेत मिलता है additivity, और > 1 के ci मूल्यों विरोध1निरूपित । दोनों प्रयोगात्मक तरीकों और जैविक प्रणाली में परिवर्तनशीलता के कारण, गणना CI आगे सांख्यिकीय विचार के अधीन किया जाना चाहिए । जैसे, एक सरल विधि के लिए दवा संयोजन प्रयोग कई बार दोहराने का मतलब है ± एसडी1के आंकड़े निर्धारित करने से पहले जिसके परिणामस्वरूप CI मूल्यों की गणना के बाद है । यह भी सेल लाइनों के सबसे बड़े संभव पैनल में संयोजन का परीक्षण करने के लिए, खाते में परिवर्तनशीलता है कि उन दोनों के बीच मौजूद है लेने के लिए सलाह दी जाती है ।

महत्वपूर्ण बात, में इन विट्रो अध्ययन में कई मापदंडों के लिए ध्यान में नहीं लिया जाता है vivo एक्सट्रपलेशन. उदाहरण के लिए, इन विट्रो में व्यवहार्यता परख न तो ध्यान में vivo आधा दवा के जीवन में ले, और न ही vivo दवा चयापचय में है कि दवा निष्क्रियता में परिणाम हो सकता है । इस प्रकार, vivo में करने के लिए इन विट्रो से एक्सट्रपलेशन एक अलग सवाल रहता है, और लाभप्रद दवा बातचीत इन विट्रो में सबूत आगे vivo मेंपुष्टि की जानी चाहिए. इस तरह, ट्यूमर xenografts असर चूहों में तालमेल का एक स्पष्ट प्रदर्शन, संयोजन सूचकांक विधि का उपयोग कर,21प्रकाशित किया गया है । फिर भी, vivo अध्ययनों में पशुओं की एक बड़ी संख्या में सही तालमेल को परिभाषित करने की आवश्यकता है और अधिक महंगे और अधिक समय लेने वाली हैं । वैकल्पिक प्रभावी मॉडल एफपरीक्षण अभी भी पर्याप्त संसाधनों22की आवश्यकता है । जानवरों की एक बड़ी संख्या के उपयोग को सीमित करने के लिए एक अलग दृष्टिकोण के रूप में सेल संस्कृति एक सीमित xenograft अध्ययन14में संयोजन की एक वृद्धि हुई अर्बुदरोधी प्रतिक्रिया के सबूत के बाद मॉडल में दवा तालमेल का प्रदर्शन में होते हैं, हम इस्तेमाल किया मानव neuroblastoma IMR5 के लिए ट्यूमर लक्ष्य के रूप में कोशिकाओं में vivo अध्ययन. हम IMR5 कोशिकाओं को बनाए रखा क्योंकि वे प्रतिरक्षा चूहों में tumorigenic हैं23. जबकि मानव ट्यूमर xenograft मॉडल vivo24में दवा संयोजन के परीक्षण के लिए मूल्यवान मॉडल प्रदान करते हैं, यह सेल लाइनों की एक किस्म से इस तरह के मॉडल25स्थापित करने के लिए मुश्किल हो सकता है । चूहों में ट्यूमर के गठन की घटनाओं को बढ़ाने के लिए, कोशिकाओं एक वाहन25के रूप में एक झिल्ली तहखाने मैट्रिक्स के साथ चूहों में इंजेक्ट किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, के बाद से झिल्ली तहखाने मैट्रिक्स polymerizes और 5 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान पर जम जाता है, सभी cultureware या मीडिया झिल्ली तहखाने मैट्रिक्स के साथ संपर्क में आ रहा है ठंडा किया जाना चाहिए/ पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ25. झिल्ली तहखाने मैट्रिक्स के उपयोग के साथ, हम एक १००% IMR5 कोशिकाओं के साथ दर लेने के लिए मनाया, जबकि, झिल्ली तहखाने मैट्रिक्स के अभाव में, इस सेल लाइन एक < 80% ले दर (दिखाया डेटा नहीं) का प्रदर्शन किया । इसके अलावा, ट्यूमर भ्रष्टाचार की घटनाओं को बढ़ाने के लिए, झिल्ली तहखाने मैट्रिक्स भी ट्यूमर वृद्धि दर25बढ़ा सकते हैं । हमने देखा है कि सभी xenografts 11 दिन से प्रकट किया था । हालांकि, ट्यूमर सेल चैलेंज के बाद पहले सात दिनों के दौरान, गांठ की उपस्थिति देखा जा सकता है, जो प्रारंभिक इनोक्युलम की उपस्थिति के कारण हो सकता है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस प्रकार, हम इस समय से पहले सार्थक ट्यूमर आकार के माप पर विचार नहीं किया । झिल्ली तहखाने मैट्रिक्स का उपयोग कर प्रयोगात्मक सेटिंग में चूहों की संख्या को कम करने के लिए और तीन महीने के भीतर vivo प्रयोग में प्रदर्शन करने के लिए संभव बना दिया.

दवा/एंटीबॉडी खुराकों सेल लाइन और माउस तनाव के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । की सीमा के कारण इन विट्रो व्यवहार्यता परख extrapolating के लिए में vivo दवा/एंटीबॉडी खुराक ऊपर वर्णित, नैदानिक प्रासंगिक खुराक में vivo प्रयोगात्मक सेटिंग में दोनों topotecan और मॉब 8B6 के लिए बनाए रखा गया था, 26,27दूसरों के द्वारा प्रकाशित आंकड़ों के आधार पर । चूहों के लिए मानव खुराक सेटिंग एक्सट्रपलेशन करने के लिए, पहले से प्रकाशित दिशानिर्देश28 पीछा किया गया. प्रति एसई, हम एंटीबॉडी 8B6 i.v. के १५० µ जी इंजेक्शन 7 दिन में, एक दूसरे इंजेक्शन के बाद पांच दिन बाद (कुल खुराक/माउस = ३०० µ g) । Topotecan उपचार लगातार पांच दिनों के लिए ०.३६ मिलीग्राम/किलो Topotecan या पंजाब कंट्रोल आईएफसआई इंजेक्शन द्वारा पहले मॉब 8B6 इंजेक्शन के रूप में एक ही दिन शुरू कर दिया । महत्वपूर्ण कदम के विचार में यहां वर्णित है, हम अनुशंसा करते है एंटीबॉडी सुई लेनी शुरू जब ट्यूमर xenografts तक पहुंच ~ ५० mm3। ट्यूमर के बोझ स्पष्ट रूप से एंटीबॉडी एकाग्रता, एंटीबॉडी एक्सपोजर, और एंटीबॉडी प्रभावकारिता29के साथ व्युत्क्रम सहसंबंधी है क्योंकि उच्च ट्यूमर xenograft मात्रा एक कम प्रतिक्रिया की दर में परिणाम होगा । हम भी एक परीक्षण आहार16के प्रणालीगत सहनशीलता के एक संकेतक के रूप में वजन घटाने बनाए रखा । हालांकि, एकत्र वजन की व्याख्या एक बड़े ट्यूमर द्रव्यमान के साथ सहायक नहीं हो सकता है । इस मामले में, शरीर की स्थिति स्कोरिंग,16कहीं वर्णित के रूप में, की सलाह दी है ।

ट्यूमर immunochemistry विश्लेषण के लिए अलग समय बिंदुओं पर एकत्र किया जा सकता है, vivo मेंट्रिगर कार्रवाई के तंत्र के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने के लिए । पिछले एक काम में, ट्यूमर अपोप्तोटिक सूचकांक मॉब 8B6 अर्क13के बाद मूल्यांकन किया गया था । इस अंत करने के लिए, ट्यूमर अपोप्तोटिक कोशिकाओं एक TUNEL परख13का उपयोग कर पाए गए । इसके अलावा, ट्यूमर सेल नाभिक का प्रतिशत Ki67 प्रतिजन के साथ रन बनाए थे-सकारात्मक धुंधला ट्यूमर प्रसार सूचकांक13का विश्लेषण करने के लिए ।

गंभीर immunodeficient चूहों टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं के नुकसान के साथ सहज और अनुकूली उन्मुक्ति दोनों की कमी है, और प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं के साथ कम मैक्रोफेज और प्रतिजन-पेश सेल कार्यों और परिसंचारी पूरक के अभाव30. इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को vivo31में ट्यूमर microenvironment में फेरबदल करके potentiating मॉब थेरेपी में कीमोथेरेपी के ख्यात प्रभाव के बारे में कोई निष्कर्ष आकर्षित करने की अनुमति नहीं देता है । हालांकि, कीमोथेरेपी एजेंट के दोनों ख्यात इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव और ड्रग अर्बुदरोधी शक्ति योग्यता को बढ़ाने में मॉब के अंश-सघन (Fc) क्षेत्र की भूमिका विचार, लेकिन इन सवालों की उपलब्धता की आवश्यकता होती है एक एक बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली और एक शारीरिक ट्यूमर microenvironment के साथ syngeneic मॉडल ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

एस एफए., J.F., और S.B. लंबित विरोधी के नैदानिक आवेदन-O-एसिटाइल-GD2 चिकित्सीय एंटीबॉडी को कवर पेटेंट के अंवेषकों के रूप में नामित कर रहे हैं ।

Acknowledgments

ग्रांट सपोर्ट: शौकीन्स डे Projet डे L'Université डे नांत, लेस Bagouz ' à Manon, La Ligue contre le Cancer comité डे लॉयर-Atlantique, comité डु Morbihan, आणि comité डे गाहक, उणे रोज नमुने एस. ए. आर ए. ज, L'Etoile डे मार्टिन एंड ला Société फ़्रांसेज़ डे लट्टी contre लेस कैंसर एट लेस leucémies डे L'Enfant एट डे L'adolescent (SFCE) । M.B. और J.F. ला Ligue Contre Le Cancer द्वारा समर्थित हैं । लेखकों ने ूते-सुविधा की संरचना Fédérative de सभ्य फ़्रांस्वा Bonamy का शुक्रिया अदा किया । लेखकों ने डॉ॰ एस Suzin (Inserm, पेरिस) को IMR5 कोशिकाएं प्रदान करने के लिए और उसे तकनीकी सहायता के लिए सुश्री एच. Estéphan का भी धन्यवाद दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Proliferation kit (MTT) Roche 11-465-007-001
CompuSyn software ComboSyn Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver Bioseb BIO-1556
Fetal calf serum Eurobio CVFSVFF00-01 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox  Mozilla Corporation Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp Verre&Quartz 4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line Accegen Biotechnology ABC-TC0450 IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine Gibco 25030-024 2 mM in RPMI 1640
Lysis solution  Roche  11-465-007-001
mAb 8B6 University of Nantes N/A
Matrigel Corning 354248
Multiskan FC Thermofischer Scientific  N08625
Needle 21G 1 ½  BD Microlance 304432
Needle 25G 1 Terumo NN-2525R
NSG mice Charles River Laboratories 5557
Nunc MicroWell 96-well microplates Thermofisher 167008
PBS VWR L182-10
PBS, 0,05% EDTA Sigma-Aldrich E9884
PC that runs windows 7 Microsoft Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir Thermofischer Scientific 8094
Rodent restrainer Bioseb TV-150-SM
RPMI 1640 Gibco 31870-025
Syringe 1 mL Henke Sass Wolf 5010.200V0
Topotecan Sigma-Aldrich T2705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chou, T. C. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies. Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).
  2. Bayat Mokhtari, R., et al. Combination therapy in combating cancer. Oncotarget. 8 (23), 38022-38043 (2017).
  3. Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Frontiers in Pharmacology. 4, 28 (2013).
  4. Martin, T. P., Baguley, D., et al. Re: "Postoperative validation of bone-anchored implants in the single-sided deafness population." Snapp et al. Otol Neurotol 2012: 33;291-6. Otol Neurotol. 34 (4), 777-778 (2013).
  5. Choi, B., et al. Sensitization of lung cancer cells by altered dimerization of HSP27. Oncotarget. 8 (62), 105372-105382 (2017).
  6. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 317-327 (2010).
  7. Mellor, J. D., Brown, M. P., Irving, H. R., Zalcberg, J. R., Dobrovic, A. A critical review of the role of Fc gamma receptor polymorphisms in the response to monoclonal antibodies in cancer. Journal of Hematology & Oncology. 6, 1 (2013).
  8. Kowalczyk, A., et al. The GD2-specific 14G2a monoclonal antibody induces apoptosis and enhances cytotoxicity of chemotherapeutic drugs in IMR-32 human neuroblastoma cells. Cancer Letters. 281 (2), 171-182 (2009).
  9. Retter, M. W., et al. Characterization of a proapoptotic antiganglioside GM2 monoclonal antibody and evaluation of its therapeutic effect on melanoma and small cell lung carcinoma xenografts. Cancer Research. 65 (14), 6425-6434 (2005).
  10. Nakamura, K., et al. Apoptosis induction of human lung cancer cell line in multicellular heterospheroids with humanized antiganglioside GM2 monoclonal antibody. Cancer Research. 59 (20), 5323-5330 (1999).
  11. Cochonneau, D., et al. Cell cycle arrest and apoptosis induced by O-acetyl-GD2-specific monoclonal antibody 8B6 inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Cancer Letters. 333 (2), 194-204 (2013).
  12. Chou, T. C., Martin, N. CompuSyn for drug combinations: PC software and user’s guide: a computer program for quantitation of synergism and antagonism in drug combinations, and the determination of IC50 and ED50 and LD50 values. , ComboSyn Inc. Paramus, NJ. (2005).
  13. Alvarez-Rueda, N., et al. A monoclonal antibody to O-acetyl-GD2 ganglioside and not to GD2 shows potent anti-tumor activity without peripheral nervous system cross-reactivity. PLoS One. 6 (9), e25220 (2011).
  14. Faraj, S., et al. Neuroblastoma chemotherapy can be augmented by immunotargeting O-acetyl-GD2 tumor-associated ganglioside. Oncoimmunology. 7 (1), e1373232 (2017).
  15. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  16. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  17. Teicher, B. A. Assays for in vitro and in vivo synergy. Methods in Molecular Medicine. 85, 297-321 (2003).
  18. White, D. B., Slocum, H. K., Brun, Y., Wrzosek, C., Greco, W. R. A new nonlinear mixture response surface paradigm for the study of synergism: a three drug example. Current Drug Metabolism. 4 (5), 399-409 (2003).
  19. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  20. Huyck, L., Ampe, C., Van Troys, M. The XTT cell proliferation assay applied to cell layers embedded in three-dimensional matrix. Assay and Drug Development Technologies. 10 (4), 382-392 (2012).
  21. Thompson, J., et al. Synergy of topotecan in combination with vincristine for treatment of pediatric solid tumor xenografts. Clinical Cancer Research. 5 (11), 3617-3631 (1999).
  22. Tan, M., Fang, H. B., Tian, G. L., Houghton, P. J. Experimental design and sample size determination for testing synergism in drug combination studies based on uniform measures. Statistic in Medicine. 22 (13), 2091-2100 (2003).
  23. Tang, X. X., et al. Implications of EPHB6, EFNB2, and EFNB3 expressions in human neuroblastoma. Proceding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10936-10941 (2000).
  24. Mehta, R. R., Graves, J. M., Hart, G. D., Shilkaitis, A., Das Gupta, T. K. Growth and metastasis of human breast carcinomas with Matrigel in athymic mice. Breast Cancer Research and Treatment. 25 (1), 65-71 (1993).
  25. Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67 (6), 816-820 (1996).
  26. Feng, C., Tang, S., Wang, J., Liu, Y., Yang, G. Topotecan plus cyclophosphamide as maintenance chemotherapy for children with high-risk neuroblastoma in complete remission: short-term curative effects and toxicity. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 33 (8), 1107-1110 (2013).
  27. Cheung, N. K., et al. Ganglioside GD2 specific monoclonal antibody 3F8: a phase I study in patients with neuroblastoma and malignant melanoma. Journal of Clininical Oncology. 5 (9), 1430-1440 (1987).
  28. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  29. Dayde, D., et al. Tumor burden influences exposure and response to rituximab: pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling using a syngeneic bioluminescent murine model expressing human CD20. Blood. 113 (16), 3765-3772 (2009).
  30. Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
  31. Sherif, A., Winerdal, M., Winqvist, O. Immune Responses to Neoadjuvant Chemotherapy in Muscle Invasive Bladder Cancer. Bladder Cancer. 4 (1), 1-7 (2018).

Tags

कैंसर अनुसंधान अंक १४३ कैंसर अनुसंधान औषध विकास एंटीबॉडी-औषध संयोजन एंटीबॉडी-औषध संपर्क MTT परख एंटीबॉडी-औषध सिनर्जी संयोजन सूचकांक समीकरण इन विट्रो सेल लाइन मॉडल ट्यूमर xenograft मॉडल
Antineoplastic दवाओं द्वारा विरोधी एंटीबॉडी प्रभावकारिता की Potentiation: एंटीबॉडी-ड्रग सिनर्जी संयोजन सूचकांक समीकरण का उपयोग कर का पता लगाने
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., … More

Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., Ben Mostefa Daho, M., Fougeray, S., Birklé, S. Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation. J. Vis. Exp. (143), e58291, doi:10.3791/58291 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter