Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Potensiering av Anticancer antistoff effekten av Antineoplastic legemidler: påvisning av antistoff-stoff Synergism ved hjelp av kombinasjon Index formelen

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58291
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, *1, *1,3, *1,3
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan å vurdere synergism mellom et anticancer antistoff og antineoplastic legemidler i preklinisk modeller ved hjelp av kombinasjon indeks ligning Chou og Talalay.

Abstract

Potensiering av fiendtlige monoklonale antistoffer (mAb) av chemotherapeutic agenter utgjør en verdifull strategi for å utforme effektive og tryggere behandling mot kreft. Her gir vi en protokoll for å identifisere en rasjonell kombinasjon ved prekliniske trinn. Først beskrive vi et cellebasert analysen for å vurdere synergism mellom anticancer mAb og cytotoksiske medikamenter, som bruker kombinasjon indeks ligningen Chou og Talalay1. Dette inkluderer måling av svulst celle narkotika og antistoff-følsomhet ved hjelp av en MTT-analysen, etterfulgt av en automatisert datamaskinen analyse til å beregne de kombinasjon-indeksverdiene (CI). CI verdier for < 1 indikerer synergism mellom testet mAbs og cytotoksiske agenter1. For å bekrefte den i vitro funn i vivo, beskriver vi videre en metode for å vurdere kombinasjon diett effekten i en xenograft svulst modell. I denne modellen forsinker den kombinerte diett vesentlig tumor vekst, som resulterer i en betydelig utvidet overlevelse i forhold til single-agent kontroller. Viktigere, avslører i vivo eksperimentering at kombinasjonen diett er godt tolerert. Denne protokollen gir effektiv evalueringen av anticancer rusmiddelkombinasjoner i preklinisk modeller og identifikasjon av rasjonell kombinasjon å vurdere i kliniske forsøk.

Introduction

Konvensjonelle tilnærming i behandlingen av en rekke ulike typer kreft var basert på monoterapi. Selv om det er fortsatt brukt i mange tilfeller, møtte denne metoden flere hindringer fører til optisk for kombinert terapier2. Kreftceller er spesielt mer utsatt for å utvikle resistens når behandlet med et enkelt stoff av inducing alternativ overlevelse mekanismer3, som resulterer i terapeutisk feil i pasienter4. Videre i monoterapi, er narkotika vanligvis administreres på en høy dose. Denne situasjonen ofte resulterer i forekomsten av sterk doseavhengig bivirkninger som kan være utålelig og tvinge leger å stoppe behandling2. For disse grunner, association of anticancer molekyler er nå foretrukket å monoterapi.

Ideell rusmiddelkombinasjoner vil være de som fungere i synergi mot kreftceller, uten økt toksisitet mot normale celler. Synergism refererer til interaksjon av to eller flere stoffer som produserer en terapeutisk effekt som er større enn summen av enkelte rusmiddel handle separat. Slike interaksjoner kan føre til forbedret klinisk terapeutisk effekt2. Det begrenser behandling motstand øker effekten og kan også redusere toksisitet2. Faktisk reduseres dosen av hvert legemiddel for å redusere sine bivirkninger av målretting ulike veier. I tillegg kan en av molekyler også tjene som en sensibiliserende agent mot kreftceller. Effekten av stoffet på andreplass kan bli styrket på sensitivisert celler og færre doser kan være brukt5.

Kombinert behandling kan inneholde to eller flere cellegifter og/eller biologiske, for eksempel monoklonale antistoffer6. Disse mAbs spesifikt mål celler som uttrykker en celle-overflate antigen av interesse og er kjøpedyktig drepe kreftceller gjennom immunologiske trasé inkludert antistoff-avhengig celle-mediert cytotoksisitet (ADCC), med involvering av immun Effektor celler 7og komplement-avhengige cytotoksisitet (CDC)6. De kan også fungere via en ikke-immunologiske mekanisme formidlet av apoptose8,9,10,11. I dette tilfellet kan induksjon av prosessen med programmert celledød sensitize kreftceller, svekke deres funksjon og gjøre tilknyttede chemotherapeutic stoffet mer effektiv med en lavere dose. Slik proapoptotic mAb er gode kandidater for utforming kombinasjon regimer med antineoplastic stoffer.

Ulike matematiske modeller har blitt beskrevet for å vurdere narkotika synergism; en av dem er basert på kombinasjonen indeks metode1. Denne metoden er basert på median-effekt prinsippet utviklet av Chou1. Median-effekt ligningen korrelerer narkotika dose og narkotika effekt som følger.

Equation 1

Her er D narkotika dosen; DM er median-effekt dosen; FA er en brøkdel av dosen; m er en eksponent som angir formen av dose-effekten plot1. Median-effekt dosen brukes til å beregne dosen Dx av et stoff som hemmer eller dreper "x" prosent av cellene. CI verdien beregnes for å vurdere den additiv effekten av legemidlet kombinasjonen, slik1.

Equation 2

CI verdien 1 indikerer en additiv effekt og CI verdien < 1 indikerer en synergistisk effekt, mens CI verdien > 1 angir antagonisme1. Anvendelsen av denne metoden er mer tilrettelagt av tilgjengeligheten av et dataprogram, CompuSyn, som bestemmer synergism og antagonisme på alle doser eller effekt nivåer simulert automatisk12.

Vår gruppe har utviklet den mAb 8B6 spesifikt for O-acetyl-GD2 ganglioside (OAcGD2) neuroblastom antigen13 og videre demonstrerte at denne mAb er kjøpedyktig indusere celledød med attributter av apoptose11. For å teste om mAb 8B6 kan sensitize neuroblastom celler antineoplastic agent topotecan, tilpasset vi de ovenfor nevnte metoden utviklet av Chou1. Først fastslår vi effektive dose 50 (ED50) verdiene i mAb 8B6 og topotecan. Neste, neuroblastom cellene med equipotent prosenter av to forbindelser basert på ED50 verdier er utsatt for å bestemme CI verdiene med ovennevnte simuleringsprogram. Denne metoden tillater oss å demonstrere synergism mellom mAb 8B6 og topotecan i vitro. Deretter beskriver vi en protokoll for å vurdere videre styrken og sikkerheten til denne kombinasjonen diett i vivo. Denne protokollen kan lett brukes for å velge potent og trygt anticancer mAb og chemotherapeutic agent kombinasjoner i preklinisk studier. En skjematisk fremstilling av denne studien finnes i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyr bolig og eksperimentelle prosedyren ble godkjent av den franske regjering (avtaler #C44-278 og #APAFIS 03479.01). Dyr omsorg og prosedyrer ble utført under direktivet EU 2010/63/EU og fransk lov #2013-118 om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskaplige formål.

1. evaluering av narkotika interaksjon mellom mAb 8B6 og Topotecan I Vitro

  1. 96-brønns eksempel forberedelse
    FORSIKTIG: Se institusjonens helse og sikkerhet komiteen og følger lokale bestemmelser regler gjelder laboratorium sikkerhet. Se gjennom informasjon om materiale og sikkerhetsdatabladet før du arbeider med media, linjer eller reagenser. Bruke riktig steril teknikk og arbeid i laminær strømning hette. Alle løsninger/utstyr som brukes til å manipulere celler må sterilt.
    Merk: Følgende protokollen ble utviklet for bruk med tilhenger celler. Endringer må bruke metoden nonadherent cellene vokser i suspensjon; denne protokollen bruker quadruplicate for hver eksperimentelle tilstand.
    1. Vokse IMR5 celler i en MT75 bolle.
    2. På den første dagen (dag 0), observere cellekultur under et mikroskop du celle confluency. Sug opp cellen mediet kolbe, vask den med 5 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) og legge 3 mL 0,05% ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) / PBS løsning. Returnere flasken til inkubator for 3 min (37 ° C, 5% CO2).
    3. Undersøke cellekultur under et mikroskop for cellen avdeling.
      Merk: Eventuelt returnere flasken til inkubator for en ytterligere 3 til 5 minutter, avhengig av svulst celle type.
    4. Legge til 10 mL av komplett celle medium kolbe og overføre celle suspensjon slik konisk sterilt 15 mL. Sentrifuge celler for 5 min på 300 x g. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
    5. Fjerne og slette nedbryting. Resuspend celle pellet komplett vekst medium. Juster medium volum for å få en endelig konsentrasjon av 1 x 105 celler/mL.
    6. Frø 84 wells av en 96-brønnen plate med 104 celler hver, som er 100 µL av cellen suspensjon. Følg det eksperimentelle oppsettet som vist i figur 2.
    7. Inkuber celler for 18t i cellen inkubator (37 ° C, 5% CO2).
  2. Stoffet løsning forberedelse
    Merk: For narkotika/mAb sensibilisering studier, endre tidspunktet, lengden og konsentrasjon behandling å passe bestemt stoffet/mAb i spørsmålet. Merk at den innledende konsentrasjonen 3 x siste konsentrasjonen.
    1. Neste morgen (dag 1), forberede følgende narkotika løsninger ved hjelp av komplett vekst medium.
      1. mAb løsning forberedelse
        1. Fortynne mAb i 500 µL av komplett vekst medium å få et antistoff fungerende løsning med en mAb konsentrasjon av 240 µg/mL.
        2. Utføre fem todelt føljetong fortynninger som vist i figur 2.
      2. Topotecan løsning forberedelse
        1. Fortynne, som ovenfor, stoffet i 500 µL av komplett vekst medium å få en narkotika fungerende løsning med en siste konsentrasjon av 120 nM.
        2. Utføre fem todelt føljetong fortynninger som vist i figur 2.
      3. Antistoff og narkotika løsning forberedelse
        1. Fortynne stoffet og mAb løsningene i 500 µL av komplett vekst medium å få en løsning på 120 nM narkotika og 240 µg/mL mAb (fungerende løsning).
        2. Utføre fem todelt føljetong fortynninger som vist i figur 2.
    2. Ankomme siste konsentrasjonen, overføre 50 µL av hvert legemiddel løsning til tilsvarende brønnene, som angitt i oppsettet eksperimentelle ( figur 2).
      Merk: Overføre 50 µL av komplett vekstmediet i ubehandlet celle brønnene, som vist i figur 2.
    3. Inkuber celler for 72 timer i inkubator (37 ° C, 5% CO2).
  3. MTT analysen
    1. Legge til 10 µL av MTT reagens løsning i hver brønn.
    2. Ruge på 37 ° C 4 h.
    3. Legg 100 µL lysis løsning (10% SDS i 0.01 M HCl) i hver brønn, med en flerkanals pipette, og bland godt av pipettering.
    4. Ruge på 37 ° C 4 h i en fuktet kammer (95% fuktighet).
    5. Lese absorbans ved 570 nm (en570) og 620 nm (en620) bruker et spektrofotometer.
      Merk: Bland hver prøve igjen av pipettering før du leser absorbansen; absorbans ved 620 nm lar korreksjon av uspesifikke bakgrunn verdier.
    6. Beregne korrigert absorbansen: korrigert absorbansen = en570- en620.
    7. Beregne celle levedyktigheten som følger: celle levedyktighet = 100 x (eksempel mener korrigert absorbansen / kontroll betyr korrigert absorbans).
    8. Beregne brøk-berørte verdiene (Fa) ved hjelp av følgende ligning: 1 - (eksempel mener korrigert absorbansen / kontroll betyr korrigert absorbans).
  4. Stoffet samhandling analytisk simuleringsprogramvare for enkelt og narkotika kombinasjon studier
    1. Kjør simuleringsprogram for å åpne start-vinduet.
    2. Klikk på knappen Nytt eksperiment å åpne hovedvinduet .
    3. Skriv inn navnet på eksperimentet i vinduet navn .
      Merk: En dato kan legges i vinduet dato .
    4. Klikk på knappen Ny enkelt stoff .
    5. Skriv inn i vinduet Fullt navn .
    6. Skriv inn forkortelsen i vinduet Abbrev .
    7. Skriv inn konsentrasjon narkotikabehandling i vinduet enheter .
    8. Angi Data punkt 1 Dose og Fa verdien, trykker du Enter.
    9. Gjenta dette trinnet til alle datapunkter angis.
    10. Klikk på ferdig -knappen.
    11. Følg de samme trinnene for å angi mAb datapunkt.
      Merk: Bruk samme konsentrasjon enhet som brukes av narkotika.
    12. Klikk på knappen Ny narkotika kam .
    13. Velg narkotika og mAb.
    14. Velg Konstant andel og klikk på OK.
    15. Skriv inn i vinduet Fullt navn .
    16. Skriv inn forkortelsen i vinduet Abbrev .
    17. Skriv inn stoffet/mAb forholdet i vinduet forholdet .
    18. Angi Data punkt 1 Dose og trykk Enter.
      Merk: Programmet automatisk beregne doser av mAb og Combo.
    19. Angi Data punkt 1 Fa verdien, og trykk Enter.
    20. Gjenta dette trinnet til alle datapunkter angis.
    21. Klikk på ferdig -knappen, og klikk deretter på knappen Generer rapport .
    22. Velg narkotika og mAb, og klikk deretter OK.
    23. Velg Combo , og klikk deretter OK.
    24. Velg topptekst, CI tabellenog tabellen. Klikk deretter OK.
    25. Skriv inn navnet på filen analyse og klikk Lagre for å generere rapporten.
      Merk: Når du klikker OK, rapporten åpnes automatisk i datamaskinens standardwebleser.
    26. Rapporten skrives ut, velger du Skriv ut fra web-leserens Fil-meny. Rapporten inneholder et Sammendrag tabellen avsnitt tittel, dato, navn, beskrivelse Merk, parametere (m, Dm og r), ED50 enten agent brukes i monoterapi eller i kombinasjon, og tabellen CI for hver kombinasjon på ED50, ED 75, ED90og ED95.
      Merk: CI verdien < 1 angir synergism, CI verdien = 1 angir additivity og CI verdien > 1 angir antagonisme.

2. generasjon av menneskelig neuroblastom Xenografts i Nonobese diabetiker NIKK Scid Gamma mus (NSG mus)

NOTE Utelukke enhver kontaminering av cellekultur. Siden kjelleren membran matrix danner en gel over 5 ° C, bør alle cultureware eller media kommer i kontakt med kjelleren membran matrix reagensen være prechilled/is-kaldt. Holde kjelleren membran matrix på is under hele prosessen.

  1. Utarbeidelse av IMR5 celle suspensjon
    1. Tine kjelleren membran matrix reagensen natten av submerging ampullen i isen i kjøleskap 4 ° C før bruk.
    2. På dag 0, høste kulturperler IMR5 cellene som beskrevet ovenfor.
    3. Overføre cellene til en 15 mL konisk rør og sentrifuge på 300 x g for 5 min.
    4. Kast nedbryting. Vask cellene 2 x med 15 mL iskald PBS, og forberede en celle suspensjon av 5 x 107 celler/mL i iskalde PBS.
      Merk: Om nødvendig overføre celle suspensjon slik 1,5 mL microcentrifuge.
    5. Swirl kjelleren membran matrix ampullen.
      Merk: Kjelleren membran matrix reagensen bør Tint og spredt.
    6. Legg ett volum av kjelleren membran matrix reagensen og bland det av pipettering for å få en celle suspensjon av 2.5 x 107 celler /mL.
    7. Holde celle suspensjon på is.
  2. Forberedelse av mus
    Merk: Mus bør være seks til syv uker gamle.
    1. Opprettholde mus under en bestemt patogen-fri tilstand.
    2. Tillate en tre - til fem - dagers Akklimatisering periode etter mus har kommet.
    3. Ved vaksinasjon, barbere flanken hvor injeksjon blir (se trinn 2.3.6).
  3. Utarbeidelse av svulst celle injeksjon
    Merk: Holde iskald kjelleren membran matrix celle suspensjon aseptiske i hele denne prosedyren.
    1. Bland cellene og nøye trekke celle suspensjon i 1 mL sprøyte montert med en 21 G nål.
    2. Kontroller at det er ingen luftbobler i sprøyten.
    3. Desinfiser inoculation området av musen med en antiseptisk løsning.
    4. Forsiktig klem musen er huden på flanken mellom fingrene, på injeksjonsstedet.
    5. Sett inn nålen nøyaktig i hudfold. Ikke plasser nålen dypt inn i vevet å sikre en injeksjon.
    6. Injisere 100 µL IMR5 celle hjuloppheng (dvs.2,5 x 106 celler) subcutaneously i nedre høyre flanke av mus.
    7. Rotere sprøyten for å unngå lekkasje og trekke nålen.
  4. Overvåking av kropp vekt endringer og tumor vekst
    1. Måle lengden (A) og bredden (B) av svulst med en tykkelse.
    2. Beregne svulst volumet ved hjelp av formelen (A x B2) x 0,5.
    3. Starte behandling når tumorer har nådd en gjennomsnittlig volum ~ 50-60 mm3.

3. narkotika og antistoff administrasjon i mus

  1. Intravenøs administrasjon av mAb 8B6
    1. Omhyggelig fylle en 1 mL sprøyte montert med en 25 G nål mAb løsning.
    2. Plass musen under en varmelampe i 10 min å dilate hale venen.
    3. Holde musen i en gnager restrainer.
    4. Desinfiser inoculation området av musen med en antiseptisk løsning.
    5. Sett inn nålen parallelt med halen blodåre, gjennomtrengende 2-4 mm i lumen samtidig skråkant av nålen ansiktet oppover (figur 3A).
    6. Injisere 100 µL av antistoff løsning intravenøst (IV).
    7. Når injeksjon er ferdig, forsiktig presset injeksjonsstedet å hindre blødning.
  2. Intraperitoneal administrasjonen av topotecan
    1. Tegne narkotika løsningen i en 1 mL sprøyte montert med en 25 G nål.
    2. Hold musen i supine posisjon, med bakre enden litt forhøyet.
    3. Desinfiser inoculation området av musen med en antiseptisk løsning.
    4. Finn musen er magen midtlinjen og mentalt dele magen i kvadranter. Finn injeksjonsstedet i høyre eller venstre lavere kvadrant (figur 3B).
    5. Sett inn nålen i magen (5 mm dyp) i ~ 10° vinkel i høyre eller venstre lavere kvadranten.
    6. Injisere 100 µL av narkotika løsning intraperitoneally (IP).
    7. Desinfiser inoculation området.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representant resultater og tall er tilpasset med tillatelse fra tidligere utgitte verk14.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 forbedrer synergi hemmende effekten av Topotecan på neuroblastom cellevekst linje:

Å etablere stoffet og antistoff konsentrasjonen skal brukes for å vurdere synergism mellom topotecan og mAb 8B6, stoffet og antistoff problemområdene av menneskelig IMR5 neuroblastom celler ble målt først bruke en MTT-analysen. Eksponering for mAb 8B6 eller topotecan alene 72 h resulterte i en konsentrasjon-avhengige hemming av IMR5 celle levedyktighet (figur 4A). Dose-respons kurver tillatt beregningen av ED50 verdier for hver sammensatte. Dette ble Fa verdier beregnet ved hjelp av analyse simuleringsprogramvare. De beregnede ED50 verdiene ble funnet for å være 10 nM ± 1 for topotecan (figur 4B) og 18 µg/mL ± 3 for mAb 8B6 (data ikke vist).

Basert på disse ED50 verdiene, deretter testet styrken på seks combinational equipotent prosenter mAb 8B6 og topotecan ble (figur 2). Skifte av kombinasjon dose-respons kurve mot den sensitive siden av grafen indikerer at kombinasjonen diett er mer potent enn hver monoterapi (figur 4A). For å oppnå den tilsvarende ED50 og CI verdier, ble Fa verdier beregnet. ED50 verdiene for topotecan var betydelig lavere i nærvær av mAb 8B6 (p < 0,05, figur 4B), som indikerer at mAb 8B6 sensitizes svulst celle til topotecan. Viktigere, var CI verdiene betydelig mindre enn 1,0 (p < 0,05), demonstrere en synergistisk interaksjon (figur 5). Dermed har mAb 8B6 potensial som adjuvant terapeutisk agent for topotecan kjemoterapi.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 forbedrer Antitumor aktivitet av Topotecan I Vivo

Fordi i vitro modeller heller ta hensyn halveringstiden narkotika eller narkotika stoffskiftet, er det nødvendig å bekrefte det i vitro funn i vivo. Videre er i vivo modeller svært nyttig å vurdere kombinasjon diett sikkerheten. For å bekrefte at synergism mellom topotecan og mAb 8B6 var spesifikke for kreftceller, ble antineuroblastoma effekten av Kombinasjonsbehandling i en svulst xenograft modell vurdert. For dette, ble alvorlig immunodeficient NSG musen belastningen valgt. Disse musene mangler både en medfødt og en adaptive immunsystemet15, og derfor gjør det mulig for forskere å utelukke immunmodulerende effekter av topotecan terapi som kan påvirke mAb styrke. Behandling ble startet når svulstene vises et gjennomsnittlig antall 50 ± 2,53 (figur 6A). Behandlingene bestod av enten mAb 8B6 (150 µg IV, dag 7 og dag 11), topotecan (0.36 mg/kg IP, dager 7-11) eller en kombinasjon av mAb 8B6 og topotecan. Svulst volumene var overvåket i løpet av eksperimentering. Alle terapi førte til tumor vekst retardasjon sammenlignet med kontroll grupper (figur 6A). Den kombinasjon diett, men indusert sterkeste effekten (figur 6A).

Tumorveksten kan analyseres videre for å studere overlevelse på behandling. Dette ble arrangementet resulterer i musen euthanasia definert som tumor volum ≥ 1 cm3 etiske grunner. Dette tillot oss å utføre en Kaplan-Meyer overlevelse analyse og beregne medianen hendelse-fri overlevelse tid for hver eksperimentelle. Som vist i figur 6B, begge monotherapies forbedret hendelse-fri overlevelse (EFS) vesentlig sammenlignet med kontroll grupper (medianen EFS av gruppen kjøretøy-behandlet var 21 dager av antistoff kontrollgruppen, 22 dager; av gruppen topotecan, 26 dager ; av mAb 8B6 group, 29 dager [figur 6B]). Likevel, den kombinerte terapien hadde sterkeste effekt på mus overlevelse, med en median EFS til 39.5 dager (p < 0,05, mAb 8B6 vs kombinasjon; p < 0,01, topotecan vs kombinasjon [figur 6B]).

Fordi synergistisk interaksjoner kan resultere i økt toksisitet, må kombinasjonen diett sikkerheten vurderes. Som sådan, er vekttap ofte brukt som en følsom markør for helseovervåking i gnagere16. Dermed vekt tap-målt som en nedgang i prosent fra første vekten-som en indikator på den systemiske toleranse av hver testet diett. Ingen tap av kroppsvekt ble observert, antyder at behandling var godt tolerert (figur 7). Disse data tyder på at kombinasjonen av topotecan pluss mAb 8B6 representerer en mer potent antitumor effekt i vivo enn enten agent alene, uten synlig toksisitet.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av studien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Oppsett av kombinasjon forsøket på en 96-brønns plate med størrelsesforhold på topotecan-å-mAb 8B6, tilberedt som seks løsninger. Løsningene ble utarbeidet som beskrevet i protokollen. Brønner merket 1 til 4 tjene som mAb 8B6 løsninger, brønner merket 5 til 8 tjene som topotecan løsninger og brønner merket 9 til 12 tjene som mAb 8B6 og topotecan (kombinasjon) løsninger. Wells merket A og H tjene som kontroller. brønner merket B tjene som 0.125 x ED50 konsentrasjon narkotika løsninger; brønner merket C tjene som 0,25 x ED50 konsentrasjon narkotika løsninger; brønner merket D tjene som 0.5 x ED50 konsentrasjon narkotika løsninger; brønner merket E tjene som ED50 konsentrasjon narkotika løsninger; brønner merket F tjene 2 x ED50 konsentrasjon narkotika løsninger; brønner merket G tjene som 4 x ED50 konsentrasjon narkotika løsninger, som angitt. Terapeutiske agenter med to forskjellige enheter (dvs.µg/mL for mAb 8B6 og nM for topotecan) analyseres i en fast-ratio kombinasjon (0.075, topotecan/8B6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Injeksjoner. (A) intravenøs injeksjon i halen åre behersket mus, med en insulinsprøyte av 27 G x 1/2 i 1 mL. (B) Intraperitoneal injeksjon til den nederste høyre kvadranten av musen er magen, med en 1 mL sprøyte montert med en 25 G nål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Dose-virkning forholdet topotecan, mAb 8B6 og deres kombinasjon på vekst levedyktighet hemming av IMR5 neuroblastom celler etter 72 h eksponering. MTT analysen ble utført som beskrevet i protokollen. (A) dose-respons kurver vist er av tre uavhengige replikat, hver kjører i quadruplicates. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SD; p < 0,001. (B) ED50 av topotecan brukes som eneste agent eller sammen med mAb 8B6. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. Dette tallet har blitt endret fra Faraj et al. 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 5
Figur 5 : Kombinasjon indeksverdiene. Prosentverdier overlevelse var forvandlet brøkdel berørt (Fa) verdier og brukes til å beregne kombinasjon indeksen (mål synergi, additivity og antagonisme) ved hjelp av programvare, som angitt i teksten. I kombinasjon indeks tomter presenteres dataene som mener ± SD for tre uavhengige gjentak. Resultatene viser at mAb 8B6 hadde en synergistisk effekt med topotecan (CI < 1). Dette tallet har blitt endret fra Faraj et al. 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Kombinasjonsbehandling av IMR5 xenografts i NSG mus med mAb 8B6 pluss topotecan. (A) mus bærer menneskelig neuroblastom IMR5 xenografts ble behandlet med kjøretøy (PBS, IP), topotecan alene (0.36 mg/kg, IP) kontrollere IgG alene (150 µg, IV), mAb 8B6 alene (IV) eller topotecan og mAb 8B6 kombinert, som angitt. Administrasjon av mAb 8B6 eller kontroll antistoff behandling startet på dag 7 etter IMR5 celle inoculation og ble gjentatt én gang på dag 11. Topotecan eller PBS behandling ble startet på dag 7 og gitt i fem påfølgende dager. Tumor vekst var overvåket, og svulst volumer ble beregnet. Mener svulst volum ± SEM av hver behandlingsgruppe (PBS gruppe, 9 mus, alle andre grupper, 10 mus) er avbildet (* p < 0,05 for mAb 8B6 mot mAb 8B6 og topotecan sammen, ** p < 0,01 for topotecan mot mAb 8B6 og topotecan sammen), som angitt. En betydelig reduksjon i xenograft volumet ble observert for mAb 8B6/topotecan kombinasjonen, sammenlignet med narkotika-alene kontrollene, som indikert (p < 0,05). (B) hendelse-fri overlevelse Kaplan-Meyer kurver av ulike behandlet vises. Dette tallet har blitt endret fra Faraj et al. 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Mener vekt for hver behandling, som indikert. Mener vekten av musene på dag 0 ble definert som 100% vekt. Vekten i hver gruppe stabilt i perioden behandling. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. Dette tallet har blitt endret fra Faraj et al. 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tre metoder kan brukes for å forutsi effekten av interaksjoner,: de isobologram metodikk17og ikke-lineære blanding modell18kombinasjonen indeksere1. Kombinasjon indeks analyse er mest vanlig fordi programmet er forenklet av tilgjengeligheten av et brukervennlig program. For dette formålet preget vi først dose-effekt svar hver agent brukes alene eller i kombinasjon, ved å utføre en MTT analysen19. Denne metoden bruker på levedyktige cellers evne til å redusere tetrazolium salt i en lilla-farget formazan produkt med en absorbansen opptil 570 nm19. Ved død mister cellene evnen til å konvertere MTT i formazan. Dermed er antallet fargede formazan produktet proporsjonal med antall levedyktig celler i kultur19. Faktisk valgte vi denne metoden som et nonradioactive alternativ til tritiated thymidine kommisjonsforordning DNA for å måle celle spredning19. Som sådan, MTT analyser har vært allment vedtatt og fortsatt populær i akademiske labs som gjenspeiles av tusenvis av publiserte artikler. Mens antall formazan måles ved absorbans ved 570 nm bruker en plate-lesing kommer en referanse bølgelengde på 620 nm er noen ganger brukt, men ikke nødvendig for de fleste analysen forhold. Hensynet til det kritiske trinnet beskrevet her, fant vi at oppdrettsforholdene dyrkes celler kan påvirke resultatene av MTT analyser. Vi fant at levedyktig celle nummer, celle metabolske aktiviteten, i en alder av kulturer og antall passasjer og detaljer om vekstmediet kan alle være viktige faktorer. Dermed de må tas i betraktning når gjentatte analysen og analysere data. Videre variere celle oppdrettsforholdene for hver linjer. Det er dermed komplisert for å gi noen klare indikasjoner om cellen seeding tetthet. Som en tommelfingerregel, en gjennomsnittlig antall celler mellom 2000-10 000 celler per brønn anbefales å oppnå en optimal celle tetthet innen 72 h. viktigere, MTT reduksjon reflekterer levedyktig celle metabolisme og ikke spesielt celle spredning eller celle død. Derfor MTT analyser bør heller ikke beskrives som måler celle spredning eller celle cytotoksisitet20,11. Oppdagelsen av celledød, avhengig av spesifikke cellebasert analyser. For eksempel i tidligere studier brukte vi western blot analyse å merker caspase 3 aktivisering og/eller flow cytometri analyse for å oppdage fosfatidylserin i ytre plasma membran pakningsvedlegget, til bevis proapoptotic aktiviteten mAb 8B613.

Når kombinasjonen testing narkotika, kan de leveres sammen eller suksessivt i tid. Gitt en rekke virkningsmekanismen, er det vanskelig å gi nøyaktige retningslinjer for eksperimentell innstillingen. Likevel, de fleste etterforskerne bruke direkte testing av rusmiddelkombinasjoner. I tillegg brukes ofte konsentrasjoner som produserer en definert single-agent effekt av 50% celle vekst hemming. Stoffet konsentrasjoner reflekterer Plasmakonsentrasjon oppnåelig i pasienter betraktes vanligvis som relevante klinisk. Slik kombinasjon dose-effekt analysen utføres flere doser, holde kombinasjon forholdet konstant med en seriell fortynning av (ED50)mAb/ (ED50)stoffet forhold, selv om det ikke er et absolutt krav 1. Legg merke CI verdiene bør også beregnes på ulike ED testet (f.eks, ED50, ED75og ED90) fordi de kan endres med de i en lineær måte1. Etter utfører automatisk analyse av CI verdiene, lineær korrelasjonskoeffisienten r-anslåtte av algoritmer skal > 0,9, å reflektere godhet av fit av eksperimentelle data. CI verdier for < 1 indikerer synergi, CI verdier = 1 indikerer additivity og CI verdiene i > 1 betegne antagonisme1. På grunn av variasjon i både eksperimentelle metoder og de biologiske system, bør beregnet CI videre utsettes for statistiske vurdering. Som sådan, er en enkel metode å gjenta narkotika kombinasjon eksperimentet flere ganger etterfulgt av beregningen av CI resultatverdiene før du bestemmer statistikken for gjennomsnittlig ± SD1. Det anbefales også å teste kombinasjonen i største mulige panel av linjer, ta hensyn variasjon som eksisterer mellom dem.

Viktigere, tas flere parametere i studien i vitro ikke i betraktning for ekstrapolering i vivo . For eksempel de i vitro levedyktighet analyser heller ta hensyn i vivo halveringstiden av stoffet, eller i vivo narkotika stoffskiftet som kan resultere i narkotika inaktivering. Dermed ekstrapolering fra in vitro in vivo forblir et separat spørsmål, og gunstig narkotika samhandling gjenspeiles i vitro skal ytterligere bekreftet i vivo. Som sådan, har en klar demonstrasjon synergi i mus bærer svulst xenografts, med metoden kombinasjon indeksen vært utgitt21. Likevel, i vivo studier krever mange dyr til å nøyaktig definere synergi og er dyrere og mer tidkrevende. Alternative effektiv modellen F-test krever fortsatt betydelige ressurser22. Som en annen tilnærming til å begrense bruken av en rekke dyr består demonstrere narkotika synergi i celle kultur modeller etterfulgt av bevis for en økt antitumor respons kombinasjonen i en begrenset xenograft studie14, brukte vi menneskelige neuroblastom IMR5 cellene som tumor mål for studier i vivo . Vi beholdt IMR5 celler fordi de er tumorigenic i immunsupprimerte mus23. Menneskelige svulst xenograft modeller gir verdifull modeller for å teste stoffet kombinasjoner i vivo24, kan det være vanskelig å etablere slike modeller fra en rekke cellen linjer25. For å øke forekomsten av tumor formasjon i mus, kan celler injiseres i mus med en membran kjelleren matrise som et kjøretøy25. Viktigere, siden membranen kjelleren matrise polymerizes og stivner ved temperaturer over 5 ° C, alle cultureware eller media kommer i kontakt med membranen kjelleren matrix bør være prechilled/is-kaldt, og membranen kjelleren løsningene bør holdes på is under hele prosessen25. Med bruk av membran kjelleren matrix, observerte vi en 100% ta rate med IMR5 celler, mens, i fravær av membran kjelleren matrise, denne cellen linjen vist en < 80% ta rate (data ikke vist). I tillegg for å øke forekomsten av svulst pode, kan membran kjelleren matrise også øke tumor vekst rate25. Observerte vi at alle xenografts hadde dukket opp ved dag 11. Men i de første sju dagene etter svulst celle utfordring, kunne tilstedeværelse av klumper observeres, som kan være forårsaket av tilstedeværelsen av den første inoculum (data ikke vist). Dermed vurdere vi ikke målinger av tumor størrelse meningsfull før dette tidspunktet. Bruker membran kjelleren matrix gjort det mulig å redusere antall mus i innstillingen eksperimentelle og utføre eksperimentet i vivo innen tre måneder.

Drug/antistoff doser kan variere avhengig av cellen linje og mus belastningen. På grunn av begrensning av levedyktighet i vitro analysen for å ekstrapolere i vivo stoffet/antistoff dosering beskrevet ovenfor, beholdes klinisk relevante doser for både topotecan og mAb 8B6 i vivo eksperimentelle innstillingen, basert på dataene ved26,27. For å ekstrapolere innstillingen menneskelige dosering til mus, ble tidligere publisert retningslinjer28 fulgt. Per se, vi injisert 150 µg av antistoff 8B6 IV på dag 7, etterfulgt av en andre injeksjon fem dager senere (totalt dose/mus = 300 µg). Topotecan behandling startet samme dag som første mAb 8B6 injeksjon ved å injisere 0.36 mg/kg topotecan eller PBS kontroll IP i fem påfølgende dager. Hensynet til det kritiske trinnet beskrevet her, anbefaler vi starter antistoff infusjoner når svulst xenografts ~ 50 mm3. Høyere svulst xenograft volumer medfører en lavere svarprosent fordi svulst byrder tydelig relatere omvendt med antistoff konsentrasjon, antistoff eksponering og antistoff effekt29. Vi har også beholdt vekttap som en indikator på systemisk toleranse hver testet diett16. Men tolkningen av samlet vekter kan ikke være nyttig med en stor svulst masse. I dette tilfellet anbefales kroppen tilstand scoring, som beskrevet andre steder16.

Svulster kan samles på ulike tidspunkt for immunochemistry analyse, å gi ytterligere informasjon om mekanismen for action utløst i vivo. I en tidligere arbeid, ble svulst apoptotisk indeksen vurdert etter mAb 8B6 infusjon13. Dette ble apoptotisk kreftceller oppdaget ved hjelp av en tunnel analysen13. I tillegg ble prosentandelen av svulst celle kjerner scoret med Ki67 antigen-positive flekker å analysere svulst spredning indeks13.

Alvorlig immunodeficient mus mangler både medfødte og adaptive immunitet med tap av T celler og B-celler naturlig killer (NK) celler med redusert macrophage og antigen-presentasjon celle funksjoner og fravær av sirkulerende supplement30. Denne protokollen tillater derfor ikke forskere å trekke noen konklusjoner om mulige effekter av kjemoterapi i potentiating mAb terapi ved å endre svulst microenvironment i vivo31. Men både antatte immunmodulerende effekter av chemotherapeutic agent og rollen fragment-crystallizable (Fc) regionen mAb i styrke narkotika antitumor styrken fortjener vurdering, men disse spørsmålene krever tilgjengelighet av en syngeneic modell med en intakt immunsystem og en fysiologisk svulst microenvironment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.Fa., J.F. og SB er angitt som oppfinnerne av ventende patenter som omfatter klinisk anvendelse av anti-O-acetyl-GD2 terapeutiske antistoffer.

Acknowledgments

Gi støtte: Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, les Bagouz' à Manon, La Ligue contre le kreft comité de Loire-Atlantique, comité du Morbihan, og comité de Vendée, une steg hell S.A.R.A.H, L'Etoile de Martin og la Société Française de Lutte contre les Kreft et les leucémies de L'Enfant et de L'adolescent (SFCE). MB og J.F. støttes av La Ligue Contre Le kreft. Forfatterne takker UTE-anlegget på struktur Fédérative de Recherche François Bonamy. Forfatterne også takke Dr. S. Suzin (Inserm, Paris) for å gi IMR5 cellene og Ms. H. Estéphan for hennes kundestøtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Proliferation kit (MTT) Roche 11-465-007-001
CompuSyn software ComboSyn Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver Bioseb BIO-1556
Fetal calf serum Eurobio CVFSVFF00-01 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox  Mozilla Corporation Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp Verre&Quartz 4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line Accegen Biotechnology ABC-TC0450 IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine Gibco 25030-024 2 mM in RPMI 1640
Lysis solution  Roche  11-465-007-001
mAb 8B6 University of Nantes N/A
Matrigel Corning 354248
Multiskan FC Thermofischer Scientific  N08625
Needle 21G 1 ½  BD Microlance 304432
Needle 25G 1 Terumo NN-2525R
NSG mice Charles River Laboratories 5557
Nunc MicroWell 96-well microplates Thermofisher 167008
PBS VWR L182-10
PBS, 0,05% EDTA Sigma-Aldrich E9884
PC that runs windows 7 Microsoft Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir Thermofischer Scientific 8094
Rodent restrainer Bioseb TV-150-SM
RPMI 1640 Gibco 31870-025
Syringe 1 mL Henke Sass Wolf 5010.200V0
Topotecan Sigma-Aldrich T2705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chou, T. C. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies. Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).
  2. Bayat Mokhtari, R., et al. Combination therapy in combating cancer. Oncotarget. 8 (23), 38022-38043 (2017).
  3. Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Frontiers in Pharmacology. 4, 28 (2013).
  4. Martin, T. P., Baguley, D., et al. Re: "Postoperative validation of bone-anchored implants in the single-sided deafness population." Snapp et al. Otol Neurotol 2012: 33;291-6. Otol Neurotol. 34 (4), 777-778 (2013).
  5. Choi, B., et al. Sensitization of lung cancer cells by altered dimerization of HSP27. Oncotarget. 8 (62), 105372-105382 (2017).
  6. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 317-327 (2010).
  7. Mellor, J. D., Brown, M. P., Irving, H. R., Zalcberg, J. R., Dobrovic, A. A critical review of the role of Fc gamma receptor polymorphisms in the response to monoclonal antibodies in cancer. Journal of Hematology & Oncology. 6, 1 (2013).
  8. Kowalczyk, A., et al. The GD2-specific 14G2a monoclonal antibody induces apoptosis and enhances cytotoxicity of chemotherapeutic drugs in IMR-32 human neuroblastoma cells. Cancer Letters. 281 (2), 171-182 (2009).
  9. Retter, M. W., et al. Characterization of a proapoptotic antiganglioside GM2 monoclonal antibody and evaluation of its therapeutic effect on melanoma and small cell lung carcinoma xenografts. Cancer Research. 65 (14), 6425-6434 (2005).
  10. Nakamura, K., et al. Apoptosis induction of human lung cancer cell line in multicellular heterospheroids with humanized antiganglioside GM2 monoclonal antibody. Cancer Research. 59 (20), 5323-5330 (1999).
  11. Cochonneau, D., et al. Cell cycle arrest and apoptosis induced by O-acetyl-GD2-specific monoclonal antibody 8B6 inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Cancer Letters. 333 (2), 194-204 (2013).
  12. Chou, T. C., Martin, N. CompuSyn for drug combinations: PC software and user’s guide: a computer program for quantitation of synergism and antagonism in drug combinations, and the determination of IC50 and ED50 and LD50 values. , ComboSyn Inc. Paramus, NJ. (2005).
  13. Alvarez-Rueda, N., et al. A monoclonal antibody to O-acetyl-GD2 ganglioside and not to GD2 shows potent anti-tumor activity without peripheral nervous system cross-reactivity. PLoS One. 6 (9), e25220 (2011).
  14. Faraj, S., et al. Neuroblastoma chemotherapy can be augmented by immunotargeting O-acetyl-GD2 tumor-associated ganglioside. Oncoimmunology. 7 (1), e1373232 (2017).
  15. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  16. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  17. Teicher, B. A. Assays for in vitro and in vivo synergy. Methods in Molecular Medicine. 85, 297-321 (2003).
  18. White, D. B., Slocum, H. K., Brun, Y., Wrzosek, C., Greco, W. R. A new nonlinear mixture response surface paradigm for the study of synergism: a three drug example. Current Drug Metabolism. 4 (5), 399-409 (2003).
  19. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  20. Huyck, L., Ampe, C., Van Troys, M. The XTT cell proliferation assay applied to cell layers embedded in three-dimensional matrix. Assay and Drug Development Technologies. 10 (4), 382-392 (2012).
  21. Thompson, J., et al. Synergy of topotecan in combination with vincristine for treatment of pediatric solid tumor xenografts. Clinical Cancer Research. 5 (11), 3617-3631 (1999).
  22. Tan, M., Fang, H. B., Tian, G. L., Houghton, P. J. Experimental design and sample size determination for testing synergism in drug combination studies based on uniform measures. Statistic in Medicine. 22 (13), 2091-2100 (2003).
  23. Tang, X. X., et al. Implications of EPHB6, EFNB2, and EFNB3 expressions in human neuroblastoma. Proceding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10936-10941 (2000).
  24. Mehta, R. R., Graves, J. M., Hart, G. D., Shilkaitis, A., Das Gupta, T. K. Growth and metastasis of human breast carcinomas with Matrigel in athymic mice. Breast Cancer Research and Treatment. 25 (1), 65-71 (1993).
  25. Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67 (6), 816-820 (1996).
  26. Feng, C., Tang, S., Wang, J., Liu, Y., Yang, G. Topotecan plus cyclophosphamide as maintenance chemotherapy for children with high-risk neuroblastoma in complete remission: short-term curative effects and toxicity. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 33 (8), 1107-1110 (2013).
  27. Cheung, N. K., et al. Ganglioside GD2 specific monoclonal antibody 3F8: a phase I study in patients with neuroblastoma and malignant melanoma. Journal of Clininical Oncology. 5 (9), 1430-1440 (1987).
  28. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  29. Dayde, D., et al. Tumor burden influences exposure and response to rituximab: pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling using a syngeneic bioluminescent murine model expressing human CD20. Blood. 113 (16), 3765-3772 (2009).
  30. Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
  31. Sherif, A., Winerdal, M., Winqvist, O. Immune Responses to Neoadjuvant Chemotherapy in Muscle Invasive Bladder Cancer. Bladder Cancer. 4 (1), 1-7 (2018).

Tags

Kreftforskning problemet 143 forskning narkotika utvikling antistoff-narkotika kombinasjon antistoff-legemiddelinteraksjoner MTT analysen antistoff-stoff synergi kombinasjon indeks ligningen i vitro celle linje modell svulst xenograft modell
Potensiering av Anticancer antistoff effekten av Antineoplastic legemidler: påvisning av antistoff-stoff Synergism ved hjelp av kombinasjon Index formelen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., … More

Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., Ben Mostefa Daho, M., Fougeray, S., Birklé, S. Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation. J. Vis. Exp. (143), e58291, doi:10.3791/58291 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter