本方案描述了一种心脏前体细胞的内皮分化技术，重点介绍血清浓度和细胞接种密度如何影响内皮分化潜能。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
心脏祖细胞（CPCs）在损伤后心脏再生中可能具有治疗潜力。在成年哺乳动物心脏中，内源性CPCs极为稀少，但扩增后的CPCs可能对细胞治疗具有应用价值。其应用的前提是能够通过明确且高效的方案，可控地分化为多种心脏谱系细胞。此外，从患者或临床前疾病模型中分离的CPCs在体外扩增后，可为研究疾病机制提供有价值的工具。 体外 扩增后，从患者或临床前疾病模型中分离的CPCs可为疾病机制的研究提供有效的研究工具。
目前的研究使用不同的标志物来鉴定心脏祖细胞（CPCs）。然而，并非所有这些标志物均在人类中表达，这限制了某些临床前研究的转化价值。无论分离技术或标志物表达如何，均可适用的分化方案将有助于实现CPCs在细胞治疗应用中的标准化扩增与预处理。本文描述了在低胎牛血清（FBS）浓度和低细胞密度条件下对CPCs进行预处理，可促进其向内皮细胞分化。通过使用小鼠和大鼠CPCs的两个不同亚群，我们证明在以下方案中，层粘连蛋白（laminin）比纤连蛋白（fibronectin）更适合作为此目的的基质：在含有维持多能性添加剂并添加3.5% FBS的培养基中培养2–3天后，将CPCs以低于60%融合度接种于层粘连蛋白上，并在不含添加剂、仅含低浓度FBS（0.1%）的培养基中培养20–24小时，随后转入内皮细胞分化培养基进行分化。由于CPCs为异质性细胞群体，血清浓度和孵育时间可能需要根据特定CPC亚群的特性进行调整。考虑到这一点，该技术也可应用于其他类型的CPCs，为研究CPCs的分化潜能与机制及其在来源于相应疾病模型的CPCs中如何受疾病影响提供了有效方法。 <60%融合度，并在无添加物、低浓度FBS（0.1%）的培养基中培养20–24小时，随后转入内皮细胞分化培养基进行分化。由于CPCs为异质性细胞群体，血清浓度和孵育时间可能需要根据特定CPC亚群的特性进行调整。考虑到这一因素，该技术也可适用于其他类型的CPCs，为研究CPCs的分化潜能与机制及其在来源于相应疾病模型的CPCs中如何受疾病影响提供了有效方法。
引言
近期研究表明，成年哺乳动物心脏中存在常驻的心脏祖细胞（CPCs）1,2,3，且CPCs可能在心脏损伤后细胞治疗中具有应用价值4,5。此外，从患有罕见心肌病的患者或相应疾病模型中分离出的扩增CPCs，可为药物筛选和疾病机制研究提供有效的模型6,7。
从成年心脏中分离出的心脏祖细胞（CPCs）具有干细胞/祖细胞特性1,2,3,8，表现为多能性、克隆形成能力以及自我更新能力。然而，存在多种不同的（亚）群CPCs，其表面标志物谱各不相同，例如c-kit、Sca-1等，或通过不同的分离技术获得（表1）。目前已建立多种培养与分化方案1
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
用于细胞分离的小鼠使用遵循《实验动物护理和使用指南》以及瑞士动物保护法，并已获得瑞士州级主管部门的批准。
注意：从小鼠心脏分离 Sca-1+/CD31- SP-CPC 的方法基本如先前所述34，但有部分修改。所用材料与试剂详见材料表。所有实验中，从小鼠分离的心脏 SP-CPC 均以类似细胞系的方式进行扩增、传代和使用。本研究使用第 7 至 20 代的细胞。
1. 组织制备
注意：所有使用小鼠的实验必须根据相关指南和法规进行。本方案使用四只小鼠。在本方案的以下部分中，直径为100 mm的培养皿记为P100，直径为60 mm的培养皿记为P60。
- 每只小鼠按 200 mg/kg 剂量腹腔注射戊巴比妥钠，通过夹趾反应确认其完全麻醉。
- 用 70% 乙醇擦拭胸部，用剪刀剪开皮肤和胸壁，暴露胸腔。
- 用镊子提起心脏，用剪刀在基部剪下心脏，将心脏放入含 25 mL（P60 为 5 mL）冷磷酸盐缓冲液（PBS）的 P100 培养皿中（每 P100 放 3 至 5 个心脏，每 P60 放 1 至 2 个心脏）。
- 用镊子挤压心脏，将心腔内的血液挤出（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
小鼠 SP-C 阳性肺泡上皮细胞的分离：
本研究中，我们采用了根据侧群（SP）表型分离的小鼠CPCs，而大鼠CPCs的结果则经修改并添加自先前的报告（已获许可）（图8）33。
高密度和低密度细胞在不同血清浓度下的细胞增殖：
我们之前的研究表明，心源性谱系标志物的mRNA表达在培养的最初24小时内即发生变化。已知细胞外基质会影响细胞命运的决定，包括内皮分化35。为了探索促进心脏前体细胞（CPCs）向内皮谱系分化的适宜条件，本研究在6孔板（生长面积：9.6 cm2<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案的优势：
本方案提供了一种CPCs向内皮细胞分化的技术。我们发现，在低血清浓度和低细胞密度条件下，内皮分化效率得以提高，且在此条件下，层粘连蛋白（LN）比纤连蛋白（FN）更适合作为基质。我们使用了两种不同类型的CPCs：大鼠CPCs（以类似细胞系的方式使用）和小鼠SP-CPCs（经分离与扩增获得）。值得注意的是，该方案适用于这两种CPCs。目前的技术已能够使科研人员从基因修饰小鼠、临床前疾病模型以及人体中分离并扩增原代CPCs28,36。将本方案应用于分离获得的CPCs，不仅有助于疾病机制的研究，也有助于探索新的治疗靶点。
心肌前体细胞目前正处于细胞治疗的临床试验阶段4,5，通过从患者体内分离细胞，并在体外处理后回输 体外 扩增。在这方面，本文所述方案有助于在移植前识别出增强此.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Vera Lorenz在实验过程中提供的有益支持，以及巴塞尔大学和巴塞尔大学医院生物医学系（DBM）流式细胞术平台工作人员的帮助。本研究由巴塞尔大学的Stay-on track项目（资助Michika Mochizuki）提供支持。Gabriela M. Kuster获得了瑞士国家科学基金会的资助（资助号310030_156953）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养基 | |||
| Iscove's 改良 Dulbecco's 培养基（IMDM） | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM）/F12营养混合物 | 默克 | #D8437 | |
| 青霉素-链霉素（P/S） | ThermoFisher | #15140122 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | #SH30071 | 3.5%（谱系诱导时为0.1%） |
| L-谷氨酰胺 | ThermoFisher | #25030 | 终浓度 2 mM |
| 谷胱甘肽 | 默克 | #G6013 | |
| 重组人表皮生长因子（EGF） | Peprotech | #AF-100-15 | |
| 重组碱性成纤维细胞生长因子（FGF） | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 补充剂 | ThermoFisher | #17504044 | |
| 心肌营养素1 | Peprotech | #250-25 | |
| 凝血酶 | Diagontech AG，瑞士 | #100-125 | |
| Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % 胰蛋白酶-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 培养瓶 | Sarstedt | #83.3911 | |
| 内皮分化 | |||
| 内皮细胞生长培养基（EGM）-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K（Kaighn's）培养基 | ThermoFisher | #21127 | |
| 层粘连蛋白 | 默克 | #L2020 | |
| 纤连蛋白 | 默克 | #F4759 | 用ddH2O稀释 |
| 6孔板 | Falcon | #353046 | |
| 甲醛溶液 | 默克 | #F1635 | 在 PBS 中稀释 1:10（终浓度为 3.7%） |
| Triton X-100 | 默克 | #93420 | 0.1% 的 ddH2O 溶液 |
| 正常山羊血清（10%） | ThermoFisher | #50062Z | |
| 抗血管性血友病因子抗体 | Abcam | #ab6994 | 1:100，溶于10%山羊血清中 |
| 山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500，溶于10%山羊血清中 |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI） | ThermoFisher | #62247 | 1:500，溶于ddH2O |
| SlowFade 抗荧光淬灭试剂盒 | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 宽场显微镜 | 奥林巴斯 | ||
| 管状结构形成 | |||
| 96孔板 | Falcon | #353072 | |
| 带滤网帽的5 ml圆底管 | Falcon | #352235 | |
| 基质胶生长因子减量 | 康宁 | #354230 | |
| IX50 宽场显微镜 | 奥林巴斯 | ||
| Sca-1+/CD31- 心脏侧群细胞的分离34 | |||
| 试剂 | |||
| 戊巴比妥钠 50 mg/ml 兽用 | 院内医院药房 | #9077862 | 工作溶液：200 mg/kg |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），不含 CaCl₂，不含 MgCl₂ | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), 酚红(-) | ThermoFisher | #14175 | 配制 500 mL HBSS 加 2% FBS 用于淬灭胶原酶B活性 |
| Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），含1 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸 | ThermoFisher | #331885 | 配制 DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES + P/S 用于Hoechst染色 |
| 青霉素-链霉素 (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | 终浓度 25 mM |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC裂解缓冲液（10X） | BioLegend | #420301/100mL | 用ddH₂O稀释至1×，并通过0.2 μm滤膜过滤 µm 滤膜 |
| 胶原酶B | 默克 | #11088807001 | 终浓度为1 mg/mL的HBSS溶液，经0.2 μm滤膜过滤 µm 滤膜 |
| 双苯并咪唑 H33342 三盐酸盐（Hoechst） | 默克 | #B2261 | 用ddH₂O配制1 mg/mL溶液 |
| 盐酸维拉帕米 | 默克 | #V4629 | 终浓度 83.3 µM |
| APC 小鼠抗大鼠 CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µ克/107细胞 |
| FITC 标记大鼠抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µ克/107细胞 |
| 7-氨基放线菌素D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µ克/106细胞 |
| APC 标记的大鼠 IgG2a k 同型对照 | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µ克/107细胞 |
| FITC 标记的大鼠 IgG2a κ 同型对照 | BD 生物科学 | #554688 | 0.6 µ克/107细胞 |
| 材料 | |||
| 27G针头 | Terumo | #NN-2719R | |
| 18G针头 | Terumo | #NN-1838S | |
| 一次性使用无菌1 mL注射器 | CODAN | #62.1640 | |
| 移液管 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| 细胞筛 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| 细胞滤网 100 µm 黄色 | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox 培养皿 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| P100 培养皿 | 康宁 | #353003 | |
| 60 mm 培养皿 | 康宁 | #353004 | |
| 小鼠 | |||
| 行 | 年龄 | 繁殖 | |
| C57BL/6NRj / 雄性 | 12 周 | 自主研发 | |
| 产品名称 | 公司 | 目录编号 | |
| 试剂 | |||
| Iscove's 改良 Dulbecco's 培养基 (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12 Ham营养混合物 | 默克 | #D8437 | |
| 青霉素-链霉素 (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | #SH30071 | |
| L-谷氨酰胺 | ThermoFisher | #25030 | |
| 谷胱甘肽 | 默克 | #G6013 | |
| B27 补充剂 | ThermoFisher | #17504044 | |
| 重组人表皮生长因子（EGF） | Peprotech | #AF-100-15 | |
| 重组碱性成纤维细胞生长因子（FGF） | Peprotech | #AF-100-18B | |
| 心肌营养素1 | Peprotech | #250-25 | |
| 凝血酶 | Diagontech AG，瑞士 | #100-125 | |
| 内皮细胞生长培养基（EGM）-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| 培养基成分概述。部分信息与上述内容相同，但按培养基1-3的成分顺序进行整理。 | |||
| 产品名称 | 培养基18 | 培养基2 | 培养基3 |
| 试剂 | 培养 | 谱系诱导 | 内皮分化 |
| Iscove's 改良 Dulbecco's 培养基 (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12 Ham营养混合物 | 65% | 65% | |
| 青霉素-链霉素 (P/S) | 1% | 1% | |
| 胎牛血清（FBS） | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-谷氨酰胺 | 2 mM | 2 mM | |
| 谷胱甘肽 | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 补充剂 | 1.3% | ||
| 重组人表皮生长因子（EGF） | 6.5 ng/mL | ||
| 重组碱性成纤维细胞生长因子（FGF） | 13 ng/mL | ||
| 心肌营养素1 | 0.65 ng/mL | ||
| 凝血酶 | 0.0005 U/mL | 试剂盒中包含的所有必要组分 | |
| 内皮细胞生长培养基（EGM）-2 BulletKit | 试剂盒中包含所有必需组分 |
参考文献
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
