Inducción de la diferenciación endotelial en las células cardiacas progenitoras en suero bajo condiciones
Summary
Este protocolo describe una técnica de diferenciación endotelial de las células progenitoras cardíacas. Se centra especialmente en cómo la concentración del suero y la densidad de siembra de células afectan el potencial de diferenciación endotelial.
Abstract
Las células progenitoras cardíacas (CPCs) pueden tener potencial terapéutico para la regeneración cardiaca después de la lesión. En el corazón mamífero adultos, CPCs intrínsecos son muy escasos, pero CPCs ampliadas podrían ser útiles para la terapia celular. Un requisito previo para su uso es su capacidad para distinguir de forma controlada en los diferentes linajes cardiacos utilizando protocolos definidos y eficientes. Además, en vitro expansión, CPCs aislaron de pacientes o modelos preclínicos de la enfermedad pueden ofrecer herramientas de investigación fructífero para la investigación de los mecanismos de la enfermedad.
Los estudios actuales utilizan diferentes marcadores para identificar CPCs. Sin embargo, no todos se expresan en los seres humanos, que limita el impacto traslacional de algunos estudios preclínicos. Protocolos de diferenciación que son aplicables independientemente de la expresión de la técnica y el marcador de aislamiento permitirá la expansión estandarizada y cebado de CPCs para propósito de la terapia celular. Aquí describimos que el cebado de CPC bajo condiciones de densidad celular baja y una concentración baja del suero bovino fetal (FBS) facilita la diferenciación endotelial de CPCs. utilizando dos subpoblaciones diferentes de ratón y rata CPCs, demostramos que eso laminin es más sustrato adecuado de fibronectina para este propósito bajo el siguiente protocolo: después de cultivo de 2-3 días en medio incluyendo suplementos que mantienen multipotencia y con 3.5% FBS, CPCs son sembradas en laminina en < 60% confluencia y cultivadas en medio sin suplemento con bajas concentraciones de FBS (0.1%) durante 20-24 horas antes de la diferenciación en medio de la diferenciación endotelial. Porque CPCs son una población heterogénea, las concentraciones séricas y tiempos de incubación deba ajustarse dependiendo de las propiedades de la subpoblación de CPC respectiva. Teniendo en cuenta esto, la técnica puede aplicarse a otros tipos de CPC así y proporciona un método útil para investigar el potencial y los mecanismos de diferenciación y cómo se ven afectados por la enfermedad al utilizar CPCs de modelos de la enfermedad respectiva.
Introduction
Estudios recientes apoyan la existencia de las células progenitoras cardíacas residentes (CPC) en el corazón mamífero adulto1,2,3, y CPC podría ser una fuente útil para la terapia de la célula después de lesión cardíaca4, 5. Además, CPCs ampliados pueden proporcionar un modelo fructuoso para la detección de drogas y la investigación de los mecanismos de la enfermedad cuando están aisladas de pacientes con cardiomiopatías raros, o de enfermedad respectiva modelos6,7.
CPCs aislados del corazón adulto poseen/progenitoras celulares características1,2,3,8 como son multipotentes, clonogenic, y tienen la capacidad de auto renovación. Sin embargo, hay muchas poblaciones diferentes (sub) de CPCs exhibir perfiles de diferentes marcadores de superficie, incluyendo, por ejemplo, c-kit, Sca-1 y otros, u obtenido por técnicas de aislamiento diferentes (tabla 1). Varios protocolos de diferenciación y cultura han sido establecidos1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Estos protocolos varían sobre todo con respecto al factor de crecimiento y contenido de suero, que se ajustan según el propósito del cultivo y que pueden conducir a diferencias en los resultados y los resultados, incluyendo la eficiencia de la diferenciación.
Técnicas de aislamiento basadas en marcadores:
CPC puede ser aislado basado en un marcador de superficie específico expresión1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Estudios previos sugieren que c-kit y Sca-1 son los mejores marcadores para aislar residente CPC1,11,14,19,20. Porque ninguno de estos marcadores es realmente específico para CPC, generalmente se aplican combinaciones de marcadores diferentes. Por ejemplo, mientras que los CPCs expresan bajos niveles de c-kit21, c-kit se expresa también por otros tipos celulares, incluyendo células de mástil22, células endoteliales23y de células progenitoras hematopoyéticas24. Un problema adicional es el hecho de que no todos los marcadores se expresan a través de todas las especies. Este es el caso de Sca-1, que expresa en ratón pero no en humanos25. Por lo tanto, utilizando protocolos que son independientes de los marcadores de aislamiento puede ser ventajoso a la vista de los ensayos clínicos y estudios con muestras humanas.
Técnicas de aislamiento independiente del marcador:
Existen varias técnicas importantes de aislamiento de la CPC, que son sobre todo independientes de la expresión superficial del marcador, pero que se puede refinar la selección consecutivos de subfracciones de marcador positivo específicos según sea necesario (ver también tabla 1). (1) la técnica de la población (SP) de lado originalmente se ha caracterizado en una población primitiva de las células madre hematopoyéticas, basado en la capacidad de emanación el tinte DNA Hoechst 3334226 de ATP-binding cassette (ABC) transportadores27. Células cardíacas de SP han sido aisladas por los distintos grupos y registrados para expresar una variedad de marcadores con algunas diferencias menores entre informes2,8,13,14. (2) células unidad formación de colonias de fibroblastos (CFU-Fs) originalmente se han definido en base a una células mesenquimales estromales (MSC)-como fenotipo. MSCs aislados se cultivan en los platos para inducir la formación de la Colonia. Formadoras de colonias MSC-como CFU-Fs puede ser aislado del corazón adulto y son capaces de diferenciarse en linajes cardíaca15. (3) Cardiosphere-las células derivadas de (enfermedades CDC) son las células derivadas de racimos de células de biopsias de tejido o explantes28,29,30,31. Recientemente fue demostrado que sobre todo la CD105+/CD90 /c-kit– –fracción de la célula exhibe cardiomiogenético y potencial regenerativo32.
Con SP-CPC aislado de ratones, presentamos un protocolo para la inducción eficiente de linaje endotelial basado en un estudio previo en el CPCs de rata y ratón CPCs SP33. El protocolo contiene adaptaciones específicas a la cultura y la técnica de expansión con respecto a la densidad celular, el contenido de suero del medio y el sustrato. Se puede aplicar no sólo a ratón SP-CPC pero distintos tipos de CPC para el propósito de inducir un cambio de destino de una amplificación a un CPC endoteliales comprometido, ya sea ante el trasplante de estas células o su uso para estudios mecanísticos en vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Ventajas de este protocolo:
Este protocolo proporciona una técnica de diferenciación endotelial del CPCs. Hemos encontrado que una concentración baja del suero y densidad celular baja podrían mejorar la eficiencia de diferenciación endotelial, por el que LN demostró para ser un sustrato más adecuado que el FN en estas condiciones. Utilizamos dos tipos distintos de CPC: rata CPCs, que fueron utilizadas en una línea como forma de la célula y el ratón SP-CPC, que fueron aislados y ampliado…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Vera Lorenz por su apoyo a útil durante los experimentos y el personal de la instalación de citometría de flujo del Departamento de Biomedicina (DBM), Universidad y Universidad Hospital de Basilea. Este trabajo fue apoyado por el estancia en pista programa de la Universidad de Basilea (Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster es apoyado por una beca de la Swiss National Science Foundation (grant número 310030_156953).
Materials
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
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