Summary

Phospho-Durchflusszytometrie mit fluoreszierenden Zelle Barcoding für einzelne Zelle Signalisierung Analyse und Entdeckung von Biomarkern

Published: October 04, 2018
doi:

Summary

Hier ist ein Protokoll für Medium-High Throughput Analyse von Protein-Phosphorylierung-Veranstaltungen auf der zellulären Ebene präsentiert. Phospho-Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiger Ansatz charakterisieren Signalisierung Aberrationen, identifizieren und Biomarker zu validieren und Pharmakodynamik zu beurteilen.

Abstract

Aberrante Zelle Signalisierung spielt eine zentrale Rolle bei der Krebsentstehung und Progression. Am meisten neue zielgerichtete Therapien richten sich in der Tat an Proteine und Proteinfunktionen und Zelle Signalisierung Aberrationen können daher als Biomarker an personalisierte Behandlungsmöglichkeiten dienen. Im Gegensatz zu DNA und RNA Analysen können Veränderungen der proteinaktivität die Mechanismen, die Droge Sensibilität und Widerstand effizienter auswerten. Phospho-Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technik, die Protein-Phosphorylierung-Veranstaltungen auf der zellulären Ebene, ein wichtiges Merkmal misst, das diese Methode von anderen Antikörper-basierten Ansätzen unterscheidet. Die Methode ermöglicht simultane Analyse von mehreren Signalproteine. In Kombination mit fluoreszierenden Zelle Barcoding können größere Medium-Hochdurchsatz-Datensätze von standard Cytometer Hardware in kurzer Zeit erworben werden. Phospho-Durchflusszytometrie hat Anwendungen in Studien der grundlegende Biologie und in der klinischen Forschung, einschließlich der Entdeckung von Biomarkern, Analyse und Bewertung der Pharmakodynamik-Signalisierung. Hier wird ein detaillierte experimentelle Protokoll für Phospho-Flow-Analyse der gereinigten peripheren mononukleären Blutzellen, mit chronischer lymphatischer Leukämie-Zellen als Beispiel bereitgestellt.

Introduction

Phospho-Durchflusszytometrie wird verwendet, um Protein-Phosphorylierung-Spiegel bei einzelligen Auflösung zu analysieren. Das übergeordnete Ziel der Methode ist zellulären Signalisierung Muster unter bestimmten Bedingungen zuordnen. Durch die Ausnutzung der multiparameter Kapazität der Durchflusszytometrie, können mehrere Signalwege gleichzeitig in verschiedenen Teilmengen eine heterogene Zellpopulation wie peripheren Blut analysiert werden. Diese Eigenschaften bieten Vorteile gegenüber anderen Antikörper-basierten Technologien wie Immunohistochemistry, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA), Protein Arrays und umgekehrter Phase Protein Arrays (RPPA)1. Phospho-Durchflusszytometrie kombinierbar mit fluoreszierenden Zelle Barcoding (FCB), was bedeutet, dass einzelne Zellproben mit eindeutige Signaturen von Fluoreszenzfarbstoffen gekennzeichnet sind, so dass sie miteinander vermischt, gebeizt und, wie eine einzelne Probe2 analysiert. Dies reduziert den Antikörper erhöht die Robustheit der Daten durch die Kombination von Steuerung und behandelten Proben und erhöht die Geschwindigkeit des Erwerbs. Die Gesamtbevölkerung der FCB kann dann in kleineren Proben unterteilt und befleckt mit bis zu 35 verschiedene Phospho-spezifische Antikörper, abhängig von der Menge des Ausgangsmaterials. Großen Profilerstellung Experimente können dabei mit standard Cytometer Hardware ausgeführt werden. Phospho-Durchflusszytometrie wurde auf Profil Signalwege in Patientenproben aus mehreren hämatologischen Krebserkrankungen einschließlich chronischer lymphatischer Leukämie (CLL)3,4,5, akute myeloische Leukämie (AML) angewendet 6 und non-Hodgkin Lymphome7. Phospho-Durchflusszytometrie ist somit ein leistungsfähiger Ansatz charakterisieren Signalisierung Aberrationen, identifizieren und Biomarker zu validieren und Pharmakodynamik zu beurteilen.

Hierbei ist die optimierte Protokoll für die Analyse von CLL Patientenproben von Phospho-Durchflusszytometrie (Abbildung 1A) vorgesehen. Beispiele für basale Signalisierung Charakterisierung, Anti-IgM/B-Zell-Rezeptor-Stimulation und Droge Störung sind. Eine detaillierte Beschreibung einer FCB-Matrix wird zur Verfügung gestellt. Das Protokoll kann leicht auf andere Zelltypen Fahrwerk angepasst werden.

Protocol

Blutproben gingen nach schriftlicher Einwilligung von allen Spendern. Die Studie wurde vom Regionalkomitee für Medizin und Gesundheit Forschung Ethik des Südost-Norwegen genehmigt und die Forschung auf menschliches Blut erfolgte in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki-8. Hinweis: Schritte 1 bis 3 sollte unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube durchgeführt werden. 1. Isolierung der peripheren monon…

Representative Results

Die wichtigsten Schritte des Phospho Flow Cytometry Protokolls sind in Figur 1Adargestellt. Im dargestellten Beispiel waren die CLL-Zellen mit dem Barcode-Reagenz Pacific Blue bei vier Verdünnungen befleckt. Dreidimensionale Barcoding kann durchgeführt werden, durch die Kombination von drei Barcoding Farbstoffe, wie in Abbildung 1 bdargestellt. Die Einzelproben sind dann deconvoluted durch nachfolgende Anspritzung auf jeden Bar…

Discussion

Phospho-Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technik, Phosphorylierung proteingehalte in einzelnen Zellen zu messen. Da die Methode stützt sich auf die Färbung mit Antikörper, ist Phospho-Durchflusszytometrie durch Antikörper Verfügbarkeit begrenzt. Außerdem, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, alle Antikörper sollten titriert und vor Gebrauch überprüft. Ein detailliertes Protokoll für die Titration von Phospho-spezifische Antikörper wurde an anderer Stelle12beschrieben. W…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde im Labor von Professor Kjetil Taskén durchgeführt und wurde von der norwegischen Krebsgesellschaft und Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen unterstützt. Johannes Landskron und Marianne Enger sind für kritische Lektüre des Manuskripts anerkannt.

Materials

RPMI 1640 GlutaMAX ThermoFisher Scientific 61870-010 Cell culture medium
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10270169 Additive to cell culture medium
Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific 11360-039 Additive to cell culture medium
MEM non-essential amino acids ThermoFisher Scientific 11140-035 Additive to cell culture medium
Lymphoprep Alere Technologies AS 1114547 Density gradient medium
Anti-IgM Southern Biotech 2022-01 For stimulation of the B cell receptor
BD Phosflow Fix Buffer I BD 557870 Fixation buffer
BD Phosflow Perm Buffer III BD 558050 Permeabilization buffer
Alexa Fluor 488 5-TFP ThermoFisher Scientific A30005 Barcoding reagent
Pacific Blue Succinimidyl Ester ThermoFisher Scientific P10163 Barcoding reagent
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt ThermoFisher Scientific P30253 Barcoding reagent
Compensation beads Defined by user Correct species reactivity
Falcon tubes Defined by user
Eppendorf tubes Defined by user
96 well V-bottom plates Defined by user Compatible with the flow cytometer
Centrifuges Defined by user For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates
Water bath Defined by user Temperature regulated
Flow cytometer Defined by user With High Throughput Sampler (HTS)
Name Company Catalog Number Comments
Antigen
AKT (pS473) Cell Signaling Technologies 4075 Clone: D9E
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Rb (pS807/pS811) Beckton Dickinson Pharmingen 558590 Clone: J112-906
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S6-Ribos. Prot. (pS235/236) Cell Signaling Technologies 4851 Clone: D57.2.2E
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SAPK/JNK (pT183/Y185) Cell Signaling Technologies 9257 Clone: G9
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SLP76 (pY128) Beckton Dickinson Pharmingen 558438 Clone: J141-668.36.58 
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STAT6 (pY641) Beckton Dickinson Pharmingen 612601 Clone: 18/P-Stat6
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SYK (pY525/Y526) Cell Signaling Technologies 12081 Clone: C87C1
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ZAP70/SYK (pY319/Y352) Beckton Dickinson Pharmingen 557817 Clone: 17A/P-ZAP70
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Cite This Article
Skånland, S. S. Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery. J. Vis. Exp. (140), e58386, doi:10.3791/58386 (2018).

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