単一細胞解析、バイオ マーカー探索をシグナル蛍光セル バーコードとリン フローサイトメトリー
Summary
ここでは、細胞レベルでのタンパク質のリン酸化イベントの媒体-高スループット分析のためのプロトコルが表示されます。リン フローサイトメトリーは、シグナル伝達異常を特徴付ける、識別およびバイオ マーカーの検証し、薬効学を評価する強力なアプローチです。
Abstract
異常な細胞シグナル伝達は、癌の発生と進展に中心的な役割を果たしています。最も新しい目標とされた療法は確かにタンパク質とタンパク質機能に向け、細胞シグナル伝達異常したがって個別の治療オプションを示すバイオ マーカーとして役立つかもしれない。DNA および RNA の解析ではなくタンパク質活性の変化はより効率的に薬剤感受性および抵抗性のメカニズムを評価できます。リン フローサイトメトリーは、細胞レベル、他の抗体に基づくアプローチからこのメソッドを区別する重要な特徴でタンパク質リン酸化イベントを測定する強力な手法です。メソッドは、複数のシグナル伝達タンパク質の同時解析できます。蛍光セル バーコードと組み合わせると、短い時間で標準の cytometer ハードウェアによって大きな – ハイスループット データ セットを取得できます。リン フローサイトメトリーは、基礎生物学の研究と臨床研究、信号解析、バイオ マーカーの探索と薬理学の評価などの両方のアプリケーションを持ってください。ここでは、例として慢性リンパ性白血病細胞を用いて精製した末梢血単核細胞のリン流れ解析のため詳細な実験的プロトコルが提供されます。
Introduction
リン フローサイトメトリーを使用して、単一セルの解像度でタンパク質リン酸化レベルを分析します。メソッドの全体的な目標は、指定された条件の下で携帯電話の信号パターンをマップすることです。フローサイトメトリーの多項目の能力を悪用し, 末梢血など異種細胞集団のさまざまなサブセットでいくつかのシグナル伝達経路を同時に分析できます。これらの特徴は、免疫組織化学、酵素免疫測定法 (ELISA)、蛋白質のアレイ、逆相蛋白質配列 (セルシグナル)1など他の抗体に基づく技術上の利点を提供しています。リン フローサイトメトリーの併用蛍光セル バーコード (FCB) を混ぜ合わせた、ステンド グラスおよび単一のサンプル2として分析できるように、個々 のセルのサンプルが蛍光染料の独特な特徴と分類されることを意味することができます。これは抗体の使用量を削減、コントロールと扱われたサンプルの組み合わせによるデータ保全性を向上、習得のスピードを向上します。合計 FCB 人口の小さいサンプルに分割および開始材料の量に応じて、最大 35 の異なるリン酸化型特異抗体で染色できます。大型プロファイル実験は、標準の cytometer ハードウェアで、それにより実行できます。リン フローサイトメトリーは、慢性リンパ性白血病 (CLL)3,4、5、急性骨髄性白血病 (AML) を含むいくつかの血液がんの患者サンプルのシグナルのプロファイルに適用されています。6非ホジキン リンパ腫7。リン フローサイトメトリー、シグナル伝達異常を特徴付ける、識別およびバイオ マーカーの検証し、薬効学を評価する強力なアプローチです。
ここでは、CLL 患者サンプル リン フローサイトメトリーによる解析のための最適化されたプロトコルは、(図 1 a) を提供しています。基底の信号特性評価、抗 IgM/B 細胞受容体刺激薬摂動の例のとおりです。FCB マトリックスの詳細な説明が提供されます。プロトコルは他の懸濁液の細胞型に適応できます。
Protocol
血液サンプルは、すべてのドナーから次の書面によるインフォームド コンセントを受信しました。研究は、医療と健康研究倫理の南東ノルウェーの地域委員会によって承認された、人間の血液の研究はヘルシンキ宣言8に従って行われました。 注:手順 1-3 は、ティッシュ文化フードの無菌条件下で行わなければなりません。 <p class="jove_ti…
Representative Results
図 1 aにリン流れの cytometry のプロトコルの主な手順を示します。提示の例では、CLL 細胞は 4 希釈でパシフィック ・ ブルー バーコード化試薬で染色しました。三次元バーコードは、図 1 bに示すように 3 つのバーコードの染料を組み合わせることで実行できます。個々 のサンプルは、各バーコード試薬対SSC A (<strong c…
Discussion
リン フローサイトメトリーは、単一細胞におけるタンパク質リン酸化レベルを測定する強力な手法です。メソッドは、抗体で染色に依存しているので、リン フローサイトメトリーは抗体の可用性によって制限されます。さらに、信頼性の高い結果を得るために全ての抗体滴定、使用する前に検証します。リン酸化型特異抗体の滴定のための詳しいプロトコルがされている12…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事は教授 Kjetil Taskén のラボで実施された、ノルウェーのがん社会と Stiftelsen クリスチャン ゲルハルト ・ Jebsen によって支持されました。原稿の批判的読解のヨハネス ・ Landskron とマリアンヌ Enger を認めた
Materials
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
| MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
| Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
| Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
| Falcon tubes | Defined by user | ||
| Eppendorf tubes | Defined by user | ||
| 96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
| Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
| Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
| Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| NF-κB p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
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Cite This Article
Skånland, S. S. Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery. J. Vis. Exp. (140), e58386, doi:10.3791/58386 (2018).