यहां, सेलुलर स्तर पर प्रोटीन फास्फारिलीकरण घटनाओं के माध्यम से उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । Phospho प्रवाह cytometry संकेतन विचलन की विशेषता के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है, पहचानने और पुष्टि करने के लिए, और pharmacodynamics का आकलन करें ।
ंयायपालिका सेल संकेतन कैंसर के विकास और प्रगति में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है । अधिकांश उपंयास लक्षित चिकित्सा वास्तव में प्रोटीन और प्रोटीन कार्यों पर निर्देशित कर रहे हैं, और सेल संकेतन विचलन इसलिए के रूप में काम कर सकते है के लिए व्यक्तिगत उपचार के विकल्प संकेत मिलता है । डीएनए और आरएनए विश्लेषण करने के लिए विरोध के रूप में, प्रोटीन गतिविधि में परिवर्तन और अधिक कुशलता से दवा संवेदनशीलता और प्रतिरोध अंतर्निहित तंत्र का मूल्यांकन कर सकते हैं । Phospho प्रवाह cytometry एक शक्तिशाली तकनीक है कि सेलुलर स्तर पर प्रोटीन फास्फारिलीकरण घटनाओं उपाय है, एक महत्वपूर्ण विशेषता है कि अंय एंटीबॉडी-आधारित दृष्टिकोण से इस पद्धति को अलग । विधि एकाधिक संकेतन प्रोटीन के एक साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । फ्लोरोसेंट कोशिका barcoding के साथ संयोजन में, बड़े मध्यम से उच्च प्रवाह डेटा-सेट कम समय में मानक cytometer हार्डवेयर द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । Phospho फ्लो cytometry बुनियादी जीव विज्ञान के अध्ययन में और नैदानिक अनुसंधान में, सिग्नलिंग विश्लेषण सहित, pharmacodynamics की खोज और मूल्यांकन के लिए आवेदन किया है । यहां, एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल शुद्ध परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं के phospho प्रवाह विश्लेषण के लिए प्रदान की जाती है, एक उदाहरण के रूप में पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं का उपयोग कर ।
Phospho फ्लो cytometry एकल सेल संकल्प में प्रोटीन फास्फारिलीकरण के स्तर का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है । विधि का समग्र लक्ष्य निर्दिष्ट शर्तों के तहत सेलुलर संकेतन पैटर्न नक्शा है । प्रवाह cytometry की multiparameter क्षमता का दोहन करके, कई संकेतन रास्ते ऐसे परिधीय रक्त के रूप में एक विषम कोशिका आबादी के विभिन्न सबसेट में एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है. इन चारित्रिक अंय एंटीबॉडी पर लाभ की पेशकश आधारित प्रौद्योगिकियों जैसे immunohistochemistry, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा), प्रोटीन सरणी, और रिवर्स चरण प्रोटीन सरणी (RPPA)1। Phospho प्रवाह cytometry फ्लोरोसेंट कोशिका barcoding (FCB), जिसका अर्थ है कि व्यक्तिगत सेल नमूने फ्लोरोसेंट रंजक के अद्वितीय हस्ताक्षर के साथ लेबल कर रहे है ताकि वे एक साथ मिलाया जा सकता है, दाग और एक एकल नमूना2के रूप में विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है । यह एंटीबॉडी खपत को कम कर देता है, नियंत्रण और इलाज के नमूनों के संयोजन के माध्यम से डेटा मजबूती बढ़ाता है, और अधिग्रहण की गति को बढ़ाता है । संयुक्त FCB आबादी तो छोटे नमूनों में विभाजित किया जा सकता है और अप करने के लिए ३५ अलग phospho-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग, शुरू सामग्री की मात्रा पर निर्भर करता है । बड़ी रूपरेखा प्रयोगों, जिससे, मानक cytometer हार्डवेयर के साथ चलाया जा सकता है । Phospho प्रवाह cytometry क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL)3,4,5, गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) सहित कई रक्त कैंसर से रोगी के नमूनों में प्रोफ़ाइल संकेत मार्ग के लिए लागू किया गया है 6 और गैर Hodgkin लिंफोमा7। Phospho प्रवाह cytometry इस प्रकार एक शक्तिशाली दृष्टिकोण को संकेतन विचलन की विशेषता है, की पहचान और पुष्टि के लिए मार्क्स, और pharmacodynamics का आकलन करें ।
यहां, phospho फ्लो cytometry द्वारा CLL रोगी नमूनों के विश्लेषण के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान की गई है (आंकड़ा 1a) । बेसल संकेतन लक्षण वर्णन, विरोधी आईजीएम/बी सेल रिसेप्टर उत्तेजना और दवा गड़बड़ी के उदाहरण दिखाए गए हैं । एक FCB मैट्रिक्स का एक विस्तृत विवरण प्रदान की जाती है । प्रोटोकॉल आसानी से अंय निलंबन सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Phospho फ्लो cytometry एकल कोशिकाओं में प्रोटीन फास्फारिलीकरण के स्तर को मापने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है । के बाद से विधि एंटीबॉडी के साथ धुंधला पर निर्भर करता है, phospho प्रवाह cytometry एंटीबॉडी उपलब्धता द्वारा सीमित…
The authors have nothing to disclose.
यह काम प्रोफेसर Kjetil Taskén की लैब में आयोजित किया गया था, और नार्वे कैंसर सोसायटी और Stiftelsen Kristian गेरहार्ड Jebsen द्वारा समर्थित किया गया था । जोहांस Landskron और Marianne एंगर पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए स्वीकार कर रहे हैं ।
RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
Falcon tubes | Defined by user | ||
Eppendorf tubes | Defined by user | ||
96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antigen | |||
AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
NF-κB p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |