Summary
여기 선물이 있는 어떤 단백질 수 수 조건부로 비활성화 역 그것의 지배적인 부정적인 돌연변이 버전 overexpressing에 의해 지배 부정적인 유도할 수 있는 시스템을 개발 하는 프로토콜.
Abstract
지배적인 네거티브 (DN) 단백질 억제 단백질 기능을 조작 하는 강력한 방법 이며, 다른 게놈 기반 접근을 통해 여러 가지 이점을 제공 합니다. 예를 들어 비록 공상 Cre LoxP 타겟팅 전략을 널리 사용 되어 왔습니다, (즉, 새 발기인 활동, 모자이크 Cre 식, 등) 이러한 전략의 본질적인 한계 크게 제한 하 고 그들의 응용 프로그램입니다. 또한, 많은 내 생 유전자의 완전 한 삭제는 embryonically, 출생 후 생활에 유전자 기능을 연구 하는 게 불가능 한 만드는 치명적인입니다. 이러한 과제를 해결 하기 위해 우리는 초기 유전 공학 프로토콜 중요 한 변경 있고 Rb1 유전자의 짧은 (유전자 변형) 버전 lysosomal 효소와 결합 하 여 procathepsin B (CB), Rb1의 DN 마우스 모델 생성 (CBRb). Lysosomal 효소의 존재로 인해 전체 CB RB1 융합 단백질 및 그 상호 작용 복잡 한 프로테아좀 중재 저하에 라우팅됩니다. 또한, 유전자 변형 구문에서 항생물질 유도 (rtTA) 요소 있으면 RB1 단백질의 유도할 수 있는 고 가역 규칙을 수 있습니다. CBRb 마우스 모델에서 유비 쿼터 스로 사 CAG 발기인의 존재 하기가 일시적이 고 가역 Rb1 유전자 제거 수행 하 고 거의 모든 세포 유형에 있는 그것의 활동을 이해 하기 위한 연구는 리소스를 제공 하는 유용한 도구 RB1 표현 된다.
Introduction
일반적으로 완전 한 제거 또는 유전자, RNA 시퀀스, 또는 관심사 (POI)의 단백질의 자르기 이어질 영구 프로세스에 의존 하는 유전자 및 단백질 제거를 목표로 대부분 접근. 이 방법의 전반적인 목표는 내 생, 야생-타입 단백질의 기능을 폐지 하 고 재조합 단백질 하입니다. 우리가 재검토 하 고 개편 한 대체 전략1,2, DN 억제를 통해 POI의 임시 제거를 허용. 이 방법은 multimeric와 단위체 펩 티 드에 대 한 작동 하지만 단백질 multimeric 어셈블리에 기능을 위해 가장 적합 한.
메서드를 융합 하는 lysosomal 효소 CB multimeric POI (CB 퓨전 복잡 한)의 소 단위를 이루어져 있다. 복잡 한 결과 CB 퓨전 수 상호 작용 및 proteolytically 생 단백질 소화 또는 전체 CB POI 복잡 한 수 저하3리소좀을 전환. 또한, 유도할 수 있는 자연 항생물질 제어 transcriptional 활성화 (TetO) 시스템의 복잡 한 CB 융해의 함께 가역 패션2transgene의 제어 하 고 유도할 수 있는 표현에 대 한 수 있습니다. 많은 경우에 유용 하지만 치4,,56유전자 또는 vivo에서 단백질의 완전 한 삭제 될 수 있습니다. 궁극적으로, 중요 한 게놈 요소7의 영구 손실 이어질 것입니다, 마찬가지로, 일부 유전자 또는 단백질 Cre/Lox 체계를 사용 하 여 조직 관련, 조건부 삭제 간단 되지 않을 수 있습니다. 따라서, 유전자 또는 POI에 따라 이러한 접근의 후속 연구에 대 한 유용한 모델을 제공 효과가 있을 것입니다 특히 유전자 또는 단백질의 기능 연구 늦은 출생 후와 성인 쥐에.
이러한 접근법과 관련 된 문제를 회피 하 고 제공 증거의 원칙에 제안된 된 방법의 효과 선택 했습니다 Retinoblastoma 1 (RB1) 단백질의 조건부 DN 버전을 생성 하 여 여기에 제시 된 메서드를 테스트 하려면. 몇 가지 옵션이 제안된8,,910 생 RB1;의 기능을 폐지 하 고 있다 그러나, 그들의 모두 위에서 설명한 동일한 제한 사항 중 일부에 직면: RB1의 영구적인 생식 삭제 embryonically 치명적인 이며, 종양11의 다양 한 종양 억제기 역할, 영구 RB1 조건부 삭제 리드. RB1의 DN 버전 자연스럽 게 발생 하지 않는, 비록 현재 사용할 수 있는 전략에 대 한 더 나은 대안 생 RB1의 일시적으로 제어 비활성화에 대 한 허용 해야 하 고 결국 복원 하는 대체 메커니즘을 제공의 기능입니다. 이러한 구문으로 2 년간 전 설명 했다1. 그러나, 기술적 제한으로 인해 그것은 메커니즘 제어 transgene 활성화, 응답, 및 조직 특이성을 부족. 이 연구는 먼저 doxycycline (Dox)의 우아함과 결합-lysosomal 효소 CB 및 Rb1 단백질의 조작된 유전자 변형 구문으로 종속 transcriptional 시스템. 결과 CBRb 마우스 모델 일시적으로 규제 Dox 중재 RB1 허용 규정2. 이러한 프로테옴 기반 접근을 사용 하 여 유전자 기능을 연구 하의 장점은 어떤 유전자의, 그것의 활동에 대 한 최소한의 정보에 대 한 채택 될 수 있다.
제안 된 DN transgene 전략 전통적인 접근에 많은 이점이 있습니다. 첫째, DN 단백질 억제 단백질 활동, 따라서 잔여 생 식 보존에 부분 절제를 리드. 이러한 결과 단백질 활동의 완전 한 제거 라이브 마우스에서 유전자 기능 연구에 어떤 조사를 크게 제한 하는 배아 치 사 율을 리드 하는 상황에서 매우 바람직합니다. 둘째, TetO 시스템의 존재는 transgene 활동의 효율적이 고 가역 제어할 수 있는 항생제, 존재만 transgene 활성화를 수 있습니다. 따라서, 항생제 관리를 중단 하 여 유전자 변형 시스템을 비활성화할 수 있습니다, 하 고는 정상적인 RB1 식이 다시 자리에에서 키를 누릅니다. 셋째, transgene 식의 특이성의 선택의 발기인에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 증거의 원칙에 대 한 유비 쿼터 스로 사 CAG 발기인 선택, 조직 관련 발기인 아래 transgene 삽입 가능성이 높습니다 원치 않는 transgene 식 제한이 transgene의 치료 응용 프로그램에 대 한 연구를 촉진 하 입니다.
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Protocol
유전자 변형 CBRb 마우스와 모든 동물 보호 및 연구와 관련 된 실험의 세대 Creighton 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었고 그들의 지침에 의해 수행.
1. 유전자 변형 CB-Myc6-Rb1 구문
참고: CBRb의 pTet_Splice 벡터에 클로닝 다단계 과정 (그림 1A 및 1B)에서 이루어졌다.
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PCS2 + CB Myc6 벡터에 첫 번째 단계 복제를 수행 합니다.
- CBRb transgene 구문 생성, 1583-혈압-긴 Rb1 cDNA 조각 (528 아미노산 아미노산 지역 369-896에 해당) 다음 뇌관을 사용 하 여 RB1 단백질의 증폭을 설정: EcoRI +RB 1243F, 사용 GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, 및 XbaI + EcoRV +RB 2826R, CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC를 사용 하 여.
- 복제는 pCS2 + 앞에서 설명한1,12CB Myc6 벡터의 EcoR1 및 XbaI 제한 사이트 사이 (1546 bp) 생성.
참고: 1012-혈압-긴 CB Myc6 구문 (337 아미노산) Rb1 조각에 융합 결과 생 RB1 단백질 (~ 110 kDa) 보다 약간 작은 약 865 아미노산 (약 108 kDa), 단백질 (그림 1 ), N-말단과 C-말단에서 Rb1 에서 CB Myc6 태그.
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두 번째 단계 subcloning pTet 스플라이스 벡터에 수행 합니다.
- CB-RB-Myc6 퓨전 단편을 증폭 하 고 Tet 발기인을 얻기 위해 증폭 CB-myc6-Rb1 EcoRV (XbaI + EcoRV + 2826R RB)와 사리 사이트를 포함 하는 뇌관을 사용 하 여 구성 된 카세트: 사리 +CBf, CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC를 사용 합니다.
- PTet 스플라이스 벡터 사리 및 EcoRV 금지 사이트 같은 사이 생성 된 조각 (2567 bp) subclone 전체 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene, SV40 intron 등은 PolyA 신호 하는 방법 노트 (그림 1B)와 단일 소화를 통해 격리 될 수 있습니다.
참고: 노트 조각 생성 유전자 변형 funders 하 사용 되었다.
2. 체 외 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 Transgene의 테스트에서
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Dox 레 귤 레이 션: NIH3T3 세포 선
참고: 달리 명시 하지 않는 한 모든 볼륨 6 잘 플레이트에 대 한 조정 되었습니다.- 10% CO2와 37 ° C에서 10% 태아 둔감 한 혈 청을 포함 하는 권장된 셀 문화 미디어를 사용 하 여 공급 업체의 사양에 따라 NIH3T3 세포 성장.
- PTet 스플라이스 셀 cotransfect 및 pCMV Tet3G 벡터 (1 단계)에서 24 h. cotransfection에 대 한 아래에 언급 된 단계를 따르십시오.
- 2-4 µ L의 지질에 기초를 둔 transfection 시 약/잘 믹스 1 mL의 (혈 청) 없이 불완전 한 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 실 온에서 5 분. 12 또는 24 잘 플레이트에 대 한 문화 미디어의 250 또는 500 µ L를 각각 사용 하 고 transfection 시 볼륨을 조절 합니다.
- Transfection 시 약-DMEM에 플라스 미드 DNA/잘의 2-3 µ g을 추가 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어.
- DNA와 DMEM transfection 시 약 각 잘을 포함 하는 믹스를 추가 합니다. 외피의 3-4 h, 후 (되도록 마지막 볼륨 2 mL/음) 완전 한 미디어의 1 mL를 추가 합니다. Dox 주식 (1 mg/mL)의 aliquots를 유지 하 고 웰 스 (+ Dox)의 각각에서 2 µ L를 추가. 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.
참고: 컨트롤 샘플 Dox 치료 하지 않을 cotransfected 세포를 이루어져 있어야 한다 (-Dox), 뿐만 아니라 NIH3T3 세포 transactivator pCMV-Tet3G 벡터 만으로 페 고 Dox 24 시간 기간에 대 한 치료. PCMV-Tet3G, 농도 대 한 0.1-1 µ g/mL Dox transgene 표현을 유도 충분 해야 한다.
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HEK293 세포 선을 사용 하 여 구성의 반전 기능을 테스트 합니다.
- TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene의 가역, 문화 HEK293 세포에서이 글의 최소 필수 매체 (EMEM) 공급 업체의 사양에 따라 테스트 및 설명 하는 대로 24 h pTet 스플라이스 및 pCMV Tet3G 벡터와 cotransfect (2.1.2 단계) 위의.
- Transgene 비활성화에 대 한 24 시간 후 Dox 포함 된 미디어를 제거 하 고 씻어 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 셀 2 x-3 x Dox 무료 미디어 추가 24 h에 대 한 그들을 품 어.
참고: Dox 제거 시 transgene 비활성화 및 일반 단백질 표정 그 24 시간 기간 내에 재개 한다.
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예약 되지 않은 세포 증식 촉진 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 구조물의 기능을 평가 하기 위해 아래 설명 된 대로 헤이 OC1 셀 라인을 사용 하 여 기능 분석을 수행 합니다.
- 문화 헤이 OC1 셀 10% 허용 아래 DMEM 조건 (10% CO233 ° C). 세포 증식 연구, 96 잘 접시 200 µ L 볼륨에서에 셀 카운터 및 접시 10000 헤이 OC1 셀을 사용 하 여 셀을 계산. 셀을 밤새 품 어.
- 다음 날에 수행 pTet 스플라이스 및 pCMV Tet3G 벡터 지질에 기초를 둔 transfection 시 약의 과도 cotransfection (단계 2.1.2 참조). 에 별도 잘 pmR ZsGreen1 transfection at2-µ g을 transfection 계산 지질에 기초를 둔 transfection 시 약 (2.1.2 단계)을 사용 하 여 수행 합니다. 비 페 세포를 사용 하 여 컨트롤.
- 형광 현미경에서 녹색 형광의 존재를 감지 (여기 = 485 nm, 방출 = 530 nm) transfection 후 24 h 대는 transfected 세포. 녹색 형광의 유무를 기록 하 고 계산 transfection GFP-긍정적인 세포 (transfected 세포)의 총 수로 DAPI (전체 세포)으로 표시 하는 셀에.
참고: 우리 ~ 70%의 transfection 속도 추정. - Transgene 식 유도, 추가 1 µ g/mL Dox transfected 세포의 부분 집합에 다른 하위 집합을 사용 하 여 제어 하는 동안 (-Dox). 치료 헤이 OC1 세포를 사용 하 여 추가 컨트롤.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 셀 확산 키트를 사용 하 여 세포 증식을 평가.
- 간단히, transfection, 후 48 h 세포 배양 매체를 제거 하 고는 미 판의 각 음에 염료 바인딩 솔루션 x 1의 100 µ L를 추가 합니다. 1 h 37 ° c.에 품 어
- 그 후, 형광 microplate 리더를 사용 하 여 각 샘플의 형광 강도 측정 (여기 = 485 nm, 방출 = 530 nm).
- 추가 평가 하 immunocytochemistry를 사용 하 여 세포 증식, 접시는 12-잘 접시 커버 유리에 헤이 OC1 셀 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 다음 날, pTet 스플라이스와 pCMV-Tet3G cotransfect 하 고 Dox 처리 (+ Dox)을 수행 합니다. Untransfected 세포를 사용 하 여 컨트롤. 기-67 라벨에 대 한 프로세스 헤이 OC1 셀.
- PBS, pH 7.4, 실 온에서 10 분에에서 4 %paraformaldehyde (PFA)와 셀을 수정 합니다. 3 세포를 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 x 10 분에 대 한 PBS에 0.25% 비 이온 세제에 셀을 품 어 고.
- 세포를 씻어 다시, 3 x 5 분, 그리고 실 온에서 1 h 습도 챔버에 10% 혈 청을 사용 하 여 블록에 대 한 PBS에.
- 실 온에서 3 시간 기-67 1 차 항 체 (1: 200 희석)의 500 µ L에서 세포를 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤
- 3 세포를 씻어 PBS 가진 5 분 x. 그 후, 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 이차 항 체와 세포를 품 어.
- 이차 항 체 솔루션을 제거 하 고 세척 셀 3 어둠 속에서 각 5 분 PBS와 x.
- Phalloidin 라벨에 대 한 헤이 OC1 셀 30 분 1: 200 phalloidin에 품 어. 세포의 핵을, 실 온에서 10 분 동안 5 µ g/mL DAPI 셀을 품 어.
참고: Phalloidin 염료 공액 다른 이차 항 체 공액 인지 확인 합니다.
3. CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb)의 세대 유전자 변형 마우스 Vivo DN-CBRb 접근의 테스트에서
- TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene의 효과적인 Dox 규제의 확인, 노트 조각 정화 하 고 마우스 zygotes, 의사 임신 여성으로 전송 나중에 그들을 microinject.
참고: 이 절차는 네브라스카 대학 의료 센터 (UNMC) 마우스 게놈 엔지니어링 핵심 시설에서 실행 되었다. - 배달, 유전자 형 새끼는 뇌관을 사용 하 여 설정 CB Rb1 퓨전 지역 후: CBRb F 5' 3 ' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG, 사용 하 고 CBRB R 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3 사용.
참고: 관찰 하는 agarose 젤에 PCR 제품 크기는 401 혈압 (60-bp CB 지역 + 341-bp Rb1 지역 (표 1). 10 개의 독립 설립자 라인 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene의 존재에 따라, 확인 되었다. 이 라인의 5, 자손은 transgene의 생식 전송 확인 transgene 상속. 유전자 변형 라인 중 하나는 궁극적으로 설정 하 고 라인을 유지 하 고 추가 연구에 대 한 실험 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 동물을 생성 하 사용 되었다. - 실험 DN-CBRb 쥐 생성 하 로 사-CAG-rtTA 항생물질 유도 선 (사진 #006965) (또는, 온 유도 선 품종)에 성인 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 생쥐를 사육 한다. 유전자 교차 하는 다음 뇌관 세트를 사용 하 여이의 자손: rtTA WT R 사용 GGAGCGGGAGAAATGGATATG; rtTA 돌연변이 연구, 사용 GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; 그리고 일반적인 rtTA, AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT를 사용. PCR 제품의 크기는 340 bp (돌연변이), 340 혈압과 650 혈압 (heterozygote), 그리고 650 bp (야생-타입).
- RB1 단백질 Dox 처리 시간과 Dox 처리 transgene 식을 유도 하는 데 필요한의 길이 확인 하려면 다음의 복용량 응답 곡선을 생성 합니다.
참고: 이 실험에서 서쪽 오 점와 qRT-PCR 조직 관련 transgene 활성화 및 RB1 식을 평가 하기 위해 사용 되었다. - 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)는 transgene의 게놈 삽입 확인을 수행 합니다.
참고: 이 실행 되었다 센터에서 병원의 적용 유전체학에 대 한 아픈 어린이 (토론토, 캐나다). ELISA 또는 서 부 럽 (단백질 특정 항 체를 사용 하 여) transgene 활성화, 조직 특이성, 그리고 생 POI의 수준에서 변화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. DN-c B-myc6-Rb1 구문 안티 RB1 항 체를 사용 했습니다.
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Representative Results
일반적으로, 상당한 양의 구조에 대 한 정보 및 POI의 기능 필요 DN 돌연변이 설계 합니다. 반면, 여기에 제시 된 DN 전략은 POI에 대 한 구조 및 기능 정보는 제한 하는 경우 특히 유용 합니다. 조립된 multimer 및, 잠재적으로, 생 subunits의 베이스와의 subcellular 전환의 조합을 통해 다른 ligands lysosomal 효소를 한 소 단위의 융합 POI multimeric 단백질 인 경우에, 억제 지배적 수는 multimer는 리소좀에. 성공적인 복제 확인 Dox 규제 transgene 활성화, 순화 pTet 스플라이스 플라스 미드 포함 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 의 효과 테스트 하 구조는 rtTA를 표현 안정적으로 마우스 NIH3T3 세포로 페는 단백질, 하지만 하지 Rb113. Dox의 부재, 셀 rtTA 표현 표시 RB1 식이 없는 반면에 Dox (그림 2A)의 존재는 강력한 RB1 식 관찰 되었다. 다음, 시스템의 반전 기능을 테스트 하려면 우리 cotransfected HEK293 세포 (endogenously Rb114익스프레스)를 순화 pTet 스플라이스와 /TetO-DN-c B-myc6-Rb1 및 pCMV Tet3G 벡터. 예상 했던 대로, 생 RB1 단백질의 표정은 크게 세포 배양 (그림 2B)에 Dox의 추가 의해 transgene 활성화에 저해. 테스트 시스템의 가역 HEK293 세포의 부분 집합에 24 시간 기간 뒤에 우리는 신선한 Dox 무료 미디어와 Dox 포함 된 셀 문화 미디어를 교체 하 고 incubated 추가 24 h. Dox 규제 가역, RB1 지원에 대 한 셀 식 (그림 2B) 문화 미디어에서 Dox 제거 시 복원 되었습니다. 페 하지 Dox로 치료 했다 HEK293 세포 또는 Dox 처리 HEK293 세포 페는 pCMV-Tet3G 벡터와만 (그림 2B) 생 RB1 표현의 기초 수준을 보여주었다. NIH3T3 세포 RB1 단백질을 자연스럽 게 표현 하지 않습니다, 때문에 긍정적인 RB1 반응성 유전자 변형 RB1 단백질의 축적 예정 이다. 청각 시스템에서 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 구성의 잠재적인 증식 효과에 우리의 관심을 감안할 때, 우리 pTet 스플라이스 총 DNA 콘텐츠 측정 /TetO-DN-c B-myc6-Rb1-및 pCMV Tet3G 페 헤이 OC1 셀 ( Corti 파생 셀 라인의 내가 기관)는 존재와 Dox의 부재에. 여기에 제시 된 작업 가설과 일치, DNA 콘텐츠 (해당 휴대폰 번호의 증가)에 크게 증가 관찰 되었다 Dox 처리만 하지 치료 (제어) 페 헤이 OC1 셀 (그림 3A - 3 C ).
Transgene 활동 및 기능의 생체 외에서 확인, 다음 유전자 변형 마우스 모델 생성 되었습니다. TetO-DN-c B-myc6-Rb1 digoxigenin (파)를 사용 하 여 물고기-말 무 과산화 효소 (HRP) / tyramine biotin/avidin-Cy5-표시 된 프로브 및 G 밴딩 남성 쥐 splenocytes와 귀 섬유 아 세포의 transgene 삽입에서 확인을 수행 했다는 유전자 변형 쥐의 게놈 5 생식 전송 설립자 중 내 줄 14 보여준 일관성 있는 transgene 삽입 세그먼트 10 C 3 ~ d 2 (그림 4A - 4 C). 이 줄에서 마우스 설정 하 breeding 식민지 고 추가 연구에 대 한 실험 동물을 생성 사용 되었다. Dox 유도 및 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene 활성화에 대 한 최적의 시간을 확인 하려면 우리가 나누어 유전자 변형 쥐 점에서 Dox 가변 길이의 시간에 대 한 식 수에 관리 했다 세 가지 그룹: 그룹 1 치료의 (3 일), 그룹 2 의 치료 (7 일), 그리고 그룹 3 (치료 10 일). 완료 되 면 치료, RB1 단백질 표정에 변화는 서쪽 더 럽 히 (그림 5A -5)에 의해 평가 됐다. 때문에 DN 및 네이티브 RB1 단백질 유사한 분자 무게, 그들은 서쪽 오 점에 서로 확인할 수 없습니다. 그러나, 초기 증가와 일치 RB1 단백질 (DN RB1 및 생 단백질의 축적) 때문에, 제어 그룹 (그림 5 에 비해 유전자 변형 마우스 cochleae에 총 RB1 단백질 표정에서 초기 증가 했다 A). 또한, TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene 제품의 활동을 억제 하 고 분해와 일치, RB1 식에서 정량 감소에서에서 관찰 되었다 그룹 2와 3 그룹 1 및 제어 그룹 ( 에 비해 그림 5A - 5). 치료 10 일 이상 주의 RB1 단백질 표정에 더 변화를 발생 하지 않았다. 따라서, Dox 처리의 10 일 최적의 고 추가 연구에 대 한 사용 고려 되었다.
RB1 어떤 조직 또는 셀 RB1is endogenously 표현 어디에 잠재적으로 저해 될 수는 rtTA 및, 따라서, TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene 활성화는 유비 쿼터 스 로 사 CAG 발기인, 때문에 (예를 들어, 폐, 심장, 망막)입니다. 이 전제를 테스트 하 고 평가 transgene의 조직 특이성, cochleae, 폐, 심장, 및 눈 biopsies 했다 해 부 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA에서 그리고 통제 쥐 (하지 로 사-CAG-rtTA transgene 운반) RB1 식 (그림 6A - 6 C)에 대 한 평가. 조직 분석에 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA 에 제어 그룹 (그림 6A) RB1 단백질에 있는 뜻깊은 감소 관찰 되었다. 예리한 대조에서는, 눈, 심장, 및 cochleae Dox 처리 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA 고 전 하지만 조직 하지 DN-CBRb 대 본의 상당한 upregulation 보였다 나이 일치 하는 컨트롤 쥐의 qRT-PCR 분석은 후자의 마우스 확인해 (그림 6C) 이러한 결과 구성의 효율성을 확인합니다. 대 본 식 증가 반영 효과적인 Dox 규제 transgene 유도 합니다. 마찬가지로, 단백질 표정에 있는 감소는 내 생 RB1 라우팅 및 분해 저하 일치 합니다.
그림 1: 다단계 CBRb는 유도할 수 있는의 세대의 복제 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (A)이이 패널 pCS2-c B-Myc6 벡터에 Rb1 조각의 복제를 보여줍니다. 1583-bp Rb1 유전자 제품 PCR EcoRI + RB1243 앞으로 및 역방향 뇌관 Xba + EcoRV + RB2826 를 사용 하 여 증폭 했다. 결과 Rb1 조각 pCS2 + CB myc6 + Rb1 벡터 생성 하 CB Myc6 구조를 포함 하는 pCS2 벡터의 EcoRI 및 Xbal 제한 사이트 간에 복제 했다. (B)는 콜 럼 븀-myc6 + Rb1 조각 사리 및 EcoRV 금지 사이트 사이 pTetSplice 벡터에 복제 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Dox 규제 transgene 활성화의 효과. (A) NIH3T3 세포는 보통 RB113을 표현 하지 않습니다. TetO-DN-c B-myc6-Rb1 구조물의 효율적인 활성화 확인, 안티-RB1 항 체는 서쪽 오 점 분석 강력한 RB1 식을 Dox (레인 1와 3), 존재 하지만 그것의 부재 (2, 4 차선)에 밝혔다. (B) endogenously Rb114익스프레스, HEK293 세포 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 와 pCMV-Tet3G transactivator 벡터 cotransfected 했다. Dox (1 차선)의 부재, 긍정적인 RB1 식 관찰 되었다. 시스템에 Dox의 추가 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 활성화 및 RB1 downregulation (2 레인) 발생합니다. RB1 식 Dox 미디어 (3 차선)에서 제거 된 후 24 h는 재개 했다. C = 제어, Dox 치료 하지 않을 untransfected HEK293 세포. 이것은 원래 세포 신경 과학 프론티어2저널에 출판 그림에서 적응 이다. 그것의 재생산 국경'작가 정책' 저작권 유지와 함께 동의합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : DN-CBRb Dox 중재 transgene 활성화 증가 세포 증식. (A) 헤이 OC1 셀 cotransfected 순화 TetO-DN-c B-myc6-Rb1, 함께 그리고 pCMV Tet3G 벡터 부재 (−) 또는 Dox의 존재 (+)에 경작 되었다. 세포 증식 확산 분석 결과 사용 하 여 transfection 후 48 h는 결정 했다. 확산의 백분율 변화가 컨트롤 untransfected 세포 형광 값에 변화를 사용 하 여 계산 됩니다. 핸드폰 번호에 겸손 하지만 중요 한 증가 Dox 치료 다음과 transfected 세포에서 관찰 되었다. 대조적으로, 중요 한 변경 transfected 헤이 OC1 세포 사이 관찰 되었다 (−)로 대우 하지 Dox 및 untransfected 제어. (B) 헤이 OC1 셀 untransfected 또는 (C)와 정화 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 cotransfected와 pCMV Tet3G 벡터 Dox의 존재 (+)에 경작된 기-67 (레드), Phalloidin (녹색), DAPI (파란색)와 표시 했다. P < 0.05. 눈금 막대 = 10 µ m. 이것은 원래 세포 신경 과학 프론티어2저널에 출판 그림에서 적응 이다. 그것의 재생산 국경'작가 정책' 저작권 유지와 함께 동의합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene의 게놈 삽입의 교 잡 (물고기) 확인 형광 제자리에 . PCS2-CBRb (digoxigenin 프로브/안티-DIG-HRP/tyramide-비타민 b 복합체/avidin-Cy5, 빨간색에서) 테스트 프로브 프로브 신호 감지 수를 splenocytes 및 귀 섬유 세포 분열 또는 2.5 kb의 한 복사 대상 삽입 크기와 하지 때 교배 되었다. PCS2-CBRb 프로브에 밝은, 더블 릿 프로브 신호는 세그먼트 10 C 3-d 2 내 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene 삽입 한 염색체 10 때 교배를 테스트 합니다. RP23-267G 24 (스펙트럼 녹색) 제어 프로브 때 관심의 CBRb DNA 염색체 10에 삽입 예상 및 확인 밴드 10A1에서 염색체 10에 교배. (A)이이 패널 쇼 G-밴드 분열. (B)이이 패널 패널 A와 같이 같은 분열에서 tyramide 신호 증폭 (TSA) 물고기 이미지를 보여줍니다. (C)이이 패널 염색체 10 (1) G-밴딩, TSA (2) 물고기, 보여주는의 합성 이미지를 표시 하 고 (3) TSA 물고기를 거꾸로 DAPI 밴딩. 빨강 = pCS2-CBRb 프로브; 블루 DAPI 밴딩; = 녹색 = 24 RP23-267G 컨트롤 프로브. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 산 후 (P) 36의 내가 DN-CBRb transgene 활성화 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+)와 사-CAG-rtTA+ (CBRb−) 3 (그룹 1), 후 마우스 7 (2 그룹) 및 10 (그룹 3) Dox의 일 치료. (A-C) 안티-RB1, hyperphosphorylated 및 hypophosphorylated 형태의 RB1, 반응으로 잘으로 안티-c-myc 항 체 검출을 위해 사용 되었다. Densitometric 분석 이루어졌다 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여. 가져온 해당 값 부정적인 제어 CBRb로 표준화 했다− (-) 및 다음 β-말라. 상대 RB1 식 레벨 각 오 아래 표시 됩니다. (D) 정규화 된 RB1 식 레벨의 그래픽 표현을 그릴 CBRb+ (+)에 다른 치료 하이라이트 일관 되 게 낮은 RB1 탐지에 대 한 샘플. 서쪽 오 점 젤에 각 레인과 그래픽에 각 열은 다른 개인에 해당 합니다. P < 0.05.This 그림은 원래 세포 신경 과학 프론티어2저널에서 출판. 그것의 재생산 국경'작가 정책' 저작권 유지와 함께 동의합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) 및 DN-CBRb+ TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA transgene 활성화의 공간 분석 /로 사-CAG-rtTA− 부정적인 제어 (-) 마우스 심장, 눈, 폐, 그리고 달팽이 관 (A) Dox 중재 transgene 활성화의 효율성을 확인, 내 생 RB1의 표현 했다 CBRb+에 downregulated /사-CAG-rtTA+ 조직 하지만 부정적인 컨트롤 마우스 조직. Densitometric 분석 그림 5에 설명 된 대로 수행 되었다. 상대 RB1 식 레벨 각 오 아래 표시 됩니다. (B)이이 패널 정규화 RB1 식 수준이 다른 조직에 대 한 플롯의 그래픽 표현을 표시 합니다. 내 생 RB1 수준에 interindividual 변이 개별 응답 transgene 활성화 및 RB1 downregulation의 차이 설명할 수 있다. 눈, 심장, (C) RT-PCR 분석 및 cochleae Dox 처리 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ 조직, TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA 대 본의 상당한 upregulation 아니지만 공개 DN-CBRb+에서 /로 사-CAG-rtTA− 부정적인 제어 그룹. CBRb+/rtTA+ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+; CBRb−/rtTA+ = 사-CAG-rtTA+; P < 0.05. 이 그림 세포 신경 과학 프론티어2저널에 출판 했다. 그것의 재생산 국경'작가 정책' 저작권 유지와 함께 동의합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: PCR 상태 검사에 사용 되는 CB Rb1 퓨전 지역.
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Discussion
우회 전통적인 유전자 변형 전략와 관련 된 한계, 우리는 내 생 포 수 수 조건부로 비활성화 spatiotemporal 방식에서 그것의 DN 돌연변이 형태를 overexpressing에 의해 마우스 모델을 생성 하고자 했다. 내 생 Poi의 기능을 폐지 하 고 몇 가지 옵션이 제안된15,,1617되었습니다. 우리 그 식의 표현에 영향을 미치는 돌연변이 펩 티 드를 생성 하는 lysosomal 효소 CB의 융합 채용 간단한 전략에 Dox 종속 transcriptional 시스템을 결합 하 여 이전 유전 전략1 수정 내 생 포2. 가장 중요 한 것은,이 기술을 POI와 연결 된 통로의 사전 지식이 필요 합니다. 현재 DN 단백질 억제 전략 CBRb 융합 유전자에 lysosomal 지역화 신호 리소좀2,3으로 전체 RB 상호 작용 복잡 한 산란 하는 방법을 보여 줍니다. 한 번 리소좀, 안쪽이 단백질의 분해 처리 시작 됩니다, 그들의 저하3로 이어지는. CB 융합 단백질, TetO 시스템의 뒤집을 수 있는 inducibility와 관련 된의 본질적인 속성이 게 (완전 한 유전자 녹아웃, 조건부 삭제), 전통적인 유전자 변형 전략에 대 한 유용한 대안 특히 때는 관심사의 유전자의 완전 한 삭제는 바람직하지 않다.
우리 처음 RB1 단백질에 연구를 집중 했다. DN 돌연변이 단백질 이합체 또는 multimers 작동에서 가장 쉽게 설명. 날짜 하려면, RB1 분자 간의 직접적인 물리적 상호 작용의 증거가입니다. 그럼에도 불구 하 고, 그 활동의 고유한 특성은 주어진된 시간에 같은 복잡 한 여러 RB1 분자의 존재에 대 한 수 있습니다. 예를 들어 hypophosphorylated의 바인딩 E2F1 DP heterodimer RB1 히스톤 deacetylase (HDAC)18,,1920에 의해 점령 일반적으로 추가 바인딩 사이트를 제공 합니다. 다른 한편으로, HDAC1 RB1와 물리적으로 상호 작용 하 고이 복잡 한, 차례로, 추가 전사 억압18제공 E2F1-DP-RB1 heterotrimer에 바인딩합니다. 이 접근에 의하여 경우 적어도 RB1 분자 그룹에서의 DN 돌연변이 되지 것입니다 복잡 한 생 RB1, 따라서 도출 RB1 null 형의 수준을 감소 하는 동안 녹음, 억압에서. 여기, 내 생 RB1 금지 식 수에 Dox의 행정 후에 10 일 관찰 되었다. 그러나 Dox 유도 대 한 최적의 복용량 수 있습니다,, 각 시스템에 대 한 실험적으로 결정 될 필요가. 또한, 이후 대부분 Rb1 유전자 시퀀스의 구조 메이크업에 사용 되었다, 생 RB1의 부재에도 돌연변이 RB1 수와 상호 작용을 RB1의 바인딩 파트너의 DN 억제 유도 가능 하다. 이 전제는 알려진된 RB1 바인딩 분자 식 수준 평가 하 여 테스트할 수 있습니다.
많이-필요한, 정밀 하 게 레 귤 레이트 된 시간적, 가역 단백질 비활성화 다양 한 연구 분야 기본 복잡 한 생 화 학적 메커니즘에 검색의 더 넓은 수에서 연구 개발을 위한 기초를 제공할 것입니다. 유전자와 proteinactivity의 다양 한 측면입니다. POI에 따라 그것의 분자 복잡성을 이해 성공적인 치료 전략을 디자인 연구의 능력을 향상 시킬 가능성이 높습니다. 증가 transgene 특이성 조직 특정 발기인 온 또는 rtTA 라인 운전에 DN 마우스 사육 하 여 얻을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
PCS2 + CB Myc6 벡터 마샬 츠 (워싱턴 대학교, 시애틀, 워싱턴, 미국)에서 선물 했다. 헤이-OC1 셀 Fedrico Kalinec (데이비드 게 펜의과 대학, UCLA, 로스 앤젤레스, 캘리포니아, 미국)에 의해 친절 하 게 제공 되었다. 기술 지원 UNMC 마우스 게놈 엔지니어링 핵심 (cb를 Gurumurthy, 돈 Harms, 롤 렌 Quadros) 그리고 Creighton 대학 통합 생물 의학 이미징 시설 (리처드 Hallworth, 존 Billheimer)에 의해 제공 되었다. P20 GM103471 번호 부여 UNMC 마우스 게놈 엔지니어링/NIGMS, NIH에서에서 기관 개발 수상 (IDea는)에 의해 지원 되었다. 통합 생물 의학 이미징 시설 의학 및 GM103427 및 GM110768는 NIH/NIGMS에서 보조금 크레이 톤 대학에 의해 지원 되었다. 시설 연구 자원 (RR016469)에 대 한 국립 센터에서 교부 금 지원으로 건립 되었다 고 NIGMS (GM103427). 이 연구에서 생성 된 마우스 라인 크레이 톤 대학교 동물 자원 시설, 누구의 인프라 NIH/NCRR G20RR024001에 의해 부여를 통해 개량 되었다 유지 되었다. 과거는 NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE 부여 (셸리 D. 스미스), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S. S.M.R.), 그리고는 신흥 연구 부여 심리 건강 재단에서 (S. Tarang)를 통해 지원 받은이 작품. 이 연구의 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
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