Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN)
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para desenvolver um sistema inducible negativo dominante, em que qualquer proteína pode ser condicionalmente inativada pela superexpressão reversivelmente uma versão mutante dominante negativo dele.
Abstract
Inibição de proteína dominante negativo (DN) é um método poderoso para manipular a função da proteína e oferece diversas vantagens sobre outras abordagens de genoma. Por exemplo, embora quimérico e Cre-LoxP alvos estratégias têm sido amplamente utilizadas, as limitações intrínsecas destas estratégias (ou seja, atividade de promotor gotejante, expressão Cre de mosaico, etc) têm significativamente restringido sua aplicação. Além disso, uma eliminação completa de muitos genes endógenos é embryonically letal, tornando impossível para estudar a função dos genes na vida pós-natal. Para enfrentar estes desafios, temos fez mudanças significativas para um protocolo de engenharia genética precoce e uma versão curta (transgênica) do gene Rb1 aliada a uma protease lisossômica procathepsin B (CB), para gerar um modelo de mouse DN de Rb1 (CBRb). Devido à presença de uma protease lisossômica, a proteína de fusão CB-RB1 inteira e seu complexo de interação são roteadas para degradação mediada por Proteassoma. Além disso, a presença de um elemento de indutor (rtTA) tetraciclina na construção transgênica permite um regulamento inducible e reversível da proteína RB1. A presença de um promotor de ROSA-CAG onipresente no modelo do rato de CBRb torna uma ferramenta útil para realizar ablação de gene Rb1 transitória e reversível e fornecer um recurso de pesquisadores para a compreensão de sua atividade em praticamente qualquer tipo de célula onde RB1 é expresso.
Introduction
A maioria das abordagens visando os gene e proteína ablações dependem de processos de permanentes, que geralmente levam à eliminação completa ou truncamento do gene, sequências de RNA ou proteína de interesse (POI). O objetivo geral deste método é engenheiro uma proteína recombinante para suprimir a função da proteína endógena, selvagem-tipo. Nós temos revisitado e renovada uma estratégia alternativa1,2, que permite a ablação temporária de um POI através da inibição de DN. Esse método funciona para ambos multiméricas e peptídeos monoméricos, mas é o mais adequado para as proteínas que funcionam em um assembly multiméricas.
O método consiste em fundir a protease lisossômica CB para uma subunidade de uma multiméricas POI (fusão de CB complexo). A fusão de CB resultante complexa pode interagir com e proteoliticamente digerir a proteína endógena ou desviar todo o complexo para o lisossoma para ser degradada3CB-POI. Além disso, uma combinação da fusão CB complexa com a natureza inducible do sistema controlado por tetraciclina ativação transcricional (TetO) permite uma expressão inducible e controlada do transgene em uma moda reversível2. Embora útil em muitas circunstâncias, a completa eliminação de genes ou proteínas in vivo pode resultar em letalidade4,5,6. Da mesma forma, exclusão condicional, tecido-específica de alguns genes ou proteínas utilizando o sistema Cre/Lox pode não ser simples, como, em última análise, conduzirá à perda permanente de elementos críticos de genômica7. Portanto, dependendo do gene ou POI, nenhuma dessas abordagens será eficaz em fornecer um modelo útil para estudos posteriores, particularmente dos genes ou dos proteínas estudos funcionais em camundongos adultos e pós-natal atrasados.
Para contornar os problemas associados com tais abordagens e fornecer prova de princípio sobre a eficácia do método proposto, decidimos testar o método apresentado aqui, gerando uma versão DN condicional da proteína do Retinoblastoma 1 (RB1). Várias opções foram propostos8,9,10 para abolir a função de RB1 endógena; no entanto, todos eles enfrentaram algumas das mesmas limitações discutidas acima: exclusão permanente germline de RB1 é embryonically letal, e, coerente com seu papel de supressor de tumor, permanente exclusão condicional RB1 leva a uma variedade de tumores11. Apesar de uma versão do DN de RB1 não parece ocorrer naturalmente, uma alternativa melhor para as estratégias atualmente disponíveis deve permitir uma inativação temporalmente controlada do RB1 endógena e fornecem um mecanismo alternativo para eventualmente restaurar sua função. A base para tal uma construção foi descrita há mais de duas décadas atrás1. No entanto, devido às limitações tecnológicas, faltava-lhe um mecanismo de controle do transgene ativação de resposta e especificidade de tecido. Este estudo é o primeiro a combinar a elegância de doxiciclina (Dox)-sistema transcriptional dependente com uma engenharia construção transgênica de protease lisossômica CB e Rb1 proteínas. O modelo resultante do rato CBRb permite um temporariamente regulamentado RB1 mediada por Dox regra2. A vantagem de usar uma abordagem baseada em proteoma para estudar a função dos genes é que pode ser adotado para qualquer gene de interesse, com informações mínimas sobre a sua actividade.
A estratégia proposta do transgene DN oferece muitas vantagens sobre as abordagens tradicionais. Primeiro, inibição da proteína de DN leva a apenas uma ablação parcial na atividade da proteína, preservando assim uma expressão residual endógena. Esse resultado é altamente desejável em situações onde uma eliminação completa da atividade da proteína leva a letalidade embrionária, limitando grandemente qualquer investigação para estudar a função do gene em um rato vivo. Em segundo lugar, a presença do sistema de TetO permite ativação do transgene apenas na presença de um antibiótico, o que permite um controle eficiente e reversível da atividade do transgene. Assim, por cessar a administração de antibióticos, o sistema transgênico pode ser desativado, e uma expressão normal de RB1 está de volta em casa. Em terceiro lugar, a especificidade da expressão do transgene pode variar dependendo do promotor da escolha. Enquanto nós escolhemos o promotor ROSA-CAG onipresente para prova de princípio, colocar o transgene sob um promotor de tecido-específica é susceptível de restringir a expressão do transgene indesejados e facilitar estudos sobre a aplicação terapêutica deste transgene metodologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para contornar as limitações associadas com as estratégias tradicionais de transgénicas, procuramos gerar um modelo de mouse em que um POI endógena pode ser condicionalmente inativado pela superexpressão uma forma mutante de DN do de uma forma spatiotemporal. Suprimir a função de POIs endógenas, várias opções foram propostos15,16,17. Modificamos um anterior estratégia genética1 , combinando …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O pCS2 + CB-Myc6 vector foi um presente do Marshall Horwitz (Universidade de Washington, Seattle, WA, Estados Unidos da América). As células de IES-OC1 foram gentilmente cedidas por Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, EUA). Suporte técnico foi fornecido por UNMC Mouse genoma engenharia núcleo (C.B. Itala, Don Harms, Rolen Quadros) e a Creighton University Biomedical Imaging usina integrada (Richard Hallworth, John Billheimer). A engenharia de genoma UNMC Mouse foi apoiado por um prêmio de desenvolvimento institucional (ideia) do NIH/NIGMS, conceda número GM103471 P20. A usina integrada de imagem biomédica foi apoiada pela escola de medicina e doações GM103427 e GM110768 do NIH/NIGMS Universidade Creighton. A instalação foi construída com o apoio de subsídios do centro nacional para recursos de pesquisa (RR016469) e o NIGMS (GM103427). As linhas de rato geradas neste estudo foram mantidas em instalações de recurso Animal da Universidade de Creighton, cuja infra-estrutura foi melhorada através de uma concessão pelo NIH/NCRR G20RR024001. Este trabalho recebido passado apoio através de um NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE conceder (a Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) e uma bolsa de investigação emergentes da Fundação de saúde auditiva (de S. Jorge). O conteúdo desta pesquisa é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
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