Summary
Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema inducible negativo dominante, en el que cualquier proteína puede ser condicional inactivada por overexpressing reversiblemente una versión mutante dominante negativo de él.
Abstract
Dominante negativa inhibición de la proteína (DN) es un método potente para manipular la función de la proteína y ofrece varias ventajas sobre otros enfoques basados en el genoma. Por ejemplo, aunque quimérica y Cre-LoxP estrategias objetivos han sido ampliamente utilizados, las limitaciones intrínsecas de estas estrategias (es decir, actividad de promotor agujereado, expresión del Cre de mosaico, etc.) han restringido significativamente su aplicación. Por otra parte, una canceladura completa de numerosos genes endógenos es catequizador letal, lo que hace imposible para el estudio de funciones de los genes en la vida postnatal. Para enfrentar estos desafíos, hemos hecho cambios significativos a un protocolo de ingeniería genética temprana y combina una versión corta (transgénica) del gen Rb1 con una proteasa lysosomal B procathepsin (CB), para generar un modelo de ratón de DN de Rb1 (CBRb). Debido a la presencia de una proteasa lisosomal, la proteína de la fusión completa de CB-RB1 y su complejo de interacción se dirigen para la degradación mediada por el proteasoma. Por otra parte, la presencia de un elemento inductor (rtTA) de tetraciclina en la construcción de transgénico permite una regulación inducible y reversible de la proteína de RB1. La presencia de un promotor de ROSA-CAG omnipresente en el modelo de ratón de CBRb es una herramienta útil para realizar ablación de gene Rb1 transitoria y reversible y proporcionar a los investigadores un recurso para comprender su actividad en prácticamente cualquier tipo de célula donde se expresa el RB1.
Introduction
Enfoques más con el objetivo de la ablación del gen y la proteína dependen de procesos permanentes, que generalmente conducen a la eliminación completa o el truncamiento de la gene, secuencias de ARN o proteínas de interés (POI). El objetivo general de este método es diseñar una proteína recombinante para suprimir la función de la proteína endógena, tipo salvaje. Hemos revisado y renovado una estrategia alternativa1,2, que permite la ablación temporal de un POI a través de la inhibición de la DN. Este método funciona para multiméricas y péptidos monoméricos pero es el más adecuado para las proteínas que funcionan en una Asamblea de multimérica.
El método consiste en fundir la proteasa lisosomal CB a una subunidad de un multimérica POI (complejo de fusión de la CB). La fusión resultante de CB complejo puede interactuar con proteolytically digerir la proteína endógena y desviar todo el complejo de POI CB al lisosoma para ser degradados3. Por otra parte, una combinación de la fusión de CB compleja con el carácter inducible del sistema de activación transcripcional controlado por tetraciclina (TetO) permite una expresión inducible y controlada del transgén en una manera reversible2. Aunque útil en muchas circunstancias, la supresión completa de genes o proteínas in vivo puede resultar en mortalidad4,5,6. Además, eliminación de tejidos específicos, condicional de algunos genes o proteínas mediante el sistema Cre/Lox puede no ser sencillo, ya que provocaría, en última instancia, a la pérdida permanente de elementos genómicos críticos7. Por lo tanto, dependiendo de la genética o POI, ninguno de estos enfoques será eficaz en proporcionar un modelo útil para estudios posteriores, particularmente genes o proteínas los estudios funcionales en ratones adultos y postnatales tardíos.
Para eludir los problemas asociados con estos enfoques y proporcionar prueba de principio sobre la efectividad del método propuesto, hemos optado por probar el método presentado aquí por generar una versión DN condicional de la proteína Retinoblastoma 1 (RB1). Varias opciones han sido propuestos8,9,10 para suprimir la función de RB1 endógeno; sin embargo, todos ellos frente a algunas de las mismas limitaciones mencionadas: eliminación permanente del germline de RB1 es catequizador letal y, coherente con su función de supresor de tumor, permanente borrado condicional RB1 conduce a una variedad de tumores11. Aunque una versión de DN de RB1 parece no ocurre naturalmente, una mejor alternativa a las estrategias actualmente disponibles debe permitir una inactivación temporal controlada de RB1 endógeno y proporcionar un mecanismo alternativo para finalmente restaurar su función. La base para dicha construcción fue descrita hace más de dos décadas1. Sin embargo, debido a limitaciones tecnológicas, carecía de un mecanismo de control transgen activación, la respuesta y la especificidad de tejido. Este estudio es el primero en combinar la elegancia de la doxiciclina (Dox)-sistema transcripcional dependiente con una construcción transgénica ingeniería de proteínas de CB y Rb1 proteasa lisosomal. El modelo de ratón de CBRb resultante permite una RB1 mediada por Dox temporalmente regulada regulación2. La ventaja de utilizar un enfoque basado en el proteoma para estudiar la función genética es que puede adoptarse para cualquier gen de interés, con la mínima información sobre su actividad.
La estrategia propuesta de transgen DN ofrece muchas ventajas sobre los enfoques tradicionales. En primer lugar, inhibición de la proteína DN conduce a solamente una ablación parcial en actividad de la proteína, preservando así una expresión endógena residual. Ese resultado es muy conveniente en situaciones donde una eliminación completa de la actividad de la proteína conduce a mortalidad embrionaria, limitando grandemente cualquier investigación para estudiar la función del gen en un ratón vivo. En segundo lugar, la presencia del sistema TetO permite activación de transgen sólo en presencia de un antibiótico, que permite un control eficaz y reversible de la actividad del transgen. Así, al dejar la administración de antibióticos, se puede desactivar el sistema de transgénico, y es una expresión normal de RB1 en lugar. En tercer lugar, la especificidad de la expresión del transgen puede variar según el promotor de la opción. Aunque hemos optado por el promotor de ROSA-CAG ubicuo para la prueba de principio, colocar el transgén en un promotor tejido específico es probable restringir la expresión del transgén no deseados y facilitar estudios sobre la aplicación terapéutica de este transgén metodología.
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Protocol
Generación de todo cuidado de los animales en el ratón transgénico de CBRb y experimentos relacionados con el estudio fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional de Universidad de Creighton y el Comité uso (IACUC) y realizadas por sus orientaciones.
1. transgénicos CB-Myc6-construcción de Rb1
Nota: La clonación de CBRb en un vector de pTet_Splice fue hecha en un proceso de múltiples paso (figura 1A y 1B).
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Llevar a cabo la primera clonación de etapa en la pCS2 + CB-Myc6 vector.
- Para crear la construcción del transgén de CBRb, amplificar un fragmento de cDNA de Rb1 de 1583-bp-largo (528 los aminoácidos correspondientes a la región del aminoácido 369 – 896) de la proteína de RB1 utilizando la siguiente cartilla establece: para EcoRI +RB 1243F, utilice GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCy XbaI + EcoRV +2826 RBR, CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
- Copia el fragmento generado (1546 bp) entre los sitios de restricción EcoR1 y XbaI del pCS2 + CB-Myc6 vector como se describió anteriormente1,12.
Nota: La construcción de CB-Myc6 1012-bp-larga (337 aminoácidos) fusionados con el fragmento de Rb1 dio lugar a una proteína de aproximadamente 865 aminoácidos (aproximadamente 108 kDa), que es ligeramente más pequeña que la proteína endógena de RB1 (~ 110 kDa) (figura 1 Un), con una etiqueta de6 CB-Myc en el N-terminal y Rb1 en el C-terminal.
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Llevar a cabo la segunda etapa subcloning en el vector pTet-empalme.
- Amplificar el fragmento de fusión Myc6-RB-CB y ganar el promotor Tet, amplificar el cassette, que consiste en la CB-myc6-Rb1 usando las cartillas que contienen los EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) y SalI : para SalI +CBF, uso de CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
- Subclone el fragmento generado (2567 bp) en el vector pTet-empalme, entre los sitios de restricción SalI y EcoRV , de tal manera que el transgén de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 todo, incluyendo el intrón SV40 y el PolyA, puede ser aislada mediante una sola digestión con NotI (figura 1B).
Nota: El fragmento de NotI se utilizó para generar a los transgénicos fundadores.
2. en las pruebas de Vitro del transgén TetO-DN-CB-myc6-Rb1
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DOX-Reglamento: Línea de células NIH3T3
Nota: A menos que se indique lo contrario, todos los volúmenes se han ajustado para una placa de 6 pozos.- Crecen las células NIH3T3 siguiendo las especificaciones del proveedor, utilizando los medios de cultivo celular recomendado que contiene 10% de suero fetal bovino a 37 ° C con 10% CO2.
- Cotransfect las células con pTet-empalme y vectores pCMV-Tet3G (desde el paso 1) por 24 h. siguen los pasos mencionados a continuación para cotransfection.
- Mezcla de 2-4 μL del reactivo de transfección basada en lípidos/pozo y 1 mL de incompleta (sin suero) de Dulbecco modificado Eagle medio (DMEM) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para una placa de 12 o 24 pocillos, utilice 250 o 500 μl de medio de cultivo, respectivamente y Ayuste el volumen de reactivo de transfección.
- Añadir 2 – 3 μg de plásmido ADN/bien al reactivo de transfección-DMEM e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
- Añadir la mezcla que contiene el ADN y el reactivo de transfección en DMEM a cada pocillo. Después de 3 – 4 h de incubación, añadir 1 mL de medio completo (de modo que el volumen final es de 2 mL/pocillo). Guardar alícuotas de Dox stock (1 mg/mL) y añadir 2 μL en cada uno de los pozos (+ Dox). Incube las células a 37 ° C con 5% CO2.
Nota: Muestras de control deben consistir en cotransfected células no tratadas con Dox (-Dox), así como las células NIH3T3 transfectadas con el vector de Tet3G pCMV transactivator y trataron con Dox por un período de 24 h. Para pCMV-Tet3G, las concentraciones de 0.1-1 μg/mL Dox debe ser suficiente para inducir la expresión del transgén.
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Prueba de la reversibilidad de la construcción mediante la línea de células HEK293.
- Para probar la reversibilidad del transgén TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , células en cultivo HEK293 del águila mínimo esencial media (EMEM) siguiendo las especificaciones del proveedor y cotransfect con vectores pTet-empalme y pCMV-Tet3G de 24 h, como se describe arriba (paso 2.1.2).
- Para la inactivación del transgen, eliminar los medios de comunicación que contiene Dox después de 24 h, lavar la células 2 x-3 x con tampón fosfato salino (PBS) e incubar en medios libres de Dox para un 24 h adicional.
Nota: Sobre Dox-retiro, la inactivación del transgen y expresión de la proteína regular deben reanudar dentro de ese plazo de 24 h.
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Para evaluar la funcionalidad de la construcción de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 en la promoción de la proliferación celular no programada, realizar el análisis funcionales utilizando una línea celular de HEI-OC1, como se describe a continuación.
- HEI-OC1 células en cultivo en 10% DMEM bajo permisiva condiciones (33 ° C con 10% CO2). Para estudios de proliferación celular, contar las células usando un contador de células y células de HEI-OC1 placa 10.000 en una placa de 96 pocillos en un volumen de 200 μl. Incube las células durante la noche.
- Al día siguiente, realizar una transitoria cotransfection de vectores pTet-empalme y pCMV-Tet3G utilizando un reactivo de transfección basada en lípidos (ver pasos 2.1.2). En un pozo independiente, realizar pmR-ZsGreen1 transfección at2 μg utilizando el reactivo de transfección basada en lípidos (pasos 2.1.2) para calcular la tasa de transfección. Utilice las células transfectadas no como controles.
- Detectar la presencia de fluorescencia verde bajo un microscopio de fluorescencia (excitación = 485 nm, emisión = 530 nm) para el transfected las células 24 h después de transfección. Registrar la presencia o ausencia de fluorescencia verde y calcular la tasa de la transfección como el número total de células GFP-positivas (células transfected) sobre las células etiquetadas con DAPI (células totales).
Nota: Se estimó una tasa de transfección de ~ 70%. - Para inducir la expresión de transgenes, añadir 1 μg/mL Dox a un subconjunto de células transfected mientras usa el otro subconjunto como control (-Dox). Uso de las células no tratadas de HEI-OC1 como controles adicionales.
- Para evaluar la proliferación celular, utilice un kit de proliferación celular según protocolo del fabricante.
- En Resumen, 48 h después de la transfección, eliminar el medio de cultivo celular y añadir 100 μl de solución de unión a la tinte 1 x a cada pocillo de la microplaca. Incubar durante 1 h a 37 ° C.
- Después de eso, medir la intensidad de fluorescencia de cada muestra usando un lector de microplacas de fluorescencia (excitación = 485 nm, emisión = 530 nm).
- Para evaluar mediante inmunocitoquímica la proliferación celular, las células de HEI-OC1 en un vidrio de cubierta en una placa de 12 pozos de la placa e incubar durante una noche a 37 ° C.
- Al día siguiente, cotransfect pTet-empalme y pCMV-Tet3G y realizar el tratamiento de Dox (+ Dox). Utilice las células untransfected como controles. Células de HEI-OC1 proceso de etiquetado Ki-67.
- Fijar las células con 4% paraformaldehido (PFA) en PBS, pH 7,4, 10 min a temperatura ambiente. Lavar las células 3 x con helada PBS e incubar las células en detergente no iónico de 0,25% en PBS durante 10 minutos.
- Lavar las células otra vez, 3 veces en PBS por 5 min y bloque con 10% de suero en una cámara humidificada durante 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar las células en 500 μl de anticuerpo primario de Ki-67 (dilución 1: 200) durante 3 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Lavar las células 3 x durante 5 minutos con PBS. Después de eso, incubar las células con el anticuerpo secundario por 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
- La solución de anticuerpo secundario de quitar y lavar las células 3 x con PBS durante 5 minutos en la oscuridad.
- Para el etiquetado phalloidin, incubar las células HEI-OC1 phalloidin 1: 200 por 30 minutos. Para los núcleos de las células de la etiqueta, incubar las células con DAPI de 5 μg/mL durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Nota: Asegúrese de que el conjugado de tinte phalloidin es diferente al conjugado de anticuerpo secundario.
3. generación de CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) ratones transgénicos y en Vivo la prueba del enfoque DN CBRb
- Sobre la confirmación de la efectiva regulación de Dox del transgén TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , purificar el fragmento NotI y microinject en cigotos de ratón, que más tarde se transfieren a pseudo-hembras.
Nota: Estos procedimientos se llevaron a cabo en la Universidad de Nebraska centro (UNMC) ratón genoma ingeniería núcleo facilidad médica. - Después de la entrega, el genotipo de las crías con un primer set específicas a la región de fusión CB-Rb1 : para CBRb F, utilice 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3 ' y para R de CBRB, 5′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3′.
Nota: El tamaño del producto PCR en gel de agarosa es 401 bp (bp 60 CB región + región de Rb1 341-bp (tabla 1). Se identificaron diez líneas fundador independiente, basada en la presencia del transgen TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . En cinco de estas líneas, progenie heredó el transgén, que confirmó la transmisión de la línea germinal del transgén. En última instancia, una de las líneas transgénicas se utilizó para establecer y mantener la línea y generar animales experimentales de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 para estudios posteriores. - Se crían ratones adultos de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 a la línea ROSA-CAG-rtTA de inductor de la tetraciclina (Stock #006965) (alternativamente, raza a una línea de tTA inductor) para generar ratones experimentales de DN CBRb. Genotipo de la descendencia de esta cruz con el siguiente conjunto de cartilla: rtTA WT R, utilice GGAGCGGGAGAAATGGATATG; para rtTA mutante R, use GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; y para rtTA común, AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Los tamaños del producto PCR son 340 bp (mutante), 340 bp y 650 bp (heterocigoto) y 650 bp (tipo salvaje).
- Generar una curva de dosis-respuesta de la proteína de RB1 después del tratamiento de Dox para determinar el tiempo y la longitud del Dox tratamiento necesario para obtener una expresión del transgén.
Nota: En este experimento, western blot y qRT-PCR fueron utilizados para evaluar tejidos específicos transgen activación y expresión de RB1. - Realizar en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) para confirmar la inserción genómica del transgén.
Nota: Esto se llevó a cabo en el centro de genómica aplicada del Hospital para niños enfermos (Toronto, Canadá). ELISA o western blot (mediante anticuerpos específicos de proteína) puede utilizarse para evaluar la activación del transgen, especificidad de tejido y cambios en los niveles del PDI endógeno. Para la construcción DN-CB-myc6-Rb1 , se utilizó un anticuerpo anti-RB1.
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Representative Results
En general, diseñar una mutación DN requiere una cantidad considerable de información sobre la estructura y función de la PDI. En contraste, la estrategia de DN presentada aquí es particularmente útil cuando la información estructural y funcional para el POI es limitada. Si el POI es una proteína multimérica, una fusión de una subunidad a una proteasa lysosomal dominante puede inhibir multimer montado y, potencialmente, otros ligandos a través de una combinación de la proteólisis de las subunidades endógenas y desviación subcelular de los MulTimer al lisosoma. Para confirmar el éxito de clonación y probar la efectividad de la activación de transgen regulado Dox, plásmidos pTet-empalme purificada que contiene el TetO-DN-CB-myc6-Rb1 construcción fue transfected en las células NIH3T3 ratón que estable la rtTA proteína, pero no de Rb113. En ausencia de Dox, las células que expresan rtTA no muestran ninguna expresión de RB1, mientras que una sólida expresión de RB1 se observó presencia de Dox (figura 2A). A continuación, para comprobar la reversibilidad del sistema, cotransfected las células HEK293 (que expresan endógeno Rb114) con purificada pTet-empalme /TetO-DN-CB-myc6-Rb1 y los vectores pCMV-Tet3G. Como era de esperar, la expresión de la proteína endógena de RB1 fue inhibida perceptiblemente en la activación del transgen mediante la adición de Dox en los medios de cultivo celular (figura 2B). Para comprobar la reversibilidad del sistema, después de un período de 24 h, en un subconjunto de las células HEK293, sustituye los medios de cultivo celular que contiene el Dox con fresco libre de Dox con los medios de comunicación y se incubaron las células para un adicional de 24 h. apoyando la reversibilidad regulado Dox, RB1 expresión fue restaurada sobre retiro de Dox de los medios de cultivo (figura 2B). Transfected las células HEK293 que no fueron tratadas con Dox o HEK293 Dox tratados las células transfected con el pCMV-Tet3G vector solamente (figura 2B) mostraron niveles basales de expresión endógena de RB1. Porque las células NIH3T3 no expresan RB1 proteína naturalmente, la reactividad positiva de RB1 es debido a la acumulación de la proteína transgénica de RB1. Dado nuestro interés en el potencial efecto proliferativo de la construcción de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 en el sistema auditivo, medimos el contenido total de ADN en pTet-empalme /TetO-DN-CB-myc6-Rb1- y HEI-OC1 pCMV-Tet3G-transfected las células () órgano del oído interno de una línea celular derivada de Corti) en presencia y ausencia de Dox. Consistente con la hipótesis de trabajo presentada aquí, observó un aumento significativo en el contenido de ADN (que corresponde a un aumento en el número de células) en tratados con Dox pero no sin tratamiento (control) transfected las células HEI-OC1 (Figura 3A - 3 C ).
Tras la confirmación in vitro de la función y actividad de transgen, se generó un modelo de ratón transgénico. De pescado, utilizando un TetO-DN-CB-myc6-Rb1 digoxigenina (DIG)-peroxidasa de rábano de caballo (HRP) / tiramina biotina/avidina-Cy5-marcado con sonda y las bandas G de los fibroblastos de oído y esplenocitos de ratones machos fueron realizados para confirmar la inserción transgénica en el genoma de ratones transgénicos. Uno de los cinco fundadores que transmite del germline, inserción de la línea 14 mostró un transgen consistente en segmento C 10 3 ~ D2 (Figura 4A - 4C). Ratones de esta línea fueron utilizados para establecer las colonias de cría y generar animales experimentales para estudios posteriores. Para determinar el momento óptimo para la inducción de Dox y activación del transgén de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , dividimos los ratones transgénicos en tres grupos diferentes, en donde Dox fue administrado en el agua potable durante periodos variables de tiempo: Grupo 1 (3 días de tratamiento), Grupo 2 (7 días de tratamiento) y Grupo 3 (10 días de tratamiento). Al finalizar el tratamiento, se evaluaron cambios en la expresión de la proteína de RB1 por western blot (figura 5A - 5D). Porque el DN y nativos RB1 proteínas tienen pesos moleculares similares, no se puede resolver unos de los otros en un western blot. Sin embargo, consistente con un aumento inicial en RB1 proteína (debido a la acumulación de proteínas endógenas y DN-RB1), hubo un incremento inicial en la expresión de proteína total de RB1 en las cócleas de ratón transgénico comparado con el grupo control (figura 5 A). por otra parte, de acuerdo con la actividad inhibitoria y proteolítica del producto del transgen de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , cuantificable en expresión de RB1 se observó una reducción en los grupos 2 y 3 en comparación con el grupo 1 y el grupo control ( Figura 5A - 5 D). De nota, más de 10 días de tratamiento no produjo ningún cambio más en la expresión de la proteína de RB1. Así, 10 días de tratamiento Dox era considerado óptimo y se utiliza para estudios adicionales.
Porque la rtTA y, consecuentemente, la activación del transgén de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 son bajo el omnipresente promotor ROSA-CAG , RB1 podrían inhibir potencialmente en cualquier tejido o célula donde RB1is endógeno expresado (e.g., pulmones, corazón, retina). Para probar esta premisa y para evaluar la especificidad de tejido del transgén, se disecaron cócleas, pulmones, corazón y biopsias de ojo de TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTAy ratones control (no lleva el transgén de la ROSA-CAG-rtTA ) fueron evaluó la expresión de RB1 (figura 6A - 6 C). Independientemente de los tejidos analizados, se observó una reducción significativa en RB1 proteína en TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA pero no en el grupo control (figura 6A). En contraste, qRT-PCR analiza en el ojo, corazón y cócleas de tratados con Dox TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA y los ratones de edad comparable del control demostradas una significativa upregulation de la transcripción de CBRb DN en los tejidos de la anterior, pero no la ratones de este último (figura 6C). En conjunto, estos resultados confirman la eficacia de la construcción. Un aumento en la transcripción expresión refleja la inducción efectiva regulados por Dox transgen. Asimismo, una reducción en la expresión de la proteína es consistente con la degradación proteolítica y enrutamiento de RB1 endógena.
Figura 1: multi-step de clonación de la generación de la inducible y CBRb TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (A) este panel muestra la clonación del fragmento de Rb1 en el vector pCS2-CB-Myc6 . Un producto del gene Rb1 1583-bp fue PCR amplificado usando EcoRI + RB1243 adelante los primers reversas Xba + EcoRV + RB2826 . El fragmento resultante de Rb1 fue clonado entre los sitios de restricción EcoRI y Xbal de pCS2 vector que contiene la construcción de la CB-Myc6 para generar el vector pCS2 + CB-myc6 + Rb1 . Fragmento (B) la myc6 CB + Rb1 fue clonado en el vector de pTetSplice entre los sitios de restricción SalI y EcoRV . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Eficacia de la activación del transgen regulados por Dox. (A) células NIH3T3 no expresan generalmente RB113. Confirmando la activación eficaz de la construcción de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , un análisis de western blot con el anticuerpo anti-RB1 reveló una sólida expresión de RB1 en presencia de Dox (carriles 1 y 3), pero no en su ausencia (carriles 2 y 4). (B) las células HEK293, que expresan endógeno Rb114, fueron cotransfected con TetO-DN-CB-myc6-Rb1 y el vector del transactivator pCMV-Tet3G. En la ausencia de Dox (carril 1), se observó una expresión positiva de RB1. La adición de Dox al sistema causó la activación de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 y RB1 downregulation (carril 2). La expresión RB1 se reanudó 24 horas después de Dox fue quitado de los medios de comunicación (carril 3). C = control, untransfected células HEK293 no tratadas con Dox. Se trata de una adaptación de una figura publicada originalmente en la revista fronteras de la neurociencia celular2. Su reproducción está de acuerdo con las fronterasretención derechos de autor de "política de autores". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Dox-mediada DN-CBRb transgen activación aumenta la proliferación celular. (A) células de HEI-OC1 cotransfected con purificada TetO-DN-CB-myc6-Rb1, y los vectores pCMV-Tet3G fueron cultivados en ausencia (−) o presencia (+) de Dox. Proliferación celular se determinó 48 h después de la transfección con un ensayo de proliferación. Se calculó el cambio porcentual en la proliferación mediante un cambio en los valores de fluorescencia con células untransfected como control. Un modesto pero significativo aumento en el numero de celular se observó en las células transfected, después del tratamiento de Dox. En cambio, no observaron cambios significativos fueron entre células transfected HEI-OC1 Dox no tratada con (−) y el control de untransfected. (B) células de HEI-OC1 untransfected o (C) cotransfected con TetO-DN-CB-myc6-Rb1 purificada y los vectores de pCMV-Tet3G cultivados en la presencia (+) de Dox fueron etiquetados con Phalloidin (verde) y Ki-67 (rojo) y DAPI (azul). P < 0.05. Barra de escala = 10 μm. Se trata de una adaptación de una figura publicada originalmente en la revista fronteras de la neurociencia celular2. Su reproducción está de acuerdo con las fronterasretención derechos de autor de "política de autores". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Fluorescente en situ confirmación del hibridación (pescado) de la inserción genómica del transgén TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . Un CBRb pCS2 (digoxigenina sonda/anti-DIG-HRP/tyramide-biotina/avidina-Cy5, en rojo) punta de prueba fue cruzado por hibridación a metafase de células de fibroblasto esplenocitos y oído para ver si se podría detectar la señal de la sonda o no con un tamaño de inserto de destino una copia de 2,5 kb. La CBRb pCS2 prueba sonda cruzó por hibridación a un cromosoma 10 con señales de sonda doblete brillante, que demostró la inserción del transgén TetO-DN-CB-myc6-Rb1 dentro del segmento C 10 3-D2. Cruzado por hibridación la sonda de control RP23 - 267 24 (gama verde) al cromosoma 10 en 10A1 banda como previsto y confirmado que el ADN de CBRb de interés insertado en el cromosoma 10. (A) este panel muestra la banda G metafase. (B) este panel muestra la imagen de tyramide de pescado de amplificación (TSA) de señal de la metafase de la misma como se muestra en el panel A. (C) este panel muestra imágenes compuestas del cromosoma 10 que muestra (1) G-banding, pescado (2) TSA, y peces (3) TSA con invertido DAPI bandas. Rojo = pCS2 CBRb sonda; azul = DAPI bandas; verde = RP23 - 267 24 sonda de control. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : DN-CBRb activación del transgen en el oído interno de postnatal (P) 36 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+) y ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb−) ratones después de 3 (Grupo 1), 7 (Grupo 2) y 10 (grupo 3) días de Dox tratamiento. (A-C) Anti-RB1, que reacciona con las formas hiperfosforilada y hypophosphorylated de RB1, como anticuerpos así como anti-c-myc fueron utilizados para la detección. Análisis densitométricos se realizó utilizando el software ImageJ. Se normalizaron los valores correspondientes obtenidos para el control negativo CBRb− (-) y luego a β-actina. Los niveles de expresión relativos de RB1 se muestran debajo de cada mancha. (D) La representación gráfica de los niveles de expresión de RB1 normalizados conspiraron contra la detección de destaca un RB1 constantemente más bajo diferentes tratamientos de CBRb+ (+) muestras. Cada carril del gel de la mancha blanca /negra occidental y cada columna en el gráfico corresponden a un individuo diferente. P < 0.05.This figura fue publicado originalmente en la revista fronteras de la neurociencia celular2. Su reproducción está de acuerdo con las fronterasretención derechos de autor de "política de autores". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Análisis espacial de la activación del transgen TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) y DN-+de CBRb /ROSA-CAG-rtTA− negativo ratones control (-) corazón, ojos, pulmones y cóclea. (A) confirmar la eficacia de la activación mediada por Dox transgen, la expresión de RB1 endógena fue regulada en la CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ los tejidos pero no en los tejidos de ratones de control negativo. Análisis densitométricos se realizan como se describe en la figura 5. Los niveles de expresión relativos de RB1 se muestran debajo de cada mancha. (B) este panel muestra una representación gráfica de los niveles de expresión de RB1 normalizados enfrenta a los diferentes tejidos. Una variación interindividual en los niveles endógenos de RB1 puede explicar diferencias en respuestas individuales a activación del transgén y downregulation de RB1. (C) RT-PCR analiza en ojo, corazón, y cócleas revelaron una significativa upregulation de la transcripción TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA en los tejidos tratados con Dox TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ , pero no en el DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− negativo grupo de control. /RtTA de CBRb++ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+; CBRb−/rtTA+ = ROSA-CAG-rtTA+; P < 0.05. Esta figura fue publicada originalmente en la revista fronteras de la neurociencia celular2. Su reproducción está de acuerdo con las fronterasretención derechos de autor de "política de autores". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: condiciones PCR utilizado para el control de la CB-Rb1 región fusión.
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Discussion
Para eludir las limitaciones asociadas con las estrategias tradicionales de transgénicas, se buscó generar un modelo de ratón en el que un POI endógena puede ser condicional inactivado por overexpressing una forma mutante de DN de él de manera espacio-temporal. Para suprimir la función de POIs endógenos, varias opciones han sido propuestos15,16,17. Hemos modificado una estrategia genética anterior1 combinando el sistema transcripcional dependiente de Dox a una estrategia sencilla que emplea una fusión de la proteasa lisosomal CB para generar un péptido mutante cuya expresión afecta a la expresión de el POI endógeno2. Lo más importante, esta técnica no requiere de ningún conocimiento previo de la vía asociada al PDI. La actual estrategia de inhibición de la proteína DN demuestra que la señal de localización lysosomal en el gene de fusión de CBRb desvía el complejo RB interactuando hacia el lisosoma2,3. Una vez dentro de lisosomas, se inicia el proceso proteolítico de las proteínas, llevando a su degradación3. La propiedad intrínseca de la proteína fusionados con el CB, asociada a la inducibilidad reversible del sistema TetO, lo hace una alternativa útil para estrategias transgénicas tradicionales (por ejemplo, knockout del gen completo, supresión condicionada), particularmente cuando la deleción completa del gen de interés no es deseable.
Inicialmente nos centramos la investigación en la proteína de RB1. Mutaciones de DN se describen más fácilmente en las proteínas que funcionan como dímeros o Multímeros. Hasta la fecha, no hay ninguna evidencia de una interacción física directa entre las moléculas de RB1. Sin embargo, la propia naturaleza de su actividad permite la presencia de múltiples moléculas de RB1 en el mismo complejo en un momento dado. Por ejemplo, el atascamiento de hypophosphorylated RB1 al heterodímero E2F1-DP ofrece un sitio de unión adicional, que normalmente es ocupado por la histona deacetilasa (HDAC)18,19,20. Por otro lado, HDAC1 interactúa físicamente con RB1 y este complejo, a su vez, se une a la heterotrimer E2F1-DP-RB1, proporcionando así la represión de la transcripción adicional18. Según este enfoque, si al menos una de las moléculas de RB1 en el grupo es un mutante de DN, evitará el complejo reprimiendo la transcripción, mientras que reduce los niveles de RB1 endógenos, obteniendo así un fenotipo de RB1-null. Aquí, la inhibición endógena de RB1 observó 10 días después de la administración de Dox en agua potable. La dosis óptima para la inducción de Dox, sin embargo, deba ser determinado empíricamente para cada sistema. Por otra parte, puesto que la mayor parte de la secuencia del gene Rb1 fue utilizado en el maquillaje de la construcción, es posible que incluso en la ausencia de RB1 endógena, el mutante RB1 puede interactuar con y provocan la inhibición de la DN de cualquiera de los socios de unión de RB1. Esta premisa puede ser probada por evaluar el nivel de expresión de moléculas de unión a RB1 conocidas.
Inactivación de la proteína necesaria, finamente regulada temporal y reversible servirá de base para el desarrollo de una amplia variedad de estudios en un mayor número de campos de investigación para arrojar luz sobre los complejos mecanismos bioquímicos subyacentes a los diversos aspectos de gene y proteinactivity. Según el PDI, comprender su complejidad molecular es probable que mejorar la capacidad de los investigadores a diseñar nuevas estrategias terapéuticas. Transgenes mayor especificidad se logra por el ratón de DN a promotores específicos de tejido tTA o rtTA líneas de conducción de cría.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La pCS2 + CB-Myc6 vector fue un regalo de Marshall Horwitz (Universidad de Washington, Seattle, WA, USA). Las células de HEI-OC1 fueron amablemente proporcionadas por Fedrico Kalinec (escuela de medicina David Geffen, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Asistencia técnica fue proporcionada por la UNMC ratón genoma ingeniería base (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) y la Creighton University biomédica imagen instalación integrada (Richard Hallworth, John Billheimer). La UNMC ratón genoma Ingeniería fue apoyada por una concesión de desarrollo institucional (IDea) de los NIH/NIGMS, concesión número GM103471 P20. La instalación de imagen biomédica integrada fue apoyada por la Universidad de Creighton de la medicina y becas GM103427 y GM110768 de NIH/NIGMS. La instalación fue construida con el apoyo de becas del centro nacional para recursos de investigación (RR016469) y el NIGMS (GM103427). Las líneas de ratón generadas en este estudio fueron mantenidas en instalaciones de recursos Animal de la Universidad de Creighton, cuya infraestructura fue mejorada a través de una subvención por NIH/NCRR G20RR024001. Este trabajo recibida más allá del apoyo a través de un NIH/NCRR 5P20RR018788 - NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE conceder (a Shelley D. Smith), NIH/D.I.I.P R21OD019745-01A1 (s. S.) y una beca de investigación emergente de la Fundación de salud auditiva (para S. Tarang). El contenido de esta investigación es únicamente responsabilidad de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
