Inhibition de protéine inductible et réversible Dominant négatif (DN)
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à développer un système inductible dominant négatif, dans lequel toute protéine peut être inactivée conditionnellement par réversiblement surexprimant une version mutante dominant négatif de celui-ci.
Abstract
Inhibition de protéine dominant négatif (DN) est une méthode puissante pour manipuler la fonction des protéines et offre plusieurs avantages par rapport aux autres approches axées sur la génomique. Par exemple, bien que chimérique et Cre-LoxP stratégies de ciblage ont été largement utilisés, les limitations intrinsèques de ces stratégies (activité du promoteur qui fuit, expression de Cre de mosaïque, etc.) ont considérablement restreint leurs demande. En outre, un effacement complet de nombreux gènes endogènes est une létalité embryonnaire, rendant impossible d’étudier la fonction du gène dans la vie postnatale. Pour relever ces défis, nous avons apporté des changements importants à un protocole de génie génétique précoce et combiné (transgénique) version courte du gène Rb1 avec une protéase lysosomale B procathepsin (CB), générer un modèle de souris DN de Rb1 (CBRb). En raison de la présence d’une protéase lysosomale, la protéine de fusion CB-RB1 entière et son interaction complexe sont acheminés pour dégradation induite par le protéasome. En outre, la présence d’un élément inducteur (rtTA) de tétracycline dans la construction transgénique permet une régulation inductible et réversible de la protéine RB1. La présence d’un promoteur de ROSA-CAG omniprésent dans le modèle de souris CBRb rend un outil utile pour procéder à l’ablation de gène Rb1 transitoire et réversible et de fournir aux chercheurs une ressource pour comprendre son activité dans pratiquement n’importe quel type de cellules où la RB1 est exprimé.
Introduction
La plupart des approches visant à l’ablation des gènes et des protéines s’appuient sur des processus permanents, qui se traduisent généralement par l’élimination complète ou la troncation de la gène, de séquences d’ARN ou protéine d’intérêt (POI). L’objectif général de cette méthode est à l’ingénieur une protéine recombinante pour l’abolition de la fonction des protéines endogènes, sauvage. Nous avons revu et remanié une stratégie alternative1,2, qui permet l’ablation temporaire d’un POI par inhibition de la DN. Cette méthode fonctionne pour les multimères et peptides monomères mais est plus adaptée pour les protéines qui fonctionnent dans une assemblée de multimères.
La méthode consiste à fusionner la protéase lysosomale CB à une sous-unité d’un multimériques POI (complexe de fusion de CB). La résultante complexe de fusion CB peut interagir avec et clivage protéolytique digérer la protéine endogène ou détourner l’ensemble CB-POI pour le lysosome être dégradées3. En outre, une combinaison de la fusion de CB complexe avec le caractère inductible du système contrôlé par tétracycline l’activation transcriptionnelle (Fifi) permet une expression inductible et contrôlée du transgène dans un mode réversible2. Bien qu’utiles dans de nombreuses circonstances, la suppression complète des gènes ou des protéines in vivo peut entraîner la létalité4,5,6. De même, tissu-spécifique, conditionnelle délétion de certains gènes ou les protéines utilisant le système Cre-Lox ne peut pas être simple, comme elle, en fin de compte, entraînera la perte permanente des éléments critiques de génomique7. Par conséquent, selon le gène ou POI, aucune de ces approches seront efficaces en fournissant un modèle utile pour des études ultérieures, en particulier des gènes ou des protéines des études fonctionnelles chez les souris adultes et postnatals fin.
Pour contourner les problèmes liés à ces approches et fournir preuve de principe sur l’efficacité de la méthode proposée, nous avons choisi de tester la méthode présentée ici en générant une version DN conditionnelle de la protéine du rétinoblastome 1 (RB1). Plusieurs options ont été proposées8,9,10 à abolir la fonction de RB1 endogène ; Cependant, chacun d’eux fait face à certaines limitations mêmes discutées plus haut : suppression de cellules germinales permanente de RB1 est mortelle embryonnaire et, conforme à son rôle de suppresseur de tumeur, permanente RB1 suppression conditionnelle mène à une variété de tumeurs11. Même si une version DN de RB1 ne semble pas se produire naturellement, une meilleure alternative pour les stratégies actuellement disponibles devrait permettre une inactivation temporellement contrôlée de la RB1 endogène et prévoient un autre mécanisme pour finalement restaurer sa fonction. La base d’une telle construction a été décrite il y a plus de vingt ans1. Toutefois, en raison des limitations technologiques, il lui manquait un mécanisme d’activation de transgène de contrôle, d’intervention et spécificité tissulaire. Cette étude est le premier à combiner l’élégance de la doxycycline (Dox)-système transcriptionnelle dépendant par une ingénierie construction transgénique de protéines de CB et Rb1 protéases lysosomales. Le modèle de souris CBRb qui en résulte permet une RB1 temporairement réglementée de Dox-mediated règle2. L’avantage d’utiliser une approche axée sur le protéome pour étudier la fonction du gène est qu’il peut être adopté pour n’importe quel gène d’intérêt, avec un minimum d’informations sur son activité.
La stratégie proposée du transgène DN offre de nombreux avantages par rapport aux approches traditionnelles. Tout d’abord, l’inhibition de protéine DN mène à seulement une ablation partielle en activité de la protéine, préservant ainsi une expression endogène résiduelle. Un tel résultat est hautement souhaitable dans des situations où une élimination complète de l’activité de la protéine entraîne une létalité embryonnaire, limitant grandement toute enquête pour étudier la fonction des gènes dans une souris vivante. En second lieu, la présence du système TetO permet l’activation du transgène qu’en présence d’un antibiotique, ce qui permet un contrôle efficace et réversible de l’activité du transgène. Ainsi, en cessant l’administration d’antibiotiques, le système transgénique peut être désactivé, et une expression normale de la RB1 est remis en place. En troisième lieu, la spécificité de l’expression de transgènes peut varier selon le promoteur de choix. Alors que nous avons choisi le promoteur omniprésent de ROSA-CAG pour preuve de principe, plaçant le transgène sous un promoteur spécifique aux tissus est susceptible de restreindre l’expression transgénique non désirées et de faciliter les études sur l’application thérapeutique de ce transgène méthodologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afin de contourner les limitations associées à des stratégies traditionnelles de transgéniques, nous avons cherché à créer un modèle de souris dans lequel un POI endogène peut être inactivé conditionnellement en surexprimant une forme mutante de DN de celui-ci d’une manière spatio-temporelle. Pour l’abolition de la fonction de POI endogène, plusieurs options ont été proposées15,16,17. Nous avons modifié une …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le Bureau2 + CB-Myc6 vector est un cadeau de Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, é.-u.). Les cellules de HEI-OC1 ont été gracieusement fournis par Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, é.-u.). Support technique a été fourni par l’UNMC souris Genome Engineering Core (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) et la Creighton University intégré Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). Le génie du génome de souris UNMC a été soutenue par une bourse de développement institutionnel (IDea) de la NIH/NIGM, accorder le numéro P20 GM103471. La fonction intégrée Biomedical Imaging était soutenue par la Creighton University School of Medicine et subventions GM103427 et GM110768 de la NIH/NIGM. L’installation a été construite avec l’aide de subventions du National Center for Research Resources (RR016469) et la NIGM (GM103427). Les lignées de souris générées dans cette étude ont été maintenues à un centre de ressources de l’Université de Creighton Animal, dont l’infrastructure a été améliorée grâce à une subvention de NIH/RRRNC G20RR024001. Ce travail a reçu au-delà de prise en charge via un NIH/RRRNC 5P20RR018788-/ NIH/NIGM 8P20GM103471 COBRE accorder (à Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01 a 1 (s.-S.) et une subvention de recherche émergents de la fondation de santé auditive (à S. Normand). Le contenu de cette recherche est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
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