تنظيم مسار الإشارات الفطرية النقوي بنشاط باراكاسباسي MALT1
Summary
MALT1 ينظم الحصانة الفطرية ولكن كيف يحدث هذا وتظل غير محددة. كنا مثبط باراكاسباسي MALT1 انتقائية MLT-827 لكشف مساهمة MALT1 الفطرية مما يشير إلى المتلقين للمعلومات من مستقبلات يكتين مثل مثل عدد القتلى أو نوع ج، مما يدل على أن MALT1 وينظم إنتاج السيتوكينات النقوي، والمتلقين للمعلومات ج-نوع يكتين مثل مستقبلات، بشكل انتقائي.
Abstract
وإلى جانب وظيفته في الخلايا اللمفاوية، وقد عالج العديد من الدراسات، باراكاسباسي MALT1 أيضا دوراً هاما في الخلايا الفطرية المصب مستقبلات التعرف على نمط. أفضل درس من أعضاء الأسرة يكتين مثل مستقبلات ج من نوع ديكتين-1 وديكتين-2 التي تحفز SYK و CARD9-تعتمد على إشارات تتالي مما يؤدي إلى تنشيط NF-κB، بطريقة تعتمد على MALT1. على النقيض من ذلك، مثل عدد القتلى مستقبلات (TLR)، مثل TLR-4، نشر التنشيط NF-κB لكن الإشارات عبر تتالي MYD88/IRAK-تعتمد على. ومع ذلك، ظلت عما إذا كان MALT1 قد تسهم في TLR-4 إشارات غير واضحة. تشير الأدلة الأخيرة مع MLT-827، مثبط قوية والانتقائي للنشاط باراكاسباسي MALT1، إلى أن إنتاج تنف المصب TLR-4 في الخلايا البشرية النقوي مستقلة عن MALT1، بدلاً من إنتاج تنف المصب ديكتين-1، وهو MALT1 يعتمد. هنا، نحن معالجة انتقائية مشاركة MALT1 في التعرف على نمط الاستشعار كذلك، باستخدام مجموعة متنوعة من الإنسان والاستعدادات الخلوية الماوس، والحث على مسارات ديكتين-1، مينكلي أو TLR-4. كما قدمنا أفكاراً إضافية باستكشاف السيتوكينات بعدها تنف-، وعن طريق مقارنة MLT 827 مثبط SYK (Cpd11) ومثبط لايك (AFN700). جماعياً، البيانات المقدمة كذلك الأدلة على MALT1-تبعية مستقبلات يكتين مثل نوع ج – يشير في المقابل إلى إشارات TLR.
Introduction
نشاط باراكاسباسي MALT1 (المرتبطة بالغشاء المخاطي الأنسجة اللمفاوية سرطان الغدد الليمفاوية إزفاء بروتين 1) قد كشف في 20081،2. ومنذ ذلك الحين، سجلت عددا من الدراسات مساهمتها الحاسمة في مستضد مستقبلات الردود في الخلايا الليمفاوية. نماذج الوراثية في الماوس، فضلا عن دعم بيانات الصيدلة دوراً رئيسيا في خلايا تي تي خلية تعتمد المناعة الذاتية وفي ب-الخلية اللمفاوية إعدادات3،4. في الخلايا الليمفاوية، يحدث التنشيط باراكاسباسي MALT1 لدى الجمعية من CARD11-BCL10-MALT1 مجمع5، التي يتم تشغيلها بواسطة إشارات مستقبلات مستضد الدانية المتلقين للمعلومات من مستقبلات خلية تي أو ب. وهناك أيضا أدلة كثيرة على أن مجمع CARD9-BCL10-MALT1 مماثلة أمر مهم لنشر إشارات المصب ج-نوع يكتين مثل مستقبلات (لشانون)، مثل، ديكتين-1 وديكتين-2 مينكلي في النقوي الخلايا6،7. ديكتين-1 درست جيدا لأن هذا المسار أمر حاسم للمضيف الدفاع ضد الأمراض الفطرية8،9. بيد أن الآثار المترتبة MALT1 في الممرات الشبيهة بحصيلة مستقبلات (TLR)، ظلت مثيرة للجدل10. واستبعد الأدلة الأخيرة في الخلايا البشرية النقوي دوراً مباشرا للنشاط باراكاسباسي MALT1 في تنظيم الإنتاج تنف المصب TLR-411.
في هذا العمل، استخدمنا مختلف إعدادات التجريبية وظروف محفزة في الإنسان وخلايا النقوي الماوس لسبر مسارات الإشارات الفطرية، الاعتماد على مثبطات أداة معينة الدوائي وقياس إنتاج سيتوكين.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل، استخدمنا إعدادات تجريبي بسيط لدراسة مسارات إشارات في الإنسان والماوس الخلايا الفطرية، واستجواب الاعتماد على وظيفة بروتيوليتيك MALT1. التوسع في العمل السابق11، أظهرت الدراسة أن يتحكم MALT1 باراكاسباسي نشاط إنتاج سيتوكين مستقبلات يكتين مثل التي يسببها ج-نوع، بما في ذ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر السفير على تصريح (ترخيص رقم 4334770630127) استنساخ هنا الشكل 2 ألف من أونتيرينير et al. (2017).
Materials
| 100 µm nylon cell strainer | Sigma | CLS431752 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352057 | |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352090 | |
| 50 mL Falcon tube | Falcon | 352070 | |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid | Costar | 3595 | |
| 96 well V-bottom plate | Costar | 734-1798 | |
| Ammonium Chloride – NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Assay diluent RD1-W ELISA | R&D | 895038 | Assay diluent |
| Cell culture microplate, 384 well, black | Greiner | 781986 | |
| Depleted Zymosan | Invivogen | tlrl-dzn | now: tlrl-zyd |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO |
| EDTA-Na2 | Sigma | E5134 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate |
| ELISA muTNF-α | R&D | SMTA00 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| GM-CSF | Novartis | – | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | FBS |
| HTRF hu IL-23 | CisBio | 62HIL23PEG | |
| HTRF hu TNF-α | CisBio | 62TNFPEC | |
| HTRF reconstitution buffer | CisBio | 62RB3RDE | 50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA |
| IFN-γ | R&D | L4516 | |
| IL-4 | Novartis | – | |
| Isoflurane | Abbott | Forene | |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma | L4391 | LPS used in human samples |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516 | LPS used in murine samples |
| Lysis buffer | Self-made | – | 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Magnet | Stemcell | 18001 | |
| Microplate, 384 well white | Greiner | 784075 | |
| Monocytes enrichment kit | Stemcell | 19059 | |
| Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 °C Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | cooling device (containing Propanol-2) |
| PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 | Gibco | 10010 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Pen/Strep |
| Potassium bicarbonate – KHCO3 | Sigma | P9144 | |
| PrestoBlue | Invitrogen | A13262 | Resazurin solution for viability assessment |
| Propanol-2 | Merck | 1.09634 | |
| Read buffer | MesoScale Discovery | R92TC-3 | Tris-based buffer containing tripropylamine |
| Recovery cell culture freezing medium | Gibco | 12648-010 | freezing medium |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax | Gibco | 61870 | + 10% FBS for iMoDCs + 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes + 10% FBS + Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for murine splenocytes |
| Separation buffer | Self-made | – | PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Trehalose-6,6-dibehenate | Invivogen | tlrl-tdb | TDB |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | Polysorbate 20 |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15675 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Viewseal sealer | Greiner BioOne | 676070 | |
| V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit | MesoScale Discovery | K15049D | electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8) |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350 |
References
- Coornaert, B., et al. T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20. Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).
- Rebeaud, F., et al. The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).
- Jaworski, M., Thome, M. The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).
- Meininger, I., Krappmann, D. Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome. Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).
- Qiao, Q., et al. Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly. Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).
- Gross, O., et al. Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity. Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).
- Chiffoleau, E. C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets. Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Taylor, P. R., et al. Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection. Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).
- Lanternier, F., et al. Primary immunodeficiencies underlying fungal infections. Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).
- Thome, M. Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation. Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).
- Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-α production downstream of TLR-4 in myeloid cells. Immunology Letters. , 48-51 (2017).
- Strasser, D., et al. Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-δ to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity. Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).
- Jaworski, M., et al. Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity. The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).
- Yu, J. W., et al. MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses. PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).
- Bardet, M., et al. The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition. Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).
- Thoma, G., et al. Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).
- Bauer, B., Steinle, A. HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch. Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).
- Gringhuis, S. I., et al. Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2. PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).
- Dufner, A., Schamel, W. W. B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model. Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).
- Phelan, J. D., et al. A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma. Nature. , (2018).
