Mieloide innata Signaling Pathway regolamento da MALT1 Paracaspase attività
Summary
MALT1 regola dell’immunità innata, ma come in questo caso rimane mal definita. Abbiamo usato l’inibitore selettivo della paracaspase MALT1 MLT-827 per svelare il contributo di MALT1 alla innata di segnalazione a valle dei Toll-like o C-tipo il lectin-like receptors, dimostrando che MALT1 regola la produzione di citochine mieloide e a valle dei recettori di tipo C il lectin-like, in modo selettivo.
Abstract
Oltre alla sua funzione in cellule linfoidi, che è stato affrontato da numerosi studi, la paracaspase MALT1 svolge anche un ruolo importante in cellule innate a valle dei recettori di riconoscimento di pattern. Meglio studiati sono i membri Dectin-1 e Dectin-2 della famiglia C-tipo recettore lectin-like che inducono un dipendente SYK e CARD9 segnalazione cascata che portano all’attivazione di NF-κB, in un modo MALT1-dipendente. Per contrasto, recettori Toll-like (TLR), ad esempio TLR-4, propagano l’attivazione n-f-κB ma segnale attraverso una cascata di MYD88/IRAK-dipendente. Comunque, se MALT1 potrebbe contribuire alla segnalazione TLR-4 è rimasto poco chiaro. La prova recente con MLT-827, un inibitore potente e selettivo di MALT1 paracaspase attività, indica che il TNF-produzione a valle di TLR-4 in cellule mieloidi umane è indipendente di MALT1, in contrasto con la produzione di TNF a valle di Dectin-1, che è MALT1 dipendente. Qui, abbiamo affrontato la partecipazione selettiva di MALT1 nel riconoscimento di pattern sensing ulteriormente, utilizzando una varietà di umani e preparazioni cellulari del mouse e stimolazione delle vie Dectin-1, MINCLE o TLR-4. Abbiamo anche fornito ulteriori approfondimenti esplorando citochine di là di TNF- e confrontando MLT-827 di un inibitore SYK (Cpd11) e di un inibitore IKK (AFN700). Collettivamente, i dati forniti ulteriori prove per la MALT1-dipendenza di recettori di tipo C il lectin-like — al contrario di segnalazione per TLR-segnalazione.
Introduction
L’attività di paracaspase di MALT1 (tessuto linfoide Mucosa-collegato linfoma traslocazione della proteina 1) è stata rivelata nel 20081,2. Da allora, una serie di studi hanno riferito suo contributo critico alla risposte del ricevitore dell’antigene nei linfociti. Modelli genetici nel topo come pure farmacologia dati supportano un ruolo chiave in cellule di T, nell’autoimmunità dipendente di cellule T e nelle cellule B linfoma impostazioni3,4. Nei linfociti, MALT1 paracaspase l’attivazione si verifica al momento del montaggio di un CARD11-BCL10-MALT1 complesso5, che viene attivato da prossimale di segnalazione del ricevitore dell’antigene a valle del recettore della cellula T o B. Inoltre ci sono ampie prove che un simile complesso CARD9-BCL10-MALT1 è importante per la propagazione di segnali a valle dei recettori di tipo C il lectin-like (CLLR), ad esempio, Dectin-1, Dectin-2 e MINCLE in mieloide cellule6,7. Dectin-1 è stato studiato particolarmente bene perché questa via è fondamentale per la difesa dell’ospite contro le infezioni fungine8,9. Implicazione di MALT1 nelle vie di recettori Toll-like (TLR), tuttavia, è rimasto controverso10. La prova recente in cellule mieloidi umane escluso un ruolo diretto per MALT1 paracaspase attività nella regolazione del TNF-produzione a valle di TLR-411.
Nel presente lavoro, abbiamo usato varie impostazioni sperimentali e stimolatori condizioni in essere umano e cellule mieloidi del mouse per sondare le vie di segnalazione innate, basandosi su inibitori specifici strumento farmacologico e misurazione della produzione di citochine.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo lavoro, abbiamo usato semplici impostazioni sperimentali per studiare le vie di segnalazione in umani e cellule innate del mouse e interrogare la loro dipendenza sulla funzione proteolitica MALT1. Espansione sul precedente lavoro11, il nostro studio ha mostrato che MALT1 paracaspase attività controlla C-tipo recettore di lectin-like indotto produzione di citochine, tra cui TNF-α. Al contrario, TLR-4-induced TNF-α è stato indipendente di MALT1 in entrambe le specie. Collettivamente, q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Elsevier per la loro autorizzazione (numero di licenza 4334770630127) di riprodurre qui Figura 2A da Unterreiner et al. (2017).
Materials
| 100 µm nylon cell strainer | Sigma | CLS431752 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352057 | |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352090 | |
| 50 mL Falcon tube | Falcon | 352070 | |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid | Costar | 3595 | |
| 96 well V-bottom plate | Costar | 734-1798 | |
| Ammonium Chloride – NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Assay diluent RD1-W ELISA | R&D | 895038 | Assay diluent |
| Cell culture microplate, 384 well, black | Greiner | 781986 | |
| Depleted Zymosan | Invivogen | tlrl-dzn | now: tlrl-zyd |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO |
| EDTA-Na2 | Sigma | E5134 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate |
| ELISA muTNF-α | R&D | SMTA00 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| GM-CSF | Novartis | – | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | FBS |
| HTRF hu IL-23 | CisBio | 62HIL23PEG | |
| HTRF hu TNF-α | CisBio | 62TNFPEC | |
| HTRF reconstitution buffer | CisBio | 62RB3RDE | 50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA |
| IFN-γ | R&D | L4516 | |
| IL-4 | Novartis | – | |
| Isoflurane | Abbott | Forene | |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma | L4391 | LPS used in human samples |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516 | LPS used in murine samples |
| Lysis buffer | Self-made | – | 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Magnet | Stemcell | 18001 | |
| Microplate, 384 well white | Greiner | 784075 | |
| Monocytes enrichment kit | Stemcell | 19059 | |
| Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 °C Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | cooling device (containing Propanol-2) |
| PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 | Gibco | 10010 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Pen/Strep |
| Potassium bicarbonate – KHCO3 | Sigma | P9144 | |
| PrestoBlue | Invitrogen | A13262 | Resazurin solution for viability assessment |
| Propanol-2 | Merck | 1.09634 | |
| Read buffer | MesoScale Discovery | R92TC-3 | Tris-based buffer containing tripropylamine |
| Recovery cell culture freezing medium | Gibco | 12648-010 | freezing medium |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax | Gibco | 61870 | + 10% FBS for iMoDCs + 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes + 10% FBS + Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for murine splenocytes |
| Separation buffer | Self-made | – | PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Trehalose-6,6-dibehenate | Invivogen | tlrl-tdb | TDB |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | Polysorbate 20 |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15675 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Viewseal sealer | Greiner BioOne | 676070 | |
| V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit | MesoScale Discovery | K15049D | electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8) |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350 |
References
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